近接標識プロテオミクスを用いたニューロンリソソームインタラクトームの特性評価

サマリー

ここでは、ヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンにおける動的リソソーム微小環境を特徴付けるために、ニューロンリソソーム近接標識プロテオミクスプロトコルについて説明します。リソソーム膜タンパク質およびリソソームと相互作用するタンパク質(安定または一過性)は、生きたヒトニューロンにおいて優れた細胞内空間分解能でこの方法では正確に定量することができる。

要約

リソソームは、さまざまな生体分子と頻繁に通信して、分解やその他の多様な細胞機能を実現します。ニューロンは有糸分裂後であり、細胞の恒常性を維持するためにオートファジー-リソソーム経路に大きく依存しているため、リソソームは人間の脳機能にとって重要です。さまざまなリソソーム機能の理解が進んでいるにもかかわらず、リソソームと他の細胞成分との間の非常に動的なコミュニケーションをキャプチャすることは、特にハイスループットの方法で技術的に困難です。ここでは、最近発表されたヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)由来ニューロンにおける内因性(ノックイン)リソソーム近接標識プロテオミクス法の詳細なプロトコルを提供します。

ライソソーム膜タンパク質と半径10〜20 nm以内のリソソーム周囲のタンパク質の両方を、生きたヒトニューロンで確実に同定し、正確に定量することができます。プロトコルの各ステップ、すなわち、hiPSCニューロン培養、近接標識、ニューロン収穫、蛍光顕微鏡、ビオチン化タンパク質濃縮、タンパク質消化、LC-MS分析、およびデータ分析が詳細に説明されています。要約すると、このユニークな内因性リソソーム近接標識プロテオミクス法は、生きたヒトニューロンにおける非常に動的なリソソーム活性を研究するためのハイスループットで堅牢な分析ツールを提供します。

概要

リソソームは、リソソーム-オートファジー経路¹を介して高分子を分解する異化細胞小器官です。分解に加えて、リソソームはシグナル伝達、栄養感知、分泌などの多様な細胞機能に関与しています^2,3,4。リソソーム機能の摂動は、リソソーム蓄積障害、癌、老化、および神経変性に関与しています3,5,6,7。有糸分裂後および高度に分極したニューロンの場合、リソソームは、ニューロン細胞の恒常性、神経伝達物質の放出、および軸索に沿った長距離輸送において重要な役割を果たします⁸、^9、10、11。しかし、ヒトのニューロンのリソソームを調べることは困難な作業でした。人工多能性幹細胞(iPSC)由来のニューロン技術の最近の進歩により、以前はアクセスできなかった生きたヒトニューロンの培養が可能になり、動物モデルとヒト患者の間のギャップを埋めてヒト脳を研究するようになりました^12,13。特に、高度なi³Neuron技術は、ドキシサイクリン誘導性プロモーターの下で神経ゲニン-2転写因子をiPS細胞ゲノムに安定的に組み込み、iPS細胞を2週間で純粋な皮質ニューロンに分化させる^14,15。

非常に動的なリソソーム活性のため、他の細胞成分とのリソソーム相互作用を捕捉することは、特にハイスループット方式で技術的に困難です。近接標識技術は、並外れた空間特異性で安定したタンパク質相互作用と一過性/弱いタンパク質相互作用の両方を捕捉できるため、これらの動的相互作用の研究に適しています^16,17。操作されたペルオキシダーゼまたはビオチンリガーゼは、ベイトタンパク質に遺伝的に融合することができる。活性化されると、反応性の高いビオチンラジカルが生成され、隣接するタンパク質に共有結合で標識され、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)プラットフォームを介して下流のボトムアッププロテオミクス用のストレプトアビジンコーティングビーズによって濃縮されます¹⁷、¹⁸、¹⁹、^20、21。

内因性リソソーム近接標識プロテオミクス法は、i^3Neurons22の動的リソソーム微小環境を捕捉するために最近開発されました。操作されたアスコルビン酸ペルオキシダーゼ(APEX2)は、iPS細胞のリソソーム関連膜タンパク質1(LAMP1)のC末端にノックインされ、皮質ニューロンに分化することができます。LAMP1は、豊富なリソソーム膜タンパク質であり、古典的なリソソーム^{マーカー23}である。LAMP1は後期エンドソームでも発現し、リソソームに成熟します。これらの後期エンドソームリソソームおよび非分解性リソソームは、すべてこのプロトコルではリソソームと呼ばれる。この内因性LAMP1-APEXプローブは、生理学的レベルで発現し、LAMP1の誤局在および過剰発現アーティファクトを低減することができる。数百のリソソーム膜タンパク質とリソソーム相互作用物質を、生きたヒトニューロンにおいて優れた空間分解能で同定および定量することができます。

ここでは、ヒトiPS細胞由来ニューロンにおけるリソソーム近接標識プロテオミクスのための詳細なプロトコルを、最近公開された方法²²からのさらなる改良を加えて説明する。全体的なワークフローを 図 1 に示します。このプロトコルには、hiPSc由来のニューロン培養、ニューロンにおける近接標識活性化、蛍光顕微鏡によるAPEX活性の検証、最適なストレプトアビジンビーズとインプットタンパク質の比率の決定、ビオチン化タンパク質の濃縮、ビーズ上のタンパク質消化、ペプチドの脱塩と定量、LC-MS分析、およびプロテオミクスデータ分析が含まれます。トラブルシューティングのガイドラインと実験的な最適化についても説明し、近接ラベリングの品質管理とパフォーマンスを向上させます。

プロトコル

すべての手順は、ジョージワシントン大学のバイオセーフティおよび倫理委員会によって承認されました。このプロトコルで使用される媒体およびバッファーの組成を 表1に示します。ここで使用している商用製品情報は、 材料表に記載されています。

1. ヒトiPS細胞由来ニューロン培養

1. ヒトiPS細胞培養とLAMP1-APEXプローブ統合(7日間)
   1. マトリゲルストック溶液をアイスバケットで4°Cで一晩解凍し、500 μLの溶液を冷たい滅菌チューブに分注し、アリコートを-80°Cで保存します。 500 μLのマトリゲルストックを49.5 mLの冷たいDMEM/F12培地に加え、50 mLのコーティング溶液を調製します。
      注意: マトリゲルを冷たく保ち、重合を防ぐために予冷した円錐形のチューブとピペットチップを使用してください。コーティング溶液は4°Cで2週間保存できます。
   2. 10 cmの細胞培養皿に4 mLのコーティング溶液を37°Cのインキュベーターで1時間コーティングします。
      注:ビトロネクチンは、iPS細胞培養用の5 μg/mL濃度および2時間のコーティングの代替コーティング溶液です。ビトロネクチン(単一タンパク質成分)はマトリゲルよりも高価ですが、多数の細胞外マトリックスタンパク質を持つマウス腫瘍から抽出されるマトリゲルよりもバッチの変動が少なく、バックグラウンドシグナルがクリーンです。ビトロネクチンコーティングには未処理の組織培養プレートが必要です。マトリゲルコーティングは、処理された組織培養プレートと未処理の組織培養プレートの両方で機能します。
   3. ROCK阻害剤を添加した8 mLのエッセンシャルE8完全培地(最終濃度10 μM Y-27632または50 nM Chroman1)をプリロードした各コーティングされた10 cmディッシュに1〜300万個のhiPS細胞を解凍してプレートします。
      注:ROCK阻害剤(Y-27632またはChroman1)を幹細胞培養培地に添加すると、分裂および極低温保存後の解離誘発性アポトーシスが最小限に抑えられます。Chroman1は最近、Y-27632よりもROCK1とROCK2の両方を阻害する強力であることが示されています²⁴。
   4. iPS細胞がコロニーを形成した後、通常は1〜2日後に、ROCK阻害剤を含まない10mLのE8完全培地に変更します。iPS細胞培養液をE8完全培地に維持し、上清を1日おきに新鮮な培地に交換します。
   5. 近接標識酵素である操作されたアスコルビン酸ペルオキシダーゼ(APEX2)を、CRISPRゲノムエンジニアリングによって内因性 LAMP1 遺伝子のC末端に組み込みます。操作された安定細胞株を生成するための詳細な手順については、以前に公開された方法(Frankenfieldら)を参照してください。²².
2. ヒトiPS細胞-ニューロン分化(3日間)
   1. 分化前に10 cmの細胞培養皿に4 mLのマトリゲルコーティング溶液4 mLを37°Cのインキュベーターで一晩コーティングします。
   2. ~70%のコンフルエントになるまでhiPS細胞を維持します。hiPS細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回穏やかに洗浄し、死細胞を除去します。PBSを吸引し、10 cmの細胞皿に3 mLのアキュターゼを加えます。プレートを振って均一に分配し、37°Cのインキュベーターで8分間インキュベートします。
   3. 2 mLのPBSを加えて細胞を洗浄し、プレートから持ち上げ、15 mLのコニカルチューブにすべての細胞溶液を回収します。300 × g で5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。プレート2-4×10^個の6 hiPS細胞を、8 mLの温かいニューロン誘導培地をプリロードしたマトリゲルコーティングプレート上に配置します(表1)。細胞を均等に分配し、37°Cのインキュベーターに入れます。
      注:ニューロンの分化は、この安定したhiPS細胞株¹⁵で過剰発現したドキシサイクリン誘導性転写因子であるニューロゲニン-2(NGN2)によって駆動されます。
   4. 分化1日目にhiPS細胞をPBSでやさしく洗浄し、死細胞の破片を取り除きます。ROCK阻害剤を含まない10mLの温かい誘導培地と交換してください。
   5. 分化3日目まで毎日ROCK阻害剤を含まない温かい誘導培地で交換する。
      注:ニューロンは、ニューロン媒体に再メッキする準備ができています。
3. ニューロンのプレーティングとニューロン培養の維持(10日間)
   1. ホウ酸塩バッファー中で0.1 mg/mLのポリ-L-オルニチン(PLO)コーティング溶液を調製します(表1)。
   2. 細胞培養皿にPLOコーティング溶液を37°Cのインキュベーター内で少なくとも1時間または一晩コーティングし、3日目のニューロンをプレーティングする前に一晩コーティングします。皿を4mLの滅菌水で3回洗浄し、バイオセーフティキャビネット内で完全に風乾させます。
   3. 3 mLのアキュターゼと8〜1,000万個の細胞を各10 cmのPLOコーティング皿から3日目のニューロンを解離し、温かい皮質ニューロン培地をプリロードした各10 cmPLOコーティング皿にプレートします(表1)。
   4. i 3ニューロンが分化後2週間で成熟に達するまで、温かいニューロン培地で2〜³日ごとに半培地交換を行います。

2. in situ 近接標識とニューロン溶解(2時間)

1. ジメチルスルホキシド(DMSO)中の500 mMビオチン-フェノール(BP)ストック溶液を調製し、-20°Cで保存します。 近接標識の日に、BPストック溶液を温かいニューロン培地で希釈し、37°Cのインキュベーター内で30分間、終濃度500 μMのニューロンを処理します。
   注:ドキシサイクリンがニューロン培地に添加され、APEX酵素発現が活性化されます。ドクスサイクリンは、近接標識実験の少なくとも24時間前に追加する必要があります。.
2. H 2 O₂を終濃度1 mMでニューロン培養物に添加して標識反応を開始し、正確に1分間インキュベートします。直ちに培地を吸引し、クエンチバッファーで3回すすぐ(表1)。
   注:H2 O₂溶液は、標識反応の前に新鮮にする必要があります。H2O2の活性化は、実験の変動を減少させ、長期の_H2O2処理によって引き起こされる酸化ストレスを最小化するために、正確に1分である必要がある。
3. プレートを傾けて、すべての残留バッファーを吸引します。氷冷した細胞溶解バッファー(表1)をニューロンプレートに直接加えます。100万ニューロンあたり100 μLの細胞溶解バッファーを使用してください。十分な細胞溶解のためにプレートを旋回させ、氷の上に置きます。
4. 細胞ライセートを冷たい1.5 mLチューブにこすり落とします。バス超音波処理器(>100 W)を使用して氷冷水浴中で15分間、交互に40秒オン、20秒オフサイクルで超音波処理します。
   注:十分に溶解したタンパク質溶液は、ペレットや過度の気泡がなく透明でなければなりません。細胞ライセートの十分な超音波処理は、核酸を剪断し、細胞ライセートの粘着性を低減して、下流の手順での非特異的結合を減少させるために重要です。プローブ超音波処理器を使用して、より強力で高速な細胞溶解を提供することもできますが、クロスコンタミネーションとサンプル損失を最小限に抑えるには、サンプル間でプローブを洗浄する必要があります。
5. 冷アセトン(−20°C)を4倍容量の溶解バッファーでサンプルに加えます。短時間ボルテックスし、-20°Cで3時間インキュベートします。
6. 16,500 × g で2°Cで10分間遠心分離します。 タンパク質ペレットを乱すことなく上清を除去する。ペレットを1 mLの-20°Cアセトン2xで洗浄し、遠心分離後に上清を除去します。
7. タンパク質ペレットを真空濃縮器で1分間乾燥させます。細胞溶解バッファーを添加してペレットを完全に溶解します。必要に応じて簡単に超音波処理します。サンプルは-80°Cで保存してください。
   注:アセトン沈殿は、サンプル中の残留ビオチン-フェノールを除去する可能性があり、ビオチン化タンパク質の下流濃縮を妨げる可能性があります。

3. APEXの局在と活性を検証するための蛍光顕微鏡(1.5日)

1. 内因性LAMP1-APEXを発現するi³ニューロンを500 μM BPで37°Cで30分間インキュベートします。 1 mM H 2 O₂処理でわずか1秒間標識を活性化し、ビオチン雲の拡散を制限します。
2. クエンチバッファー中の4%パラホルムアルデヒドで細胞を直ちに固定し、PBSで3回穏やかに洗浄します。
   注意: 10 cmの皿の場合、十分な洗浄には4〜6 mLが必要です。
3. PBS中の3%ロバ血清と0.1%サポニンを使用して、室温(RT)で30分間細胞をブロックして透過処理します。
4. 細胞を一次抗LAMP1抗体(マウスモノクローナルH3A4、1:1,000)で4°Cで一晩インキュベートします。
5. PBSでニューロンを3回穏やかに洗います。抗マウスAF561二次抗体(1:1,000)およびストレプトアビジン-680(1:1,000)でニューロンをRTで1時間インキュベートします。
6. PBSで2回洗浄し、ヘキストまたは4',4-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)核マーカーとRTで10分間インキュベートします。 細胞をPBSで2回すすぎます。
7. 固定されたニューロンを蛍光顕微鏡で可視化します。ストレプトアビジンで染色され、核外でLAMP1染色で共局在したビオチン化タンパク質を観察して、APEX活性の正しい位置を検証します。

4.ストレプトアビジンビーズとインプットタンパク質の比率の決定(1.5日)

1. 界面活性剤適合性タンパク質アッセイ(DCA)を実行して、細胞ライセート中の総タンパク質濃度を測定
   1. ウシ血清アルブミン(BSA)タンパク質標準物質を細胞溶解バッファーに4 mg/mLの濃度で溶解します。細胞溶解バッファーを使用して、一連のBSAタンパク質標準溶液(0.2-2 mg/mL、5希釈液)を調製します。
   2. 各タンパク質サンプル、BSAタンパク質標準溶液、およびブランク細胞溶解バッファーから5 μLを3連で96ウェルプレートの各ウェルに移します。
   3. 試薬A1 mLあたり2 μLの試薬Sを加えて、試薬A'を得ます。25 μLの試薬A'を各ウェルに加えます。200 μLの試薬Bを各ウェルに加えます。泡がある場合は混ぜてポップします。
   4. その96ウェルプレートをRTで15分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーで750 nmの吸光度を読み取り、BSA標準曲線に基づいてタンパク質サンプルの濃度を定量します。
2. ビーズ滴定ドットブロットアッセイ(1.5日)
   1. 一連のストレプトアビジン磁気ビーズスラリー(20 μL、15 μL、12 μL、10 μL、8 μL、4 μL、1 μL、0 μL)をPCRストリップチューブに移します。PCRストリップチューブを磁気ラックに置き、ビーズを100 μLの2%SDSバッファーで3回洗浄し、磁気ラックで洗浄バッファーを完全に取り外します。
   2. 各チューブに50 μgのタンパク質サンプルを追加します。溶解バッファーを追加して総容量 80 μL にします。 各チューブをしっかりと閉じ、4°Cで一晩回転させます。
   3. PCRストリップチューブをベンチトップマイクロ遠心分離機で短時間遠心分離します。PCRストリップチューブを磁気ラックに1分間置きます。各チューブの上清2 μLを乾燥したニトロセルロースメンブレンにスポットし、メンブレンを完全に乾燥させます。
      注:信号強度が低い場合は、2 μL以上がメンブレン上にスポットされる可能性があります。体積は、膜を毎回風乾した後、同じ場所に数回点光することによって増加させることができる。バイオドット装置も使用できます。
   4. メンブレンをブロッキングバッファー(TBS)中で1時間インキュベートします。メンブレンをストレプトアビジンAlexa Fluor 680コンジュゲート(ブロッキングバッファー中で1:1,000)で1時間インキュベートします。その後、膜をTBS-T(表1)5倍で洗浄した。
      注:ドットブロットアッセイの代替法は、ストレプトアビジン抗体を用いたウェスタンブロッティングです。
   5. 波長680 nmのメンブレン上の各ドットの蛍光シグナルを測定し、ビーズの体積にわたって蛍光シグナルを含む散布図を生成します。50 μgの入力タンパク質サンプルに必要なビーズの最適量を、曲線の指数関数的減衰がどこで終わるかに基づいて選択します。
      注:蛍光強度は、上清中のビオチン化タンパク質の存在量を表し、ビーズの量が増えるにつれて減少するはずです。

5.ビオチン化タンパク質の濃縮とビーズ上の消化(3日間)

1. タンパク質溶解物サンプルを-80°Cから移し、バス超音波処理器で30秒間1.5mLチューブでサンプルを超音波処理し、溶液を素早く解凍します。渦巻き、サンプルチューブを氷の上に置きます。
2. 250 μLのストレプトアビジン(SA)磁気ビーズスラリーを各1.5 mLチューブに移します。チューブを磁気ラックに置き、1 mLの洗浄バッファーA(2% SDS)でビーズを3回洗浄し、残留バッファーを除去します。
3. ドットブロットアッセイとDCタンパク質アッセイの結果に基づいて、250 μLのストレプトアビジン磁気ビーズスラリーに必要なタンパク質サンプルの量(μg)を計算します。
   注:この内因的に発現するLAMP1-APEXプローブでは、50 μgの入力タンパク質に対して5 μLのビーズが必要です。したがって、2.5 mgの総タンパク質が250 μLのビーズに添加されます。250 μL未満のSAビーズは、限られた投入サンプル材料に使用できます。
4. 磁気ビーズ-ライセート混合物を含むチューブに細胞溶解バッファーを全容量1 mLまで加え、4°Cで一晩回転させます。
   注:異なるグループまたは反復からのサンプルは、実験の変動を減らすために、同じタンパク質濃度、体積、およびビーズの量に正規化する必要があります。
5. ベンチトップのマイクロ遠心分離機ですべてのチューブを短時間回転させ、チューブを磁気ラックに1分間置きます。磁気ラックの上にいる間に上澄み液を取り除きます。
   注意: 毎回、サンプルチューブを磁気ラックに置いた後、1分間待つことが重要です。これにより、目に見えない少量のビーズがまだ溶液中の磁石に向かって移動することによるビーズ損失を最小限に抑えることができます。
6. ビーズを1 mLの洗浄バッファーAでRTで2回洗浄します(毎回5分間回転)。各洗浄バッファーを用いて4°Cで順次2回このプロセスを繰り返します。 (バッファB、バッファC、およびバッファD; 表 1)。
   注意: 高濃度のSDS溶液は、低温で沈殿する可能性があります。最初の洗浄はRTで実行する必要があります。
7. チューブを磁気ラックに置きます。ビーズをバッファーDで2回洗浄して、残留洗剤を完全に取り除きます。ビーズを100 μLの50 mM Trisバッファーに再懸濁し、5 mM TCEP(最終濃度)を加えて、温度制御ミキサーで37°C、1,200 rpmで振とうしながら30分間インキュベートします。
8. 各チューブに15 mMヨードアセトアミド(IAA、最終濃度)を加え、温度制御ミキサーで37°Cで30分間インキュベートし、暗所で1,200 rpmで振とうします(ミキサーキャップをオンにします)。
   注意: IAAは光に敏感であり、この手順の5分前に新鮮にする必要があります。
9. 5 mM TCEP(最終濃度)を添加して、過剰なIAAを消光します。温度制御されたミキサーで37°Cで10分間インキュベートし、1,200 rpmで振とうします(ミキサーキャップを外します)。
10. サンプルチューブを短時間遠心分離し、磁気ラックに1分間置き、上清を除去します。50 mM Trisバッファーに200 μLの5 mM TCEPを加え、ビーズを再懸濁します。1 μgのトリプシン/Lys-Cミックスをサンプルに加え、温度制御されたミキサーで37°Cで1,200 rpmで振とうしながら14時間インキュベートします。
11. さらに0.2 μgのトリプシン/Lys-Cミックスを加え、3時間消化します。
12. サンプルチューブを短時間回転させ、チューブを磁気ラックに1分間置きます。ペプチド上清を移して、磁気ラック上でチューブを洗浄します。ビーズを50 μLの50 mM Trisバッファー(5分間振とう)で洗浄し、ペプチド上清を混ぜ合わせます。
13. ペプチド上清を含むチューブに30 μLの10%トリフルオロ酢酸(TFA)を加えて、pH <3を取得します。

6. ペプチド脱塩および分画(2時間)

1. 逆相固相抽出プレート(使用するウェルのみ)を200 μLのHPLCグレードメタノール(MeOH)で3倍に溶かします。HPLCグレードの水に200 μLの1%TFAを3回添加して、プレートを平衡化します。
2. ペプチドサンプルをプレートにロードし、3液滴/秒未満の流速でゆっくりと真空をオンにして、サンプルの損失を最小限に抑えます。
3. 抽出プレートを200 μLの1%TFAで3回洗浄します。抽出プレートを、2%MeOH(v/v)を含む1%TFA200 μLで再度洗浄します。流速を3液滴/秒未満に保ちます。
4. 収集プレートを96ウェル収集プレートと交換します。分画が不要な場合は、80%のMeOHを含む1%TFAの100 μLでペプチドサンプルを3回溶出し、新しいサンプルチューブで結合します。ペプチドサンプルを真空濃縮器で熱なしで乾燥させます。
   注:分画が必要な場合は、ペプチドサンプルを4つの画分に溶出し、その後、異なる収集プレートでそれぞれ15%、35%、50%、および90%のMeOHを含む1%TFAの200 μLを使用します。

7.比色ペプチド定量アッセイ(オプション)(1時間)

1. ペプチドサンプルを50 μLのLC-MSグレードの水に再懸濁し、20 μLのアリコートを取り、ペプチドアッセイを実行します。
   注:このステップは大量のペプチドサンプルを消費しますが、LC-MS分析の前にペプチド濃度を正確に定量することができます。これは通常、大規模なサンプル調製の前にテストするために、サンプルタイプごとに1回だけ実施されます。
2. ペプチド標準溶液(比色アッセイキットに付属)の連続希釈液をLC-MSグレードの水で調製します。50%試薬A、48%試薬B、および2%試薬Cを混合して、作業試薬を準備します。
3. 各ペプチド標準液(3回反復)と未知のペプチドサンプル20 μLを96ウェルマイクロプレートに移します。180 μLの作業試薬を各ウェルに加え、よく混合し、プレートをRTで30分間インキュベートします。
4. マイクロプレートリーダーで480 nmの吸光度を読み取り、ペプチド標準曲線に基づいてペプチドサンプルの濃度を定量します。

8. LC-MS分析

1. ペプチドサンプルをLCバッファーA(2%アセトニトリルおよび0.1%ギ酸、LC-MSグレード)に再懸濁します。16,500 × g で4°Cで10分間遠心分離し、粒子を取り除きます。
2. 上清をLC-MSバイアルに移します。ナノLC-MS装置を使用してサンプルを分析します。
   注:詳細なLC-MS/MSパラメータは機器に依存し、以前に説明されています^22、25、26。
3. ストレプトアビジンやトリプシンなどの非常に豊富な夾雑ペプチドピークの保持時間の範囲を含むカスタムLC-MS除外リストを5 ppmの質量精度で生成します22(たとえば、一般的なストレプトアビジンペプチドピークはm/z 402.5435 [電荷3]、m/z 603.3117 [電荷2]、m/z 654.9733 [電荷3]、m/z 678.6812 [電荷3]、 m/z 1017.5182 [電荷2]、 等。;一般的なトリプシンペプチドピークは、m/z 421.7584 [電荷2]、m/z 523.2855 [電荷2]、およびm/z 737.7062 [電荷3])です。

9. プロテオミクスデータ解析

1. プロテオームディスカバラー、MaxQuant²⁷、MS-Fragger²⁸などのプロテオミクスデータ解析ソフトウェアを使用して、LC-MS生データを解析します。データ分析用に2つのFASTAライブラリを含める:1)スイスプロ トホモサピエンス 参照データベース。2)新たに生成されたユニバーサル汚染物質FASTAライブラリ(https://github.com/HaoGroup-ProtContLib)は、プロテオミクスの同定を改善し、誤った発見を減らすことが証明されました²⁹。
2. タンパク質およびペプチドスペクトルマッチング(PSM)同定のための1%偽発見率(FDR)カットオフでプロテオミクスデータ解析パラメータを設定します。最大3回の切断漏れ、システインカルバミドメチル化の固定修飾、およびメチオニン酸化とタンパク質N末端アセチル化の可変修飾を伴うトリプシン消化を選択します。ペプチドMS1ピーク強度を使用して、ラベルフリー定量を行います。ペプチド強度を内因的にビオチン化カルボキシラーゼ、プロピオニル−CoAカルボキシラーゼ(PCCA)に正規化して、近接標識変動を減少させることは、前述の^ように22。
   注:PCCA正規化は、PCCAタンパク質配列FASTAファイルを含めることにより、プロテオームディスカバラーソフトウェアで選択できます。あるいは、PCCA正規化は、ダウンストリームデータ分析で実施することができる。
3. プロテオミクスソフトウェアからタンパク質レベルの結果をエクスポートします。統計分析の前に汚染物質タンパク質を除去し^{ます 29}.PSMが1つしかない、または定量結果が得られないタンパク質を除去します。Enrichr³⁰ を使用してタンパク質遺伝子オントロジー (GO) ターム解析を実行し、STRING³¹ を使用してタンパク質ネットワーク解析を行います。

結果

このリソソーム近接標識プロテオミクス研究は、ヒトiPS細胞由来のニューロンで実施され、生きたニューロンの動的なリソソーム微小環境 をin situ でキャプチャしました。異なる時点におけるhiPS細胞およびhiPSC由来ニューロンの細胞形態を 図2Aに示す。ヒトiPS細胞はE8培地中のコロニーで増殖する。分化は、iPS細胞をドキシサイクリン含有ニューロン誘導培地にプレーティングすることによって開始されます。神経突起の伸長は、3日間の分化中に毎日より目に見えるようになります。ニューロン媒体中でPLOコーティングプレートに切り替えた後、神経突起はニューロン間にネットワークを形成し、ニューロンが2週間で成熟するにつれて軸索伸長がより目に見えるようになります。i³ニューロンでは、APEXプローブの局在は、急速なAPEX活性化後の蛍光顕微鏡によって検証されます。ビオチン化タンパク質はストレプトアビジン(SA)抗体を用いて染色され、リソソームは抗LAMP1抗体を用いて染色される。マージされた画像は、ベイトタンパク質へのLAMP1-APEXの正しい局在...

ディスカッション

このLAMP1-APEXプローブを使用して、リソソーム膜上および近傍のタンパク質をビオチン化し、濃縮します。典型的なリソソーム直径が100〜1,200 nmの場合、この方法は10〜20 nmの標識半径で優れた細胞内分解能を提供します。LAMP1は豊富なリソソーム膜タンパク質であり、ライソソームの古典的マーカーであり、内因性発現レベルでのリソソームAPEX標識のための優れたベイトタンパク質として機能します。しかしながら、LAMP1は後期エンドソームおよび非分解性リソソームにも存在するため、リソソームを標的とするためにLAMP1を使用する場合にも制限が存在する³⁵。ほとんどのリソソームマーカーは後期エンドソームでも発現し、最終的にはリソソームに成熟します。リソソームを標的とする代替餌タンパク質は、LAMPTOR、LAMP2、およびTMEM192^35,36,37である。反応性ビオチンラジカルは膜を貫通しないこと...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10% (w/v) サポニン溶液	Acros Organics 419231000		蛍光顕微鏡
Accutase	Life Technologies	A1110501	細胞剥離液, 細胞培養
B27 サプリメント	フィッシャーサイエンティフィック	17504044	細胞培養, 皮質ニューロン培地
BDNF	PeproTech	450-02	細胞培養, 皮質ニューロン培地
ホウ酸	Sigma-Aldrich	B6768	細胞培養、ホウ酸緩衝液
ウシ血清アルブミン	ミリポアシグマ	A8806	総タンパク質濃度を測定するための標準溶液を作るには
脳物理学 ニューロン培地	STEMCELL Technologies	5790	細胞培養、皮質ニューロン培地
CD45R (B220) 抗体 アレクサフルオロ 561	サーモフィッシャーサイエンティフィック	505-0452-82	蛍光顕微鏡
Chroman1 ROCK inhibitor	Tocris	716310	Cell Culture
cOmplete mini Protease Inhibitor	Roche	4693123001	cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit II	Bio-Rad	5000112	の総タンパク質濃度を測定するには
	Sigma-Aldrich	D8418	近接標識反応
DMEM/F12培地	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11320082	細胞培養、ディッシュコーティング
HEPESによるDMEM/F12培地	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11330057	細胞培養、誘導培地
ロバ血清	シグマ・アルドリッチ	D9663	蛍光顕微鏡
ドキシサイクリンヒクレート、≥98% (HPLC)	Sigma-Aldrich	D9891-1G	細胞培養、誘導培地
エッセンシャル 8 培地	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A1517001	細胞培養
エッセンシャル 8 サプリメント (50x)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A1517101	細胞培養
抽出プレート真空マニホールドキット	ウォーターズ	WAT097944	ペプチド脱塩
酸 (FA)	用フィッシャーサイエンティフィック	A11750LC-MS	分析用
GDNF	PeproTech	450-10	細胞培養、皮質ニューロン培地
ヘキスト染料	サーモフィッシャーサイエンティフィック	62239	蛍光顕微鏡
HPLCグレードメタノール	フィッシャーサイエンティフィ	A452	脱塩
HPLCグレード水	フィッシャーサイエンティフィック	W5	ペプチド用。脱塩
ヒト誘導多能性幹細胞	Corriell Institute	GM25256	Cell Culture
過酸化水素、ACS、29-32% w/w aq. soln., stab.	サーモフィッシャーサイエンティフィ		AA33323AD 近接標識反応
ヨードアセトアミド(IAA)	ミリポアシグマ	I6125	タンパク質消化用
ラミニン	フィッシャーサイエンティフィック	23017015	細胞培養、皮質ニューロン培地
LC-MSグレード アセトニトリル	フィッシャーサイエンティフィック	A955	LC-MS分析用
LC-MSグレードの水	フィッシャーサイエンティフィック	W64	LC-MS分析用
L-グルタミン	フィッシャーサイエンティフィック	25-030-081	細胞培養、誘導培地
マトリゲル	サーモフィッシャーサイエンティフィック	08-774-552	基底膜マトリックス、細胞培養、ディッシュコーティング
マウス抗ヒトLAMP1モノクローナル抗体	開発研究 ハイブリドーマバンク	h4a3	蛍光顕微鏡
N-2 サプリメント (100x)	Fisher Scientific	17-502-048	細胞培養、誘導培地
ニトロセルロースメンブレン、プレカット、0.45 µm, 7 x 8.5 cm	Bio-Rad	1620145	ビーズ滴定のためのドットブロットアッセイの実施
非必須アミノ酸 (NEAA)	Fisher Scientific	11-140-050	Cell Culture, Induction Medium
NT-3	PeproTech	450-03	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well 固相抽出プレート	Waters	186000309	ペプチド脱塩用
Odyssey Blocking Buffer (TBS)	LI-COR Biosciences	927-50000	ビーズ滴定のためのドットブロットアッセイの実施
パラホルムアルデヒド	電子顕微鏡 Sciences	15710	蛍光顕微鏡
フェノールビオチン (1,000倍ストック)	Adipogen	41994-02-9	近接標識反応
カルシウムまたはマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	Gibco	10010049	細胞培養、近接標識反応、蛍光顕微鏡法
Pierce 定量的比色ペプチドアッセイ	Thermo Fisher	23275	ペプチド濃度アッセイ
ポリ-L-オルニチン(PLO)	ミリポア Sigma	P3655	細胞培養、ディッシュコーティング
アスコルビン酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	A4034	近接標識 クエンチバッファー、溶解バッファー
ナトリウムアジド	Sigma-Aldrich	S8032	近接標識 Quench Buffer, Lysis Buffer, 蛍光顕微鏡
塩化ナトリウム Thermo	Fisher Scientific	S271500	Cell Culture, Horate Buffer
Dodecyl Sufate (SDS)	Thermo Fisher Scientific	BP1311220	Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
	Sigma-Aldrich	415413	細胞培養、ホウ酸緩衝液
四ホウ酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	221732	細胞培養、ホウ酸緩衝液
SpeedVac 濃縮器			真空濃縮器
ストレプトアビジン 磁気セファロースビーズ	Cytiva (正式 GE)	28-9857-99	ビオチン化タンパク質の濃縮
ストレプトアビジン、Alexa Fluor 680 コンジュゲート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	S32358	ビーズ滴定用のドットブロットアッセイを実施するには
サーモミキサー			温度制御ミキサー
トリフルオ酢酸(TFA)	ミリポアシグマ	302031	ペプチド脱塩用
トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)	ミリポアシグマ	C4706	タンパク質消化用
トリス-HCl	サーモフィッシャーサイエンティフィック	BP152500	Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-X	Thermo Fisher Scientific	BP151500	Beads wash buffer
TROLOX	Sigma-Aldrich	648471	Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade	Promega	V5073	For Protein Digestion
TWEEN 20	ミリポア Sigma	P1379	ドットブロットアッセイバッファー
尿素	サーモフィッシャーサイエンティフィック	BP169500	ビーズ洗浄液およびオンビーズ消化バッファー
ビトロネクチン	STEMCELL Technologies	7180	細胞培養、ディッシュコーティング
Y-27632 ROCK阻害剤	Selleck	S1049	細胞培養