ミツバチ組織における組織学の基礎と細胞死検出

サマリー

免疫組織化学的方法は、成虫のミツバチの中腸および下咽頭腺におけるアポトーシスおよび壊死のレベルを検出および評価するためのミツバチの研究において有用である。

要約

ミツバチ(Apis mellifera L.)ハイブ内(ナースワーカーや他のハイブミツバチ)とハイブ外(採餌者)は、気候や天候の変化、さまざまな農薬、病原体、栄養失調にさらされ、主に口から侵入し、主に成虫の消化管に影響を与えます。このような外部および内部のストレッサーがミツバチに及ぼす影響を理解し、予防するために、有用な研究方法の1つが免疫組織化学的方法です。組織学的分析のために成体ミツバチの中腸(心室)および下咽頭腺(HPG)を準備するための基本的なプロトコルが説明されています。細胞損傷のレベルを評価し、組織再生の自然なプロセスとして壊死とプログラム細胞死(アポトーシス)を区別するための詳細な方法論が説明されています。シュウ酸と農薬(殺虫剤と殺ダニ剤)による成虫ミツバチの治療結果と、心室とHPGの細胞死の測定が提示されています。方法論の長所と短所についても説明します。

概要

ミツバチ(Apis mellifera L.)は、他の野生の花粉媒介者の中でも、農業用植物の最も重要な花粉媒介者です。何千年もの間、変化する環境は、ミツバチが形態、生理学、行動、およびいくつかの病原体や寄生虫に対する耐性を適応させるように影響を与えてきました。したがって、ミツバチは世界中で非常に多様な種と亜種を開発しました¹。これらの結果は、ミツバチの消化管構造に遺伝的変異があるという以前の発見と一致していますが、中腸の変化は環境要因によるものであることも示唆しています^2,3。

ミツバチの消化管には、前腸、中腸(心室)、後腸⁴の3つの主要部分があります。心室は花粉と蜜/蜂蜜の消化に不可欠な器官です。後腸では、浸透圧制御は水とイオンの吸収によって行われます²。ミツバチ労働者の下咽頭腺(HPG)は頭にあり、ローヤルゼリー成分を合成して分泌し、ひな、女王、およびコロニーのメンバーに餌を与えます。それらのサイズは年齢や課題によって変化し、適切な栄養(高品質の花粉)に依存します。6〜18日齢の看護師がひなの飼育を行い、HPGのサイズは^5,6<....

プロトコル

1. ミツバチ研究のための基礎組織学

1. ミツバチ組織の解剖
   注意: 働きバチの解剖には、LED光源を備えた解剖顕微鏡を使用してください。最も有用な倍率は~20倍です。
   1. 操作と解剖
      1. 働きバチを鉗子で慎重に取り、氷の上(または-20°Cの冷凍庫)に2分間入れて固定します²²。ペトリ皿に蜂を胸部の背中の上部から左から右、右から左に2回斜めに固定します。
      2. 体を覆うために昆虫食塩水を注ぐ。ペトリ皿を顕微鏡下に置き、焦点を合わせて調整します。
      3. 機器を準備します( 材料の表を参照)。
   2. 中腸の解剖
      1. ミツバチの体の右側の中央にあるテルガイトA5(図1)の下にハサミの一点を挿入して、腹部から始めます。テルガイトA2にカットします。
      2. 内臓を傷つけないように、はさみの内刃を体の側面と平行に保ちます。はさみを左に回して1カットします。右に曲がって別のカットを行います。腹部の左側をそっと開いて固定します。反対側で繰り返します。
      3. 片手で鉗子を使用して、ミツバチの胃をそっと上に引き上げ、もう一方の手でハサミで食道の端を切ります。胃と中腸を腹部から引き離し、直腸を切ります。昆虫食塩水を....

結果

中腸における細胞死の検出
リュブリャナのスロベニア農業研究所の実験養蜂場から新たに出現した働きバチ(Apis mellifera carnica)を、3%シュウ酸(OA)²³で個別に処理しました。OAは、 Varroaデストラクタ 制御のための養蜂に頻繁に使用されます。処理後、働きバチ(各群から3匹)を氷上に固定した。中腸を解剖し、10%ホルマリンで固定した。次に、組織を一連のアルコール溶液で脱水し、最後にパラフィンワックスに包埋しました。ミクロトームで7μmの薄切片に切断した後、組織サンプルを分析用に調製した。光学顕微鏡を用いて、罹患細胞(3つの中腸サンプルのそれぞれから70〜100個の細胞)の割合を計算した。アッセイBの結果は、OAによる処理が中腸の細胞に有意に影響を与えることを示しました(図3)。アッセイAは、処理されたミツバチと対照のミツバチの間に差を示さなかった。細胞死率は10%未満であった。砂糖シロップのみを与えられた対照蜂では、中腸の形態は影.......

ディスカッション

生体では、細胞死はアポトーシスまたは壊死²⁵として定義され、オートファ^ジー26を伴うことがあります。アポトーシス細胞と壊死細胞の違いは、アポトーシスはプログラムされた細胞死の一形態であり、正常細胞に現れるのに対し、壊死は致命的な状態(事故、病気など)によって起こることです^27,28。アポトーシスは、TUNEL法に基づくアッセイキット(アポトーシス中に生成される二本鎖DNA切断の3'-ヒドロキシル末端を標識することによるDNA断片化の検出)を使用して検出できます。異なるキットは、細胞欠失を検出する際にいくつかのレベルの感度を提供します。

アッセイの1つ(アッセイC)は非常に感度が高く、アポトーシスと壊死の両方を検出します²⁹;他のアッセイ(B)は、アポトーシス細胞死を検出するためのより高い感度を示す

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2-Propanol
ApopTag ペルオキシダーゼキット (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection)	Sigma-Aldrich	S7100	Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE;S7101に含まれるポジティブコントロールは
、デッドエンド比色TUNELシステム	Promega	G7360	A、https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360
ます (ミツバチの解剖用)	ツァイス
蒸留水
包埋カセット
EnVision System アルカリホスファターゼキット	Dako
Eosin Y Solution	Sigma-Aldrich		アルコール
エタノール			95% (またはそれ以下)、90%、80%
Faramount 封入剤、水性	Dako		埋込用メディウム
フラット化テーブル	ライカ	HI1220
鉗子 (ミツバチの解剖用)	ファインサイエンスツール	11294-00	標準#4
マリン10%			ホルムアルデヒド
ヘマトキシリン	Sigma-Aldrich
HistoChoiceクリアリングエージェント	Sigma-Aldrich		クリアリングエージェント
水素ペルオキシダーゼ3%
インキュベーターBioRad
ピン (ミツバチの解剖用)	Entosphinx	44594	昆虫ピン ステンレス鋼 – 白、サイズ 2
ISCDDK、AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase)	Roche	11684809910	Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf
KH2PO4
Lab clock
光学顕微鏡	ライカ
顕微鏡スライド			スライドが入った箱は、ほこりを防ぐためにラップで保存する必要があります
ミクロトーム	ライカ
モジュール式組織包埋ステーション	ライカ
Na2HPO4
NaCl
パラホルムアルデヒド4%
パラプラスト	ライカ
パスツールピペット			1.5 mL; 3 mL
PBS
シャーレ (ミツバチの解剖用)			縮合シリコン充填 (キサントプレンLブルーとユニバーサルリキッドプラスアクチベーター)
プロテイナーゼK	Merck	21627
Ringers' solution (ミツバチの解剖用)			NaCL 7.5 g、Na2HPO4 2.72 g KH2PO4、1 L 蒸留水
はさみ (ミツバチの解剖用)	ファインサイエンスツール	1406-09、14061-09	および湾曲、9 cm
ユニバーサル液体プラス活性化剤 (ミツバチの解剖用)	クルツァー
時計職人s鉗子(ミツバチの解剖用)	ファインサイエンスツール	91100-12
ウォーターバス	ライカ
水彩ブラシ			2x
キサントプレンLブルー (ミツバチの解剖用)	クルツァー

アッセイ 解剖顕微鏡をカバーしホル昆虫直線