クロマダニの遺伝子編集のための胚注入技術

サマリー

本プロトコルは、ダニ胚を注入するための方法を記載する。胚注入は、トランスジェニック株を生成するための遺伝子操作のための好ましい技術である。

要約

ダニは、さまざまなウイルス性、細菌性、および原生動物の病原体を感染させる可能性があるため、医学的および獣医学的に重要なベクターと見なされます。ダニ媒介性疾患の負担が増大しているにもかかわらず、機能研究のための遺伝子形質転換ツールをダニのユニークな生物学に適用する際の課題のために、ダニに関する研究は昆虫病媒介動物に遅れをとっています。蚊が媒介する病気を減らすために遺伝的介入が注目を集めています。しかしながら、そのような介入の開発は、胚を注入することによる安定した生殖系列形質転換を必要とする。そのような胚注入技術は、ダニを含むキリセレートには欠けている。ダニ胚の外部の厚いワックス層、硬い絨毛膜、高い楕円形内圧などのいくつかの要因は、以前はダニの胚注入プロトコルの発達を妨げていたいくつかの障害です。本研究ではこれらの障害を克服し、クロマダニ Ixodes scapularis の胚注入技術について述べる。この手法は、安定した生殖細胞系列形質転換のためのCRISPR/Cas9などの成分を送達するために使用できます。

概要

ダニは医学的および獣医学的に重要なベクターであり、さまざまなウイルス性、細菌性、原生動物病原体および線虫を感染させることができます^1,2。米国東部では、黒脚ダニ、Ixodes scapularisは、ライム病(LD)病原体であるスピロヘータボレリアブルグドルフェリの重要なベクターです。米国では毎年40万人以上のLDが報告されており、米国で最大のベクター媒介感染症となっています¹。B. burgdorferiに加えて、4つの細菌(アナプラズマ食サイトフィルム、B. mayonii、B. miyamotoi、およびEhrlichia muris eauclarensis)、1つの原虫寄生虫(Babesia microti)、および1つのウイルス(Powassanウイルス)を含む6つの他の微生物がI.肩甲骨によって伝染し、このダニ種を主要な公衆衛生上の懸念事項にしています³。.ダニ媒介性疾患は近年より蔓延していますが、ダニの研究は、ダニの独特の生物学と遺伝的および機能的ゲノムツールの適用に関連する課題のために、蚊などの他の節足動物ベクターに遅れをとっています^4,5。

遺伝子編集技術、特にCRISPR/Cas9により、非モデル生物での機能ゲノミクス研究が可能になりました。生物において遺伝性突然変異を作り出すために、胚注入は、生殖系列^6、7、^8、9を改変するための構築物を送達するための好ましい方法であり続ける。しかし、最近^まで4、ダニの卵は胚を殺さずに注射することは難しすぎるか不可能でさえあると考えられていました^10,11。卵の厚いワックス層、硬い絨毛膜、および高い楕円形内圧は、ダニへの胚注入を妨げる主な障害のいくつかでした。成体の、血液を与えられたI. scapularisは、3〜4週間で最大2,000個の卵¹²個の単一のクラッチを堆積させます(約100個の卵/日)。卵は単独で産まれ、各卵は母親の腺ジェネの器官^13,14,15の突起または「角」によって分泌されるワックスでコーティングされています。このワックスは卵を乾燥から保護し、抗菌化合物^{を含んでいます15}。ダニの卵をうまく注入するには、ワックス層を取り除き、絨毛膜を柔らかくし、卵を乾燥させて卵内圧を下げて、注射が卵を不可逆的に損傷しないようにすることが重要です。生殖系列の形質転換を成功させるための胚注射の決定的な重要性を理解し、肩甲骨菌のプロトコルが開発され、CRISPR/Cas9コンストラクトを送達し、安定した生殖系列変異を生成するために使用できます⁴。I. scapularis研究への貢献に加えて、このプロトコルは他のダニ種にも最適化される可能性があります。

プロトコル

Ixodes scapularis の成虫は、オクラホマ州立大学(OSU)から購入するか、ネバダ大学リノ校(UNR)で飼育されました(IACUCプロトコル#21-001-1118)。

1.胚採取のための雌ダニの準備

注: 適切な年齢の卵を集めるためには、産卵を同期させることが重要です。マダニの産卵の手がかりは不明であるが、標準的な昆虫条件(温度27°C、相対湿度>90%RH)では、 肩甲骨の雌は 宿主剥離後約8日で産卵を開始する。このタイムラインは、4°Cで十分なメスを保存することで長くすることができます。 採血された雌は、産卵に悪影響を及ぼさずに4°Cで最大8週間保存しました。これらの条件は、昆虫ごとに変更する必要があるかもしれません。

1. マイクロインジェクションに使用されるまで、湿ったろ紙で裏打ちされた6クォートのプラスチックボックスに、4°Cで>90%RHで6°Cですべての雌を保管します。
2. 注射の1週間前に、産卵の開始のために雌を4°Cから27°Cのインキュベーターに移します。
3. 雌が産卵を開始したら(27°Cに移してから3〜4日後)、先端の細い絵筆を使用して卵を取り除き、ジェネの臓器(ワックス腺)の切除のために雌を準備します。
   注:ジェネの器官は、胚盤と頭蓋骨の間の領域(口器の背側基部)から伸びており、口の部分は腹側の体表面(表面に平行)上で曲がり、拡張された遺伝子の器官は卵が産むとすぐに卵を覆います(図1)。ジェネの臓器除去またはワックスを空にする前に産まれた卵は、ワックスコーティングが施されており、注射には適していないため、廃棄する必要があります。
4. ジェネの臓器を除去または空にするには、粘土を使用して、口の部分が腹側と背側の両方に見えるように向けられた顕微鏡下で、充血した女性をスライドガラスに配置します(図1B、C)。
   1. 以前に公開されたプロトコル¹⁶ に従って、タングステンワイヤーを使用して実験室で作られた細い鉗子とタングステン針を使用して、胚盤と口の部分の間の領域を正確に慎重に突く(針は市販品を購入し、マイクロ解剖プローブに取り付けることもできます、 材料の表を参照)。
   2. タングステン針で内側に向かって作業し、ワックス腺を引き出します(図1D、E)。腺を取り除くのに数分かかることがあります。ラボワイプを使用して、液体ワックスの分泌物を拭き取ります。
      注:腺は、口の部分のすぐ下の腹側から取り外すこともできます。針と鉗子でスクトゥムに向かって後ろに手を伸ばすことによって。口の部分にシリコン接着剤を塗布すると、ジーンの臓器外転もブロックされ、ワックスを除去または空にする代わりに使用できます(フランス、INRAEのLadislav Simo博士との個人的なコミュニケーション)。充血したダニは両面テープにとどまりません。粘土を使用してダニを「くるむ」と、操作中にダニを所定の位置に保つのに役立ちます。鉗子を使用して、解剖のためにダニとタングステン針を保持します。腹側部分は針で穴を開けるのが簡単で、著者によって好まれています。
5. 腺を空にするには、ステップ1.4で述べたように妊娠ダニを配置します。背側のマウスパーツの後ろの領域を慎重に穿刺し、鉗子を使用して腹側に圧力をかけます。
   注意: あるいは、ワックス腺を取り外す必要はありません。ワックスの腺を空にすることは数日間続くでしょう。産卵雌は、ワックス腺の位置を示す口の部分の周りに白い領域があり、参照として使用できます。
   1. 糸くずの出ないラボワイプの端を置き、穿刺部位から出てくる液体ワックスを取り除きます。わずかに黄色がかった粘性ワックスと比較して透明な液体である血リンパ分泌を避けるようにしてください。ほとんどのワックスが除去されるまで5〜10分かかる場合があります。
6. 操作後、雌を27°C(>90%RH)のインキュベーターに入れ、1〜2日間回復させます。
   注:治療を受けた女性は通常、回復して産卵を再開するのに1〜2日かかります。
7. 雌が再び産卵を開始したら、細かい絵筆を使用して新たに産卵した卵(産卵後0〜18時間)を収集し、1.5mLの微量遠心チューブに入れます。
   注:同じ女性の卵を長期間使用する場合、腺が除去されていない場合は、産卵の4〜5日後にこの手順を繰り返す必要があります。

2.マイクロインジェクションの胚治療

1. 0〜18時間齢の卵が入ったチューブに、~200μL(または卵の数に応じて卵を覆うのに十分な量)の5%(重量/体積)塩化ベンザルコニウム/水( 材料の表を参照)を追加します。.卵がチューブの底に落ち着かないように、絵筆で卵を5分間静かに回転させます(詳細については、Sharmaら⁴を参照)。マイクロピペットを使用して上清を取り除き、卵をチューブに残します。
   注意: 塩化ベンザルコニウムは皮膚や目に腐食性があり、手袋と目の保護具を着用してください。
2. 卵の入ったチューブに蒸留(DI)水を~200μL加え、絵筆で渦巻き、マイクロピペットを使用してマイクロ遠心チューブから水を取り除きます。DI水でもう一度洗浄を繰り返します。
3. 純水で洗浄した後、5%(w/v)塩化ナトリウム(NaCl)を~200μL加え、絵筆で5分間静かに旋回させます。5分後にチューブから溶液を取り出し、卵をDI水で2回洗浄します。
4. 卵の入った微量遠心チューブに~100 μLの1%(w/v)NaCl溶液を加えます。卵が注射に使用されるまで、卵を1%(w / v)NaCl溶液に入れてください。
5. 約1時間後にマイクロインジェクションを開始します。このタイムラインは、卵の適切な乾燥に役立ち、卵が破裂するのを防ぎます。
   注:卵は、生存に大きな影響を与えることなく、1%(w / v)NaCl溶液に7〜8時間保持できます。卵が注入または破裂するのが難しい場合、卵は十分に乾燥されておらず、さらに5%(w / v)NaClでさらに5分間処理できます。

3.注射針の準備

1. アルミノケイ酸塩キャピラリーガラス(フィラメント付き、 材料表を参照)を製造元の指示に従ってニードルプラーに挿入します。
2. ニードルプラーを次の設定に調整します:熱:575、プル:20、速度:50、時間:200、および圧力:700。
3. ニードルプラーのプル機能をアクティブにし、追加の針に対してこのプロセスを繰り返します。
4. 引っ張った針は、きれいなペトリ皿にモデラーの粘土の線に刺して保管します。
5. マイクロローダーチップを使用して注射混合物を針にロードします(材料の表を参照)。
   注:ダニと蚊の胚注射に使用される針の比較を 図2に示します。

4. マイクロインジェクションのスライドセットアップ

1. 両面テープを使用して、2つのガラス顕微鏡スライドを接着し、約0.5 cmの隙間を残して卵を整列させ、注射中に卵が横転するのを防ぎます(図3A)。
2. スライド間の隙間にある両面テープに透明フィルムドレッシング( 材料表を参照)を貼ります。フィルムドレッシングを隙間に完全に合わせるようにしてください。

5.胚マイクロインジェクション

1. 片毛の絵筆を使用して、スライドセットアップ(上)に一度に8〜10個の卵を揃えます。
   注:スライドエッジに垂直な長軸(図3B)に整列した卵は、縦軸がエッジに平行に配置されている卵(図3C)よりも注入が容易です。垂直方向の卵(図3B)は注射に耐えることができ、生存率が向上します。
2. 卵を揃えたスライドを複合顕微鏡のステージに置きます。糸くずの出ないワイプを使用して、それらが保存されている1%NaCl溶液を取り除きます。
3. 充填された注射針をマイクロマニピュレーターに接続されたマイクロインジェクターに取り付けます( 材料表を参照)。
4. マイクロインジェクターの高圧設定(>5,000hPa)を使用して、卵の表面に針をそっとこすりつけて針を開きます。
5. 針を開いた後、針の開口部に応じてマイクロインジェクターの圧力(1,000〜2,500hPa)を下げます。
   注意: 開口部が小さいほど比較的高い圧力が必要になり、開口部が大きいほど圧力が低くなります。これは、注入されるコンストラクトの体積を制御するためである。針の開口部のサイズに応じて、注入量は1〜5 pLの範囲で変化します。
6. スライド上のすべての卵をできるだけ早く10°〜15°の角度で注入し、湿った紙で裏打ちされたペトリ皿でスライドをすぐに高湿度条件に移動します。卵が注入されるとすぐに、それらは乾燥し始めます。
   注:一度に少数の卵を注入すると、注射の成功と生存確率が高まります。針は胚の逆流によって詰まります。先端がまだ鋭い場合は、詰まった針を取り除くために、スライドの端に追加された1%NaClの小さな液滴に針を移動します。毛細管現象は小さな詰まりを取り除きます。針がすでに鈍い場合は、交換してください。

6.胚の注射後のケア

1. 注入された胚を含むスライドを、湿ったろ紙で裏打ちされた大きなペトリ皿に入れます。
   注:少なくとも5〜6時間は卵を乱さないことが重要です。これにより、注射創を適切に密閉することができます。攪拌すると注射創が開き、細胞質がにじみ出て卵子が死亡することがあります。
2. 5〜6時間後、注入された胚を付着させた透明フィルムドレッシングに少量のDI水を加える。絵筆を使用して、卵をそっと動かします。卵を小さなペトリ皿(10 cm)に移し、DI水に浸します。
   注:フィルムドレッシングにより、注射後の卵子を簡単に除去できます。フィルムドレッシングに水滴を加えると、卵は水と一緒に動き始めます。
3. 卵を水に沈めたまま、ペトリ皿を27°C、>90%RHのインキュベーター内の6クォートのプラスチック箱に入れます。
4. 卵を定期的に、最初の数日間は毎日、その後幼虫が孵化し始めるまで3〜4日ごとにチェックします。
   注意: マイクロインジェクション中に多数の卵が損傷した場合は、1週間後にDI水をそっと排水すると、死んだ卵の真菌の成長を防ぐことができます。
5. 幼虫が注入された胚から孵化し始めたら(現在の実験室のセットアップでは注射後21〜25日)、それらを毎日チェックし、孵化した幼虫を上部にスクリーンを備えたガラスバイアルに移します。幼虫は水中で孵化し、~1〜2週間生存することができます。
6. 卵に目に見える表現型をもたらす可能性のある構築物を注入した場合、幼虫⁴ をスクリーニングします。

結果

I. scapularisの成功した胚注入プロトコルは、この記事で説明されています。産卵雌は、部分的にワックスをかけた卵の乾燥を避けるために高湿度に保たれました。ワックス層を除去し、妊娠した雌の遺伝子器官(ワックス腺)を切除することによりダニ胚を注入した(図1A-E)。首の短いアルミノケイ酸塩ガラス針を使用しました(図2)。この形状は、昆虫卵注射に使用される長首(テーパー)針よりも圧力に耐えることができるため、ダニの卵の注入に理想的でした。ダニの卵の球形は、針の挿入中にスライドから卵が転がらないようにするために、舞台裏にスライドプラットフォーム(図3A)を必要とします。肩甲骨I.の初期の胚発生は不明であるため、生殖細胞形成のタイミングと場所も不明です。したがって、発育の早い段階(12〜18時間齢)に卵を注入することを選択し、卵の長軸をスライドの端に垂直に揃え...

ディスカッション

これは、初期のダニ胚をうまく注入するために開発された最初のプロトコルです。生存率は~4%-8%で、これは他の確立された昆虫モデルの胚注入に匹敵します⁵。

これは最初のプロトコルであるため、このプロトコルはさらに洗練され、個々のダニ種に特化することが期待されます。特に、注入のタイミングは、胚形成、特に細胞化のタイミングに応じて、種ごとに異なります。予備データは、 I. scapularis の卵が産卵後の最初の24時間で急速な核分裂を経ず、数日後に細胞化が起こることを示唆しています(未発表データ)。このプロトコルは、プラスミド送達⁴、CRISPRを介した遺伝子ノックアウト⁴、および細菌(ボルバキア)の送達にすでに使用されています(表1)。この胚注入プロトコルは、トランスジェニックダニを生成する機会を提供し、遺伝子ノックアウトおよびノックイン研究をあらゆる研究室で実行可能にすることが期待されて...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ケイ酸アルミニウム毛細血管、フィラメント付き	サッター器具	AF100-64-10	胚注射
塩化ベンザルコニウム 50% 水、25g	TCI-America	B0414	胚処理、25 g 約 25 mL
濾紙	Whatman	1001-090	注射後ケア
鉗子	トーマス・サイエンティフィック	300-101	遺伝子の臓器操作
ラボワイプ	ジェネシーサイエンティフィック	88-115
マイクロローダーチップ	エッペンドルフ	930001007	引っ張られた針の装填
マイクロマニピュレーター	サッター機器	ROE-200	胚注入
顕微鏡スライド-プレーン、グランドエッジ	ジェネシーサイエンティフィック	29-100	胚のアライメント、グランドエッジが好ましく、斜めのエッジが可能視界から卵を隠す
NaCl	研究製品インターナショナル	S23020-500.0	胚治療
ニードルプラー	サッター器具	P-1000
永久両面テープ	スコッチ	34-8716-3417-5	胚アライメント
ペトリプレート	ジェネシーサイエンティフィック	32-107G	ポストインジェクションケア
テガダーム/透明フィルムドレッシング	3M ヘルスケア	1628	胚のアライメント
タングステン針	ファインサイエンスツール	10130-10	遺伝子の臓器操作
タングステンワイヤー	アマゾン	B08DNT7ZK3	遺伝子の臓器操作
XenoWorksデジタルマイクロインジェクター	サッター機器	MPC-200	胚注射