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方法論記事

ノックアウトマウスにおける心臓修復・リモデリング研究のための心筋梗塞の実験モデル

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DOI：

10.3791/64143

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2023年7月14日

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1Laboratorio de Patología Cardiovascular Experimental e Hipertensión Arterial, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Católica Argentina-CONICET, 2Servicio de Hemodinamia y Cardiología Intervencionista, Hospital Italiano de Buenos Aires, 3Instituto de Fisiopatologia Cardiovascular, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, 4División Cardiología, Hospital General de Agudos "Dr. Cosme Argerich,", 5Facultad de Veterinaria, Universidad de Buenos Aires

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、心筋梗塞の実験モデル、心臓のリモデリングと機能を研究するための心エコー検査法、ピクロシリウス赤染色切片とローダミン染色切片の線維化と肥大の定量化手順、およびマッソントリクローム染色したスライスの梗塞サイズと拡大指数について説明します。

要約

心血管疾患は、欧米諸国で最も多い死因であり、急性心筋梗塞(MI)が最も多い形態です。この論文では、心筋梗塞の実験動物モデルにおいて、ガレクチン3(Gal-3)が心臓の治癒とリモデリングの時間的進化に果たす役割を研究するためのプロトコルについて説明します。

記載されている手順には、雄のC57BL / 6J(コントロール)および Gal-3 ノックアウト(KO)マウスの永久冠状結紮糸を用いたMIの実験モデル、 in vivoで心臓リモデリングと収縮機能を研究するための心エコー検査手順、断面積(MCSA)による筋細胞肥大を研究するためのピクロシリウス赤染色およびローダミン結合レクチン染色切片による間質性心筋線維症の組織学的評価が含まれます。 マッソンのトリクロームと塩化トリフェニルテトラゾリウムで染色されたスライスの面積測定による梗塞のサイズと心臓リモデリング(瘢痕の薄化、中隔の厚さ、および拡大指数)の定量化。 ギャル-3 心筋梗塞のKOマウスでは、心臓リモデリングの乱れと瘢痕薄化率と拡大指数の増加が示された。心筋梗塞の発症時には、心筋機能や心臓リモデリングも重篤な影響を受けました。心筋梗塞後4週間で、梗塞した Gal-3 KOマウスの線維症の自然な進化も影響を受けました。

要約すると、MIの実験モデルは、 Gal-3 および他の動物モデルの遺伝的欠失を伴うマウスにおける心臓修復およびリモデリングの時間的進化を研究するための適切なモデルです。 Gal-3 の欠如は、心臓修復のダイナミクスに影響を及ぼし、心筋梗塞後の心臓リモデリングと機能の進化を混乱させます。

概要

心筋梗塞(MI)は、心血管疾患の最も一般的な形態です。心筋梗塞後、心筋梗塞ゾーンの治癒、心室リモデリング (VR)、心筋機能障害1 など、心筋は一連の形態学的および機能的変化を受けます。心筋梗塞の治癒は、線維性瘢痕の形成で終わる深部炎症性浸潤に関連する動的でよく調整されたプロセスです2,3。マウスのMIの実験モデルは、現在、病理学的条件下での心臓リモデリングの研究に使用されています4,5、および正確な外科的プロトコルの認識は、恒久的な冠状動脈結紮糸を誘導するための再現性のある効果的な手順を開発するために不可欠です。この方法は、MIの治癒と、左心室リモデリング(LVR)の時間的進化およびMIに関連する心機能障害におけるMIの関連性を研究するために必要です。

ガレクチンは、細胞内リガンド、膜受容体、細胞外糖タンパク質の特定の炭水化物を認識するレクチン群です。ガレクチン3(Gal-3)は、細胞表面の複合糖質中のN型糖鎖とO型糖鎖の認識と架橋を通じて作用するこのファミリーの一員であり、免疫系6で広く発現しています。以前の研究では、心血管疾患における炎症および線維症の調節因子としてのGal-3の役割が調査されています7,8,9,10,11,12。炎症はリモデリングの進化に特に影響を与える可能性があるため、治癒中の炎症の調節因子を標的とすることは非常に関連性が高いため、心筋梗塞後の心室リモデリングの時間的進化を研究するためのプロトコルと、Gal-3の遺伝子変異が心筋梗塞の治癒の時間的進化をどのように変更し、マウスの心臓リモデリングと機能に影響を与えるかを決定するための手順と方法を説明することを目指しました。

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プロトコル

注:このプロトコルに記載されているすべての実験は、ブエノスアイレス大学の動物管理研究委員会(CICUAL)によって承認され、全米研究評議会(米国)の実験動物のケアと使用に関するガイドの更新委員会13に沿って承認されました。実験には、年齢が一致したC57BL/6Jおよび Gal-3 KOマウス(8〜10週齢)を体重30〜35gの雄で使用し、手術のためのより良い操作を可能にします。動物が 自由に水と食べ物にアクセスできるようにします。 Gal-3 KOマウスは、C57BL/6Jマウスと同じバイオリソース施設でC57BL/6Jをバックグラウンドに飼育しました。

1.手術領域と器具

  1. 手術を開始する前に、人工呼吸器が電源に接続され、正しく機能していることを確認してください。麻酔液が十分にあることを確認します。手術当日に、使用する動物の数を計算して溶液を準備します。
  2. ステンレス製ハサミ、マイクロハサミ、大小の針用のニードルホルダー、リトラクター、エクストラシャープ、湾曲した鉗子、鋸歯状の鉗子、組織鉗子など、すべての手術器具が滅菌されていることを確認してください。作業エリアを70%エタノールで清掃します。
  3. 潜在的な出血の即時焼灼のために、小さなコットンボール、ヒソップ、ガーゼが利用可能であることを確認してください。
  4. 左下行冠状動脈(LDA)の結紮糸用の10-0〜7-0シリコンコーティングされた編組シルク縫合糸、胸部閉鎖用のナイロン縫合糸、および皮膚を閉じるためのリネン糸を準備してください。

2.麻酔と挿管

  1. マウスの体重を量り、麻酔の投与量を決定します。
  2. 発泡スチロールベースで囲まれた加熱パッドを40°Cに予温します。
  3. ケタミン(65 mg / kg)、キシラジン(13 mg / kg)、およびアセプロマジン(1.5 mg / kg)を含む溶液の0.1 mL / 10 g体重の筋肉内投与でマウスを麻酔します。.
  4. マウスに麻酔をかけた後、手術を開始する前に、指で足を押すなど、少し痛みを伴う刺激を誘発して麻酔の深さを確認します。動物が刺激に反応した場合は、麻酔薬の深さを調整します。
  5. マウスを 背側褥瘡に置き、両眼実体顕微鏡の下に置いて、脚を加熱パッドの上の作業ベースにテープで固定します。作業ベースに取り付けられた上顎歯を保持する糸で首を過伸ばします。
  6. 次に、挿管部分については、首の最小限の切開部から気管リングを露出させ、前に説明したように、げっ歯類の人工呼吸器(一回換気量:250mL /ストローク)に接続された20Gの静脈内カテーテルでそれをチャネル化します14。
  7. 動物を外側褥瘡に置き、4番目または5番目の肋間腔で左外側開胸術を行います。動物の皮膚を切開します。下の筋肉を観察し、胸壁から離すように注意深く広げて、肋間腔をはっきりと見ます。この時点で、動物が人工呼吸器に正しく接続されていることを確認してください。次に、非常に鋭い鉗子で穴を開けて、肋間腔を開きます。
    注: LDA は、上記の肋間腔の遊離左心室 (LV) 壁に沿って識別できる必要があります。
  8. 心膜切除術を実施し、冠状動脈と冠状静脈、および左耳介の下の LDA の影響を対比して LDA を特定します。次に、8-0を使用してLDAの合字を実行します。耳介の端から~2mmの絹糸。最後に、6-0シルクスレッドを使用して胸部を層ごとに閉じ、肋骨を閉じ、内部に気胸がないことを確認します(これは人工呼吸器で肺を強制的に拡張させることによって慎重に行ってください)、筋肉に近づくか縫合してから皮膚を閉じます。
  9. 皮膚が閉じたら、 腹側褥瘡でマウスを人工呼吸器からゆっくりと切り離し、呼吸周波数が回復したら気管内チューブを取り外します。動物を静かな環境で、できれば室温が27°Cの安定した状態で麻酔から回復させます。
  10. 動物が麻酔から回復し、手足を動かし始め、正常な呼吸周波数が回復するのを待ちます。その後、プロトコールが終了するまで個々のケージに保管します。
  11. 対照動物または偽手術動物に対しても同じ手順を実行しますが、LDAの結紮糸は使用しません。

3. スタディデザイン

  1. 心筋梗塞後の治癒と心室リモデリングの時間的進化をテストするには、マウスを次のグループにランダム化します。
    1. 心筋梗塞の 1 週間後の心室リモデリングの初期段階を研究するには、マウスを次のグループに割り当ててください: 1) C57 偽 (1 週間);2) Gal-3 KO Sham (1週間);3) C57 MI (1週間);4) Gal-3 KO MI (1週間)。
    2. MIの4週間での心室リモデリングの後期を研究するには、マウスを次のグループに割り当てます:5)C57偽(4週間);6) Gal-3 KO Sham (4週間);7) C57 MI(4週間);8) Gal-3 KO MI (4週間)

4.心エコー検査

注:マウス心エコー図の場合、壁の直径とキャビティサイズを適切に視覚化するには、10MHzを超える線形トランスデューサを使用する必要があります。この手順は、腹腔内(IP)アベルチンを1.15 mL/kgの麻酔下で、または意識のある動物で行うことができます。しかし、後者は、操作によって引き起こされるストレスや不安のために、MIのマウスで交絡結果につながる可能性があります。

  1. マウスを麻酔するには、マウスを持ち上げ、手のひらに背を向けて保持し、裏返して腹部の表面に到達します。その位置で、動物と皮下針との間に45°の角度でIP麻酔を注入します。
  2. マウスに麻酔をかけたら、胸を剃り、マウスを温めた温熱パッドの上に置いて背側褥瘡の位置にします。傍胸骨の長軸と短軸のビューを取得するには、トランスデューサを90°動かします。正しい軸ビューが得られたら、カーソルを乳頭筋レベルに置き、 2D Mモード キーを押して画像をキャプチャし、画像解析ソフトウェアを使用して次のパラメータを測定します。
    1. 壁の厚さ (LVWT)、収縮期 (S) と拡張期 (D) の両方の LV 領域、左心室拡張期領域 (LVDA) と左心室収縮期領域 (LVSA) を含む LV 寸法を少なくとも 3 拍動で測定します。
    2. また、前述の15と同様に、式(1)、式(2)、式(3)を用いて、駆出率(EF,%)、短縮率(SF,%)、心質量(未補正立方体と仮定)で心室機能を計算する。
      SF (%) = ([LVEDD - LVESD]/LVEDD) × 100 (1)
      EF (%) = ([LVDA - LVSA]/LVDA) × 100 (2)
      LV質量 = 1.055 × ([IVST + LVEDD + PWT]3− [LVEDD]3) (3)
      ここで、LVEDD は左心室拡張末期直径、LVESD は左心室収縮末期直径、IVST は脳室内の厚さ、PWT は後壁の厚さです。

5. 組織学的評価

  1. 剖検では、胸部を左右に開き、それを取り巻くすべての構造を切断することにより、動物から心臓を取り出します。ティッシュペーパーを使用して穏やかな圧力を加えることにより、空洞内の血栓をきれいにします。
  2. 実験室の精密スケールで心臓を採取し、計量します。室温で少なくとも72時間、10%ホルムアルデヒドに浸します。ハートを刃物で1mm厚の横切り状に頂点から基部まで手作業で切り取り、パラフィンに包み込んで加工します。パラフィン包埋切片を厚さ5 μmのミクロトームで連続的に切断します。
  3. スライドの間に各切片を置き、ヘマトキシリンとエオシン(H&E)、マッソンのトリクローム、ローダミン結合レクチン染色切片、またはPicrosirius red15,16で染色します。
    1. 適切な光顕微鏡を使用して、形態計測、線維症、およびMCSA定量化のために400倍でデジタル化された画像を撮影します。顕微鏡がデジタルカメラに取り付けられ、画像解析ソフトウェアがインストールされているコンピューターに接続されていることを確認します。各形態測定解析では、画像が同じ領域にあり、セクション (中隔、梗塞帯、およびリモート ゾーン) ごとに 400 倍以上の高倍率フィールドがあり、フィールドが重なっていないことを確認します。
      1. MCSAを測定するには、心筋細胞の位置に注意し、横方向にスライスされ、少なくとも3つの近くの毛細血管に囲まれた筋細胞のみをカウントします。
      2. Picrosiriusの赤く染まったスライスで、瘢痕と中隔領域を特定し、両方のゾーンの間質性コラーゲンを画像化します。解析ソフトに画像をアップロードし、閾値タブを開いて、陽性と負のコラーゲン領域をすべてハイライトします データを取得するには、測定タブを押して結果を保存します。領域当たりのコラーゲンの割合の計算には、式(4)を使用し、コラーゲン陽性ゾーンを加算し、それらをコラーゲン陽性領域を含む全組織で除算する(他の場所で述べた15,16)。
        コラーゲン(%)=ピクロシリウス赤色領域/総組織領域(4)
      3. パラフィン包埋サンプルのローダミン標識レクチン染色切片から得られたデジタル化画像からMCSAを定量します。正しい画像を取得するには、画像解析ソフトウェアを使用して、細胞膜を囲む筋細胞の赤い輪郭をトレースします。 エリア タブを選択し、アウトラインをトレースして、 測定 タブ機能を押します。最後に、セル領域16からの結果を保存する。

6. 心臓リモデリング評価のための梗塞サイズと面積測定の定量的決定

  1. 光学顕微鏡(4倍)と適切なソフトウェアで得られたMassonの三色染色切片の組織学的画像から、心筋梗塞のサイズ、壁の厚さ、心内膜および心外膜の円周の長さをプラニメトリーを使用して測定します。
    1. 梗塞のサイズを定量化するには、梗塞ゾーン(青)とリモートゾーン(赤)を特定します。梗塞ゾーンと心内膜側と心外膜側のリモートゾーンの全長を追跡し、測定します。心内膜および心外膜のトレースの平均を、総LV円周17のパーセンテージとして計算します。
    2. 同様に、心臓の中央部分の瘢痕の厚さ(5つの等距離測定値の平均)と中隔の厚さ(3つの等距離測定値の平均)を測定し、これらの測定値を使用して瘢痕の厚さの比率(式[5])と拡張指数(式[6]18)を決定します。
      注:すべての値はスプレッドシートに記録できます。
      傷跡の厚さの比率=傷跡の厚さ/中隔の厚さ(5)
      膨張指数=(LV空洞面積/総LV面積)×(中隔の厚さ/傷跡の厚さ)(6)
      注:リモデリングは拡張を変更する可能性があり、その結果、梗塞のサイズが過小評価または過大評価されるため、24時間で梗塞サイズを測定するためのパイロット実験を実行し、その後安楽死を行うために時間が必要になる場合があります。この場合、MI手順に使用したのと同じIP麻酔薬溶液で動物に麻酔をかけます。
  2. 動物を背側褥瘡に置き、前述のように挿管します。動物に麻酔をかけたら、剣状突起から腋窩のくぼみまで、皮膚、筋肉、肋骨に到達する深い斜めの切開を行います。
  3. 大動脈弓を分離し、上行大動脈に小さな穴を開け、カテーテルを導入してエバンズブルーで心臓を灌流します。次に、汚れた心臓を動物から手動で取り除き、鋭利な刃で頂点から基部まで切り取ります。ハートスライスを等張リン酸緩衝液(pH 7.4)中の1%トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)に入れ、37°Cで30分間インキュベートします 4 動物が梗塞サイズの点で同等であることを確認します。

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結果

心筋梗塞後の生存と剖検
4週間の追跡調査で、C57マウスの17%(4/23)に対し、 Gal-3 KOマウスの40%(8/20)が死亡していることが判明した。剖検が行われました。死亡した Gal-3 KOマウスは、C57マウスよりも大きな心臓を示し(図1)、 Gal-3 KOマウスの32%と比較して、C57マウスの38%は、心臓破裂に直接関連する巨視的な胸部血栓を持っていました。後者は、死因が心臓破裂に関連していないことを示しました。プロトコルの終了時および剖検後、心臓のリモデリングは、心臓の壊死領域の単純な肉眼的視覚化によって特定できました。 図1 は、両方の実験グループの心臓の代表的な画像を示しており、心臓のサイズの増加、拡張、および瘢痕の動脈瘤の存在が主に特定され、MIの Gal-3 KOマウスの心臓で著しく増加していることがわかりました。

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ディスカッション

永久冠動脈結紮糸による心筋梗塞の実験モデルは、心臓の修復とリモデリングの多種多様な病態生理学的メカニズムを研究するために使用されています5,14,17。この記事では、心臓修復の時間的進化と心筋梗塞後の心室リモデリングへの影響を研究するために、この研究室で現在使用されているさまざまな方法をまとめています14,17。虚血性心疾患には、リスクのある領域のほぼ完全な壊死を引き起こす永久冠状動脈結紮術と、虚血性壊死と再灌流を組み合わせた一過性脳虚血とそれに続く再灌流(「虚血/再灌流」)の2つのモデルがこれまでに主に研究されてきました。後者は、再灌流療法を受けている患者と同様のよりトランスレーショナルなアプローチを表していますが、このアプローチは動物モデルからの結果を患者に変換する...

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開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

著者は、Ana Chiaroの技術支援に感謝しています。この研究は、アルゼンチン科学技術振興庁(PICT 2014-2320, 2019-02987 and PICT 2018-03267 to VM)およびブエノスアイレス大学(UBACyT 2018-382 20020170100619BA to GEG)からの助成金を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
8-0シルク縫合 エチコン
C57BL / 6Jブエノスアイレス大学獣医学部生物資源学科、アルゼンチン
鉗子
Hardvard 386マスクHardvard社
加熱パッドは手術中に動物の体温を維持します
画像Pro-Plus 6.0メディアサイバネティクス画像解析ソフト
ケタミン ホリデー
マッソントリクロームBIOPUR
ピクロシリウスレッドBIOPUR
リトラクター
 げっ歯類の人工呼吸器モデル683 ハーバード装置機械人工呼吸器
はさみ 
立体虫眼鏡Arcano
Vivid 7マシン(General Electric Medical Systems、ホルテン、ノルウェー)General Electricは、このプロトコルWGA番号で任意の追跡ソフトウェアを利用できます
。RL-1022、ベクターラボラトリーズ、バーリンゲームベクターラボラトリーズ
キシラジンプロシリーズ
マウス

参考文献

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