蛍光ミトコンドリアによる条件付き不死化マウス糸球体内皮細胞の単離

Summary

この記事では、熱不安定性サルウイルス40および光活性化可能なミトコンドリア、PhAM^{を切除した}トランスジェニックマウスの腎臓から条件付き不死化糸球体内皮細胞を単離する方法について説明しています。ビーズを用いた腎臓全体からの糸球体単離の手順、消化ステップ、播種、およびGECs-CD31陽性の培養について説明します。

Abstract

糸球体内皮細胞(GEC)の機能不全は、糸球体濾過バリアの破壊を開始し、一因となる可能性があります。ミトコンドリア酸化ストレスの増加は、いくつかの糸球体疾患の病因におけるGEC機能障害をもたらすメカニズムとして示唆されています。歴史的に、 in vivo モデルからのGECの単離は、糸球体から純粋な培養物を単離することが困難であるため、悪名高いほど困難でした。GECは、 in vitroでの 複雑な増殖要件と非常に限られた寿命を持っています。ここでは、ミトコンドリアの分裂および融合イベントの追跡を可能にする、蛍光ミトコンドリアを有する条件付き不死化GECを単離および培養する手順について説明します。GECは、熱不安定性SV40 TAg(イモータルトマウス由来)を発現し、条件付きで増殖を促進し、細胞分化を抑制する二重トランスジェニックマウスの腎臓から単離され、すべてのミトコンドリア(光活性化可能なミトコンドリア[^PhAM切除]マウスから)の光変換蛍光タンパク質(Dendra2)を単離しました。生成された安定した細胞株は、不死化SV40 TAg遺伝子の不活性化後の細胞分化と、蛍光の緑から赤への切り替えを引き起こすミトコンドリアのサブセットの光活性化を可能にします。mitoDendra2-GECを使用することで、細胞を染色することなく、蛍光ミトコンドリアの分布、融合、および分裂イベントのライブイメージングが可能になります。

Introduction

糸球体は、糸球体濾過バリア^1,2を通過する大きな分子の通過を制限することにより、血液濾過にとって重要である。糸球体には、頭頂上皮細胞、足細胞(内臓上皮細胞)、糸球体内皮細胞(GEC)、メサンギウム細胞の4つの細胞タイプが含まれています³。糸球体内皮は、大きな濾過量に必要なフェネストラの存在に従って、独特の血管構造によって特徴付けられ^る4。糸球体内皮の頂端表面は、負に帯電したグリコカリックス層と、内皮と血液の間に空間を作り出す内皮表面層と呼ばれるコートで覆われています。この構造は、アルブミンなどの負に帯電した分子の通過を制限し、白血球と血小板の接着を防ぐ高い電荷選択性を提供します⁵。

GECは、糖尿病環境に関連する高血糖などの代謝変化に非常に敏感です。実際、糖尿病は有害物質の循環の増加、グルコース代謝経路の飽和、および細胞酸化還元バランスの乱れにつながります^3,6。さらに、活性酸素種の増加はミトコンドリア機能障害を誘発し、内皮機能に影響を与えます⁷。

現在のプロトコルの全体的な目標は、蛍光ミトコンドリアの特徴を持つ不死化糸球体内皮細胞を単離することです。実際、初代GECの細胞培養は増殖周期が限られており、老化^が早い8。さらに、蛍光ミトコンドリアの存在は、高血糖または他の治療に応答して分裂および融合事象を調べるのに役立つ。別の方法として、他の研究室ではh-TERTを使用して細胞をin vitro^で不死化しました9。

ここで説明する方法は、4〜6週齢の動物から条件付き不死化mitoDendra2糸球体内皮細胞を単離することを可能にする(図1)。この詳細なプロトコルは、熱不安定な条件付き不死化細胞を生成するためのサルウイルス40大腫瘍抗原(SV40TAg)遺伝子^10,11を保持するトランスジェニックマウス(H-2K^b-tsA58)の使用を記載している。tsA58 TAg遺伝子産物は、マウスH-2Kb遺伝子の誘導性5'隣接プロモーターの制御下で33°Cの許容温度で機能し、インターフェロンガンマ(IFNγ)への曝露により基礎レベルを超えて増加し、したがって条件付き増殖表現型¹²を維持します。H-2Kbは、IFNγの非存在下で37°Cの非許容温度で急速に分解され、細胞内のtsA58Tagの不死化機能を除去し、細胞がより分化した表現型を発達させることを可能にします13,14,15。H-2Kb-tsA58トランスジェニックマウスと、ミトコンドリア特異的(シトクロムcオキシダーゼのサブユニットVIII)デンドラ2-グリーンを発現するPhAMマウスとのオプションの交配により、蛍光ミトコンドリア¹⁶のライブ検出が可能になります。Dendra2緑色蛍光は、405 nm^{レーザー16}に曝露すると赤色蛍光に切り替わります。ミトコンドリアが光スイッチング後に融合すると、緑と黄色の物質の交換から黄色に見えるか、核分裂を起こすと赤く見える細長い形状を形成します^7,17。mitoDendra2-GECは、さまざまな刺激に対するGECミトコンドリアの細胞応答を研究するための優れたツールです。

Protocol

ここに記載されているすべての動物の手順は、マウントサイナイのアイカーン医学部のIACUCによって承認されました。ジャクソン研究室から購入した3匹のオスマウス(H-2Kb-tsA58トランスジェニックマウスと光活性化可能なミトコンドリア[PhAM])を使用し、通常の飼料を続けました。

1.労働条件と準備

1. 層流フード内の作業スペースは、70%エタノールとUV-Cライトを使用して清掃します。
2. ビーズの洗浄バッファーを準備します。pH 7.4-8.0の0.1 Mリン酸ナトリウムを使用してバッファー-1を、0.1%ウシ血清抗原(BSA)、3 mM EDTA、pH 7.4を添加したカルシウムとマグネシウムを含まない1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用してバッファー-2を、0.1%BSAを含む0.2 Mトリス、pH 8.5を使用してバッファー-3を作成します。

2.磁性粒子濃縮装置

1. 磁気ビーズの作製
   1. 1.5 mLの微量遠心チューブで、200 μLの磁気ビーズ(4 x 10⁸ ビーズ)を200 μLのバッファー-1と穏やかに混合します。
      注:組織採取の1日前にマウスあたり200μLの磁気ビーズを準備します。ビーズは糸球体を収穫するために使用されます。
   2. チューブを磁性粒子濃縮器に1分間置き、上清を注意深く吸引します。チューブを磁石から取り外し、洗浄したビーズを200 μLのバッファー-1に再懸濁します。
   3. 磁気ビーズの入ったチューブを磁性粒子濃縮器に1分間入れ、上清を静かに吸引します。
   4. チューブを磁性粒子濃縮器に入れてバッファーを廃棄することにより、200 μLのバッファー-2を使用して磁気ビーズをそれぞれ2回、5分間洗浄することにより、遊離トシル基を不活性化します。
   5. 磁気ビーズを200 μLのbuffer-3中で4°Cで24時間、または37°Cで4時間インキュベートし、残りの遊離トシル基を不活性化します。チューブを磁気濃縮器に1分間置き、上清を静かに吸引して廃棄します。
   6. 磁気ビーズを200 μLのバッファー-2で4°Cで5分間洗浄します。 チューブを磁気濃縮器に1分間戻し、上清を静かに吸引します。磁気濃縮器からチューブを取り外し、磁気ビーズを200 μLのバッファー-2に再懸濁して、4 x 10⁸ ビーズ/mLを得ます。
      注:この段階では、ビーズを4°Cで最大15日間放置することができます。

3. マウス腎糸球体細胞の単離

1. 灌流材料を準備します:30 mLシリンジ、25 Gバタフライニードル。隔離材料を準備します:滅菌10 cmディッシュ、メス、磁性粒子濃縮器、40 μm細胞ストレーナー、100 μm細胞ストレーナー。
2. 1%抗生物質を添加した1xハンクスバランス塩溶液(HBSS)100 mLを準備し、pHを7.35に調整します。溶液を0.2μmのフィルターでろ過し、汚染を避けるためにフードの下に保管してください。
3. ステップ2.1.6の磁気ビーズ200 μLを1x HBSS20 mLと混合します。
   注:各マウスについて、20 mLのHBSS 1xで希釈した200 μLのビーズが必要になります。
4. 1 mL アリコートのコラゲナーゼ II.型 (125 CDU/mg) を 1 mg/mL の 1x HBSS 溶液、pH 7.35 で調製します。RPMIを10%FCS培地で37°Cの水浴中で予熱します。 内皮細胞培養培地を37°Cで予備加温します(詳細については 、材料の表 を参照してください)。
   注:RPMIはコラゲナーゼを中和するために使用されます。
5. 6 ウェルプレートの 2 ウェルに 2 mL の 10 μg/mL コラーゲン IV (1 mL/ウェル) を室温で 45 分間プレコートします。プレートを1x PBSで3回洗浄して、コラーゲンの希釈に使用した酢酸を除去します。コーティングされたプレートをすぐに使用するか、2〜8°Cで最大4週間保管してください。
   注意: 乾燥を防ぐために、プレートを透明フィルムで密封することをお勧めします。コラーゲンコーティングは、プレートへの細胞の付着を容易にします。
6. 図2のすべての手術器具を70%エタノールを使用して洗浄および滅菌し、その後30分間オートクレーブ滅菌します。手術室を70%エタノールで洗浄します。
7. ケタミン/キシラジン(10 mg / mLケタミンと1 mg / mLキシラジン)の腹腔内注射でマウスを麻酔します。.動物が完全に麻酔されていることを確認するには、つま先のつまみ反射を確認します。
8. マウスの足を19 Gの針で固定して、解剖プラットフォーム上の所定の位置に保持します。胸部と腹部を70%エタノールで洗浄し、ハサミaで胸部に沿って腹部を開きます(図2)。
9. 左心室にバタフライニードルを挿入し(図3A)、約100μLのビーズ溶液を注入して(ステップ1.2から)、血液循環を拡大します。
10. 腎臓の下の下大静脈を19 Gの針で慎重に破ります(図3A)。ステップ3.9で開始した灌流を続けます。
    注:または、ミニポンプを速度:18.0+、時間:5分で使用できます。良好な灌流は、多数の糸球体含有磁気ビーズを収穫するために重要である。これは非生存/終末手順です。
11. ピンセットで脂肪組織をそっと取り除き、細い外科用ハサミc(図2)で両方の腎臓を切除し、氷上で1 mLの1x HBSSを入れたプレートに入れます。腎臓をハサミb(図2)で細かく刻み、 次に滅菌メスで図3Bに示すように1mmの小片に刻みます。
12. 次に、ミンチ腎臓をステップ3.4のコラゲナーゼII型1 mLと共に、水平シェーカーを使用して穏やかに傾けながら37°Cで35分間インキュベートします。 図3Cに示すように、このステップの後、組織は完全に消化されるはずです。
13. 4 mLのRPMIを10%FBSで追加し(ステップ3.4から)、コラゲナーゼを中和します。消化された組織を滅菌済みの100 μm細胞ストレーナーを通して50 mLチューブにろ過します。滅菌済みの1.5 mLマイクロ遠心チューブの底部を使用して、消化された組織をストレーナーに対して攪拌し、糸球体を通過させます。
14. セルストレーナーを15 mLの1x HBSSですすぎ、フロースルーを200 x g で室温で5分間遠心分離します。この時点で、ペレットには3つの層が含まれています。糸球体を持つビーズはチューブの中間層に見え、上層は細管などの小さな構造で構成され、下層は破片です(図3D)。
15. 上清と一番上の白い層を注意深く吸引します。残りのペレットには、糸球体と破片を含むビーズが含まれています(図3D)。ペレットを1.5 mLの1x HBSSで再懸濁し、2 mLチューブに移します。
16. チューブを磁気濃縮器に入れ(図3E)、上清を吸引してから、ビーズを1 mLの1x HBSSで2回洗浄します。この段階で、20 μLの細胞懸濁液をスライドに載せ、顕微鏡下で糸球体の存在を確認しました(図3F;糸球体[黒い矢印]、および懸濁液中のいくつかのビーズ[黄色の矢印])。
17. 上清を注意深く吸引し、ペレットを内皮細胞増殖培地(材料表)に再懸濁し、清潔な2 mLチューブに移します。2 μLのIFNγ(100 U/mL)をチューブに加え、6ウェルプレートの1ウェルに細胞をプレートします。細胞を33°Cでインキュベートします。
18. 3日間の培養後、1 mLの培地をピペッティングし、1 mLの新鮮な培地と交換して、培地を慎重に交換します。この段階では、細胞は糸球体細胞の混合物と不均一である(図4G)。
    注:アウトグロデュース培養では、糸球体細胞といくつかの磁気ビーズが混在します(図4G)。すべての細胞が緑色の蛍光ミトコンドリアを示すはずです。
19. 7日間の培養後、培地を完全に吸引し、IFNγ(100 U/mL)を添加した新鮮な2 mLの内皮細胞増殖培地と交換します。この段階で、細胞は増殖を開始しますが、依然として不均一です(図4A)。
20. 培養の10日後、細胞が~80%のコンフルエントに達したら、ステップ5.1に記載のようにトリプシンを使用して細胞を継代し、コラーゲンIVでコーティングされたT25フラスコに移します。
21. 1週間後(合計~21日間の培養)、細胞をコラーゲンIVでコーティングしたT75フラスコに継代する。

4. 内皮細胞単離用ビーズの作製

1. まず、ヒツジ抗ラットビーズをラット抗マウスCD31抗体³、^18、19でコーティングする。T75フラスコごとに10 μLのビーズを使用します。
2. 10 μLのビーズを、0.1% BSA、2 mM EDTA、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した200 μLの1x PBSで3回洗浄します。チューブを濃縮マグネットに入れて、毎回洗浄バッファーをピペットで固定します。
3. ビーズを200 μLのPBS、1% BSA、2 mM EDTA、1%ペニシリン/ストレプトマイシンに再懸濁します。4.8 μLのラット抗マウスCD31抗体7,18,19を加え、チューブを水平シェーカーに置き、室温で1時間穏やかに混合した後、チューブを4°Cで一晩保ちます。

5. CD31コートビーズによる糸球体内皮細胞の単離

1. 3 mLの0.25%トリプシンをT75フラスコに加え、細胞を37°Cで5分間インキュベートします。3 mLの内皮増殖培地でトリプシンを中和し、細胞を15 mLチューブに移した後、200 x g で5分間遠心分離します。
2. 上清を吸引し、1%BSA、2 mM EDTA、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含む1 mLのPBSで細胞を洗浄します。200 x g で5分間遠心分離します。
3. ステップ4で調製した200 μLのコーティングビーズにペレットを再懸濁し、1% BSA、2 mM EDTA、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含む800 μLのPBSを加えます。細胞を37°C、5%_CO2で連続振とうしながら45分間インキュベートする。
4. チューブを磁気濃縮器に入れ、1%BSA、2 mM EDTA、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含む1x PBSで細胞を4回洗浄します。100 U/mL IFNγを添加した3 mLの内皮増殖培地に細胞を再懸濁します。
5. コラーゲンIVコーティングウェルに1.5 mLの細胞/ウェルを6ウェルプレートにプレートします。細胞を33°Cの許容条件下で培養する。
   注:単離された細胞は、サルウイルス40(SV40)大型T抗原tsA58を発現し、33°C(許容条件)での連続増殖の活性化を可能にします。
6. 培養4日後、750 μLの培地を除去し、100 U/mL IFNγを添加した同量の新鮮な培地と交換します。
7. 培養の10日から14日後、488 nmフィルターを備えた落射蛍光顕微鏡を使用して、蛍光ミトコンドリアを発現するCD31陽性GECsコロニー(図4C)の成長を確認します。
8. 21日間の培養後、細胞は80%〜90%のコンフルエントに達した可能性があります。それらをT25フラスコに移します。コンフルエントに達した後、細胞はRPMI増殖培地および10%FCSで維持することができる。
   注:コンフルエントに達する前は、細胞は不均一に見えることがあります(図4B)。しかし、それらが合流すると、彼らは石畳の形態を獲得します。
9. この段階で、細胞は凍結保存することができます。80%コンフルエントになったら、3 mLの0.25%トリプシンを細胞に加え、37°Cで5分間インキュベートします。10%FBSを添加した等量の増殖培地でトリプシンを中和します。
10. 200 x g で5分間遠心分離します。上清を廃棄し、細胞を3 mLの凍結培地(RPMI、20%FBS、10%DMSO)に再懸濁します。細胞をクライオチューブに分注し、液体窒素蒸気温度で保管します。

6. ミトデンドラ2-GECの栽培

1. ステップ5.10から、37°Cの水浴でクライオアリコートから細胞を解凍し、10 mLの予温された内皮増殖培地を含む15 mLチューブに移します。
2. 懸濁液を200 x gで室温で5分間遠心分離します。培地を取り出し、ペレットを100 U/mL IFNγを添加した内皮細胞増殖培地を予め温めたコラーゲンIVコーティングT25cm2細胞培養フラスコに移し、33°Cでインキュベートします。
3. 翌日、培地を交換してください。細胞が70%〜80%コンフルエントに達したら、通常5日後に、それらをT75cm2細胞培養フラスコに移す。
4. 細胞を内皮表現型に分化させるには、IFNγを含まない増殖培地中で37°Cで細胞を非許容条件に移します。

7. ミトデンドラ2-GECの継代

1. 培地を除去し、細胞をPBSで洗浄し、3 mLの温かい0.25%トリプシン-EDTA溶液(T75 cm² フラスコ)を加え、37°Cで5分間インキュベートします。
2. 細胞が剥離したら、5 mLの増殖培地とピペットを上下に添加します。懸濁液を室温で200 x g で5分間遠心分離し、細胞を新しいコラーゲンIVコーティングフラスコまたはプレートに移します。
   注意: 継代は週に1回、1:4の比率で行う必要があります。

8. ミトデンドラ2-GECのキャラクタリゼーション

1. 分化した細胞⁷、^18、19、20上のCD31について免疫蛍光染色を行う(図4D)。vWFやイソレクチン-B4などの他のマーカーも同様に使用してください²⁰。
2. Dendra2のミトコンドリア特異性を確認するために、100 nMのミトコンドリアトラッカーを含む増殖培地中で細胞を37°C、5%_CO2で30分間インキュベートすることにより、細胞をミトコンドリア特異的マーカーで標識します。
3. 培地を取り出し、フェノールレッドを含まない予め温めた培地で細胞を穏やかに洗浄して、ライブイメージングを実行します。
   注:あるいは、ホルムアルデヒド固定液(4%)を使用して細胞を30分間固定した後、PBSで数回洗浄することもできます。固定細胞は、使用するまで1x PBSで4°Cで保存できます。フローサイトメトリーによる確認も可能です:抗CD31、抗PECAM、抗CD45で細胞を標識します。GECは、足細胞マーカー(シナプトポジン、Nphs1、Podxl)、メサンギウム細胞マーカー(PDGFRβ、アンジオテンシノーゲン)、および尿細管細胞マーカー(アクアポリン、アミノペプチダーゼ-N)に対して陰性に染色する必要があります。これらのマーカーはネガティブコントロールとして機能します。これらの細胞のミトコンドリア特異的なDendra2発現のため、FITCチャネルの使用は避けてください。

9. 酸化ストレスや高グルコースに応答するミトコンドリア構造変化のライブセルイメージング

1. 内皮細胞増殖培地を使用して、コラーゲンIVでコーティングされた35 mmガラス底皿に1 x 10⁵ GECをプレートします(材料の表)。24時間後、フェノールレッドを含まない培地に変更します。細胞は緑色の蛍光ミトコンドリアを持っています。
2. 実験開始の1時間前に恒温槽を37°C、湿度5%、_{CO25%に設定} する。
3. 共焦点顕微鏡で、40倍/1.2 Wの対物レンズを使用して焦点を調整し、関心領域を選択します。細胞を2mLの5 mMまたは25 mMグルコースで60分間インキュベートします。
4. 細胞を405 nmレーザー(4%レーザー出力)にさらして、ミトコンドリアの亜集団を緑から赤に光変換します(図5A-B、D-E)。
5. 561 nmレーザーを使用して、変換されていない状態のDendra2を励起し、赤色蛍光を視覚化します。前述のように、詳細な光スイッチングプロトコル^{を参照してください16}。融合イベントは、緑色マトリックスと赤色マトリックス融合のために、数分後に黄色の蛍光として現れます(図4C、F)。

Results

この記事では、安定した蛍光ミトコンドリア(mitoDendra2-GECs)を有する条件付き不死化糸球体内皮細胞を単離するための詳細なプロトコルについて説明します(図1)。若い6〜10週齢のマウスの使用は、かなりの数の健康な細胞を得るために不可欠です。3日間の培養後、 図3Gに示すように、細胞は単離された糸球体からゆっくりと増殖し始めます。7日後、細胞は不均一であり、足細胞、頭頂上皮細胞、およびメサンギウム細胞などの他の糸球体細胞型を示す(図4A)。70%〜80%のコンフルエントに達した後、他の糸球体細胞を、磁気CD31標識ビーズを有する内皮細胞のポジティブセレクションを用いて除去した(図4B−C)。mitoDendra2-GECはCD31を発現し(図4D)、シナプトポジン陰...

Discussion

ミトコンドリアは、細胞の代謝、恒常性、ストレス応答に不可欠であり、その機能不全は腎臓病を含む多くの病気に関連しています。ミトコンドリアは、過剰な活性酸素種(ROS)の病理学的生成、細胞内カルシウムレベルの調節、細胞死経路、および細胞骨格動態に役割を果たしています^21,22,23。

マウスGECの単離は、その数、サイズ、マトリックス因子が少なく、生存に不可欠な他の糸球体細胞との相互依存性のために困難です。現在の記事では、マウスGEC分離の詳細なプロトコルを紹介しています。具体的には、トランスジェニックマウスをツールとして使用し、増殖性の高い条件付き不死化細胞株を取得しました。サルウイルス40(SV40)大型T抗原tsA58を発現するトランスジェニックマウスを、33°Cの許容条件下で連続増殖の活性化を可能にし、ここではミトコンドリア特異的蛍光を発現する PHAM^摘出

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 & マイクロ;m細胞ストレーナー	フィ	ッシャー22-363-549
1mlインスリン注射器	BD	329424
25Gバタフライ	BD	367298
3mm刃先はさみ	F.S.T	15000-00
30ml注射器	BD Biooscience	309650
40 µm細胞ストレーナー	フィ	ッシャー22-363-547
40 & マイクロ;m ナイロンメッシュ
ボン はさみ	F.S.T	14184-09
牛血清アルブミン	フィッシャー	BP1600-100
CD31	abcam	ab7388
コラゲナーゼI型	コーニング	354236
コラゲナーゼII型	SIGMA	C6885	125CDU/mg
IV型コラーゲン	SIGMA	C5533-5M
Dnase-I	Qiagen	79254
Dynabeads 450	Thermofisher Scientific	14013
内皮細胞増殖培地	ロンザ	cc-3156
極細ブドウ鉗子	F.S.T	11150-10
FBS	Gemini	100-106	熱不活性化
フィブロネクチン	サーモフィッシャー	33016015
ファイン フォーセプス	F.S.T Dumont	E6511
HBSS	GIBCO	14065-056
IFNg	Cell Science	CRI001B
Immortomouse	Jackson laboratory	32619	Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ
L-Glutamine 100x	Thermofisher Scientific	25030081
磁性粒子濃縮器	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12320D
マイトトラッカー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	M7512
PBS 1X	コーニング	46-013-CM
ペネシリン ストレプトマイシン 100x	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10378016
PhaM マウス	ジャクソン研究室	18397	B6;129S-GT(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J
プロテアーゼ (10 mg/ml)	SIGMA	P6911
RPMI	GIBCO	3945
ピルビン酸ナトリウム 100mM	サーモフィッシャー サイエンティフィ	11360070
スタンダードパターン鉗子	F.S.T	11000-12
外科用ハサミ - シャープ-ブラント	F.S.T	14008-14
シナプトポジン	サンタクルス	sc-515842
トリプシン 0.05%	サーモフィッシャー サイエンティフィック イシューティフィ	25300054