新生児低酸素性虚血性脳症のラットモデルを用いた脳損傷の早期病理学的および磁気共鳴検出

サマリー

本プロトコルは、肉眼的形態および磁気共鳴画像法による脳組織の早期変化を特定するための新生児低酸素性虚血性損傷のげっ歯類モデルについて説明している。これは、晩期の損傷の研究に使用できる既存のモデルよりも利点がありますが、再現可能な初期の変化を評価することはできません。

要約

周産期低酸素性虚血性脳症 (HIE) は、新生児を苦しめる可能性のある急性疾患であり、長期および短期の神経発達転帰にばらつきをもたらします。早期診断は、介入の恩恵を受ける可能性のある乳児を特定するために重要です。ただし、早期診断は臨床基準に大きく依存します。分子学的または放射線学的検査は、早期の脳損傷を検出するのに有望であることを示していません。研究によると、磁気共鳴画像法(MRI)は、血流/虚血と代謝障害の両方の変化を示すことができます。ただし、それらはすべて、損傷の発症後の病気の二次段階 (>12 時間) を評価するために使用されています。早期診断は、適格な乳児の治療的低体温療法を迅速に開始するために重要であり、現在、生後6時間以内に開始することが推奨されています。低酸素性虚血性損傷のラットモデルは1981年に開発され、脳灌流、脳損傷マーカー、および形態の変化を研究するために検証され、広く使用されています。しかし、それは主に「後期モデル」として使用され、最初の虚血性傷害の数日後に損傷を評価してきました。このモデルは、信頼性が高く再現性のある初期の脳の変化を評価する際の感度が低いことが知られています。この研究の目的は、病理学的染色と脳磁気共鳴画像法/磁気共鳴分光法を使用して、HIEの初期肉眼的形態学的および放射線学的マーカーを研究するための信頼性の高いモデルを開発することでした。

概要

低酸素性虚血性脳症(HIE)は、新生児のさまざまな要因に起因する壊滅的な状態です¹。周産期の窒息および/または脳血流の混乱は、脳に局所的または全体的な虚血性変化をもたらす可能性があります².発生率は出生1,000人に約1.6人ですが、開発途上国では出生1,000人に12.1人にもなることもあります³。この状態は高い死亡率(20%-50%)をもたらしますが、生存した人の25%は、精神遅滞、てんかん、脳性麻痺などの長期的な神経障害に苦しむ可能性があります⁴。軽度から中等度の傷害に有効であることが証明されている唯一の治療的介入は、生後6時間以内に開始しなければならない治療的低体温症です^5,6,7,8,9。これは、二次的な損傷につながる代謝変化を防ぐのに役立つかもしれませんが、低血圧、血小板減少症、凝固時間の延長、頭蓋内出血、不整脈、脂肪壊死、血清電解

プロトコル

すべての実験手順は、オクラホマ医学研究財団(OMRF)の施設内動物管理および使用委員会(プロトコルIACUC #17-17)によって承認されました。E14の妊娠中の雌Sprague-Dawleyラットの子ラットを本研究に使用しました。動物は商業的な供給源から入手しました( 資料の表を参照)。

1.動物の調理

1. 同腹児の配達前に、動物施設で動物を順応させます。
2. すべてのラットを12時間のライト/ダークサイクルに維持し、標準のラットに餌を与えます。
3. 同腹児の出産後、子犬はそれぞれのダムで飼ってください。実験には男女両方を使用します。
4. 出生後10歳(P10)で、子犬を偽グループまたはHIEグループのいずれかに無作為に割り付けます。
   注:実験のタイムラインを 図1に示します。すべての実験は同日にP10で行われました。

2. 実験的HIE群の頸動脈結紮術(CAL)

1. ラットの子犬をウォーミングパッドの上に置きます。
2. ピンチ反射が消えるまで、鼻円錐形を使用して、酸素....

結果

HIE後の早期脳変化を生じさせ、評価するための現在のプロトコルは、実施が容易であり、P10のラット仔における仔ラットの傷害から6時間以内の脳損傷の肉眼的病理学的および放射線学的視覚化を可能にした。実験計画を 図 1 に示します。雌雄を合わせて解析し、各群で5匹の同腹児から24匹を調べました。動物の死亡率は非常に低く、最終実験が行われるまで動物の生存率は99%でした。

虚血の領域は、TCCで染色された脳切片上のCALおよび低酸素症の6時間後に明確に視覚化されます。これらの病変は、 図 2 に示されているように、汚れのない透明な白い損傷領域として見られます。TCCの心臓灌流は、損傷を視覚化するためのサンプルには必要ありませんでした。多くの動物は、梗塞の複数の領域が示されていました。大多数は脳の皮質表面にありました。

脳の結紮側でのMR灌流は、脳の対側または非外科的側の灌流と比較して減少しました。HIE群の結紮側の.......

ディスカッション

新生仔ラットの子犬を対象とした研究プロトコルは、HIEにおける脳損傷の初期マーカーを視覚化し、分析するために成功裏に設計されました。今日まで、新生児集団の早期脳損傷を検出するための客観的な評価ツールが不足しています。HI損傷後、脳の酸化代謝の障害がミトコンドリア機能の障害¹⁹の前に部分的に回復する可能性のある段階(1〜6時間)があり、これは不可逆的です。この潜伏期は、低体温療法⁶などの神経保護的介入の治療ウィンドウです。ほとんどの公開された臨床試験は、最初の^{6時間以内}の治療開始を提唱しています^5,7、そしてほとんどの施設はそれ以降のこの治療を提供していません。ただし、冷却は深刻な悪影響の可能性があるため、選択的に使用する必要があります²⁰。これらには、不整脈、低血圧、血小板機能障害および血小板減少症、持続性肺高血.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.9% 生理食塩水	フィッシャー サイエンティフィック	Z1376
2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム クロリド (TTC)	ミリポア シグマ	T8877
腹部空気圧枕	SA Instruments, Inc., Stony Brook, NY
防水防湿バリア付き吸収性アンダーパッド、58.4 x 91.4 cm、680 mL	フィッシャー サイエンティフィック	501060566
BD 30 G針と注射器	フィッシャーサイエンティフィック	カタログNo.14-826-10
バイオスペック 7.0テスラ/30cm水平ボアマグネット小動物イメージングシステム	ブルカーバイオスピン、エットリンゲン、ドイツ
ブプレノルフィン			獣医学提供
プローブ付きコンパクト温度計	フィッシャーサイエンティフィック	S01549
ガス混合物92% 窒素8% 酸素	エアガス
ヘッド表面コイル	Bruker BioSpin MRI Gmbh, Ettlingen, Germany
イソフルランガス			獣医学提供
Isotemp Immersion Circulator 2100	フィッシャーサイエンティフィ	製造中止	チューブを介して連続的に流れる水で水浴室に浸漬
リードリング フラスコウェイト	VWR	29700-060	げっ歯類の部屋が水浴に沈められたままであることを確認するためのウォーターバスウェイト
Mathematica Software	Wolfram Research、シャンペーン、イリノイ州、米国	バージョン6.0
Pedialyte Electrolyte Solution, Hydration Drink, 1 Liter, Unflavored	Pedialyte		CVS
Phosphate-buffered saline (DPBS, 1X), Dulbecco's formula	Millipore Sigma	J67670.AP
プラスチッククリアバケツ			私たちは古いげっ歯類のハウジングケージを使用しました-これは良い代替品です:Cambro 182615CW135 Camwear食品収納ボックス、18 "X 26" X 15 "、モデル#:182615CW135
プレキシガラスげっ歯類拘束チャンバーPedialyte	/ CVS		Vetinary医学は、げっ歯類を拘束するために使用される小さなチャンバーを提供しました。
チャールズ川	ひずみコード400		妊娠中のSprague Dawleyラット
ベタジンスワブスティック	フィッシャーサイエンティフィック	19-061617
直交ボリュームコイル(内径72 mm)	Bruker BioSpin MRI Gmbh, Ettlingen, Germany
Stoelting Silk Suture	Fisher Scientific	Catalog No.10-000-656
Vicryl 5-0 suture	Fisher Scientific

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