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方法論記事

新生児低酸素性虚血性脳症のラットモデルを用いた脳損傷の早期病理学的および磁気共鳴検出

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DOI：

10.3791/64183

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2022年10月28日

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1Department of Pediatrics, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Chemistry, University of Prince Edward Island, 3Center for Neuroscience, University of Oklahoma Health Sciences Center, 4Oklahoma Medical Research Foundation

この記事について

サマリー

本プロトコルは、肉眼的形態および磁気共鳴画像法による脳組織の早期変化を特定するための新生児低酸素性虚血性損傷のげっ歯類モデルについて説明している。これは、晩期の損傷の研究に使用できる既存のモデルよりも利点がありますが、再現可能な初期の変化を評価することはできません。

要約

周産期低酸素性虚血性脳症 (HIE) は、新生児を苦しめる可能性のある急性疾患であり、長期および短期の神経発達転帰にばらつきをもたらします。早期診断は、介入の恩恵を受ける可能性のある乳児を特定するために重要です。ただし、早期診断は臨床基準に大きく依存します。分子学的または放射線学的検査は、早期の脳損傷を検出するのに有望であることを示していません。研究によると、磁気共鳴画像法(MRI)は、血流/虚血と代謝障害の両方の変化を示すことができます。ただし、それらはすべて、損傷の発症後の病気の二次段階 (>12 時間) を評価するために使用されています。早期診断は、適格な乳児の治療的低体温療法を迅速に開始するために重要であり、現在、生後6時間以内に開始することが推奨されています。低酸素性虚血性損傷のラットモデルは1981年に開発され、脳灌流、脳損傷マーカー、および形態の変化を研究するために検証され、広く使用されています。しかし、それは主に「後期モデル」として使用され、最初の虚血性傷害の数日後に損傷を評価してきました。このモデルは、信頼性が高く再現性のある初期の脳の変化を評価する際の感度が低いことが知られています。この研究の目的は、病理学的染色と脳磁気共鳴画像法/磁気共鳴分光法を使用して、HIEの初期肉眼的形態学的および放射線学的マーカーを研究するための信頼性の高いモデルを開発することでした。

概要

低酸素性虚血性脳症(HIE)は、新生児のさまざまな要因に起因する壊滅的な状態です1。周産期の窒息および/または脳血流の混乱は、脳に局所的または全体的な虚血性変化をもたらす可能性があります2.発生率は出生1,000人に約1.6人ですが、開発途上国では出生1,000人に12.1人にもなることもあります3。この状態は高い死亡率(20%-50%)をもたらしますが、生存した人の25%は、精神遅滞、てんかん、脳性麻痺などの長期的な神経障害に苦しむ可能性があります4。軽度から中等度の傷害に有効であることが証明されている唯一の治療的介入は、生後6時間以内に開始しなければならない治療的低体温症です5,6,7,8,9。これは、二次的な損傷につながる代謝変化を防ぐのに役立つかもしれませんが、低血圧、血小板減少症、凝固時間の延長、頭蓋内出血、不整脈、脂肪壊死、血清電解質の不均衡などの副作用の可能性もあります4,5。赤ちゃんのHIEの早期診断は、基準が主観的であり、時間とともに進化する身体検査の結果に大きく依存しているため、しばしば困難です。磁気共鳴画像法は、損傷の数日から数週間後に損傷を反映した変化を示す場合があります。しかし、T1/T2 MRIの形態学的変化は、治療的低体温療法の恩恵を受ける可能性が最も高い乳児のカテゴリーである中等度の脳症の最大3分の2で正常である可能性がある10。最近の報告によると、磁気共鳴分光法(MRS)は、新生児のHIE11と相関する初期の変化を示す可能性があります。しかし、これまで標準化や検証は行われていません。

多くの研究者は、脳血管損傷に対する潜在的な診断的または治療的介入を評価するために動物モデルに依存しています。梗塞を作成するために最も頻繁に使用される方法は、げっ歯類の中大脳動脈12,13を結紮することです。成人の虚血性脳卒中の研究によく使用されますが、これは新生児のげっ歯類では、人間の新生児疾患と同等の年齢の子犬のサイズが小さく、もろいため、技術的に困難です。さらに、HIEで見られる可能性のある全体的な脳虚血性変化を表すものではありません。ラットの片側頸動脈結紮術のRice-Vanucciモデル14は、1980年代から低酸素性虚血性脳損傷を研究するための費用対効果の高いげっ歯類モデルとして使用されてきました。しかし、初期の脳血管の変化には大きなばらつきがあり、以前の実験では死亡率が高かった。ほとんどの研究では、脳損傷は長期的な変化(つまり、損傷の24時間後)で報告されており、これはより一貫しています。この研究は、HIEのラットモデルにおける早期(6時間以内)の分子的および放射線学的変化を評価するアプローチを開発することを目的としていました。このプロトコルは、早期(新生児相当)の年齢で虚血を確保し、特に低酸素症への曝露中に子犬の生存率を高めるように設計されました。MRI/MRS を使用して、損傷から 6 時間以内の流れの変化、脳組織の変化、および代謝の変化の放射線学的証拠を評価しました。梗塞領域の肉眼的形態学的評価も行われた。さらに、複数の同腹仔で実験を繰り返すことにより、再現性の検証を行いました。

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プロトコル

すべての実験手順は、オクラホマ医学研究財団(OMRF)の施設内動物管理および使用委員会(プロトコルIACUC #17-17)によって承認されました。E14の妊娠中の雌Sprague-Dawleyラットの子ラットを本研究に使用しました。動物は商業的な供給源から入手しました( 資料の表を参照)。

1.動物の調理

  1. 同腹児の配達前に、動物施設で動物を順応させます。
  2. すべてのラットを12時間のライト/ダークサイクルに維持し、標準のラットに餌を与えます。
  3. 同腹児の出産後、子犬はそれぞれのダムで飼ってください。実験には男女両方を使用します。
  4. 出生後10歳(P10)で、子犬を偽グループまたはHIEグループのいずれかに無作為に割り付けます。
    注:実験のタイムラインを 図1に示します。すべての実験は同日にP10で行われました。

2. 実験的HIE群の頸動脈結紮術(CAL)

  1. ラットの子犬をウォーミングパッドの上に置きます。
  2. ピンチ反射が消えるまで、鼻円錐形を使用して、酸素中の4%イソフルラン(0.6 LPM)で麻酔を開始します。.麻酔を維持するために、ガスの流れを0.5%〜2%に落とします。呼吸ドライブを抑制せずに、子犬が意識を失っていることを確認します。
  3. 識別のために尾に子犬をマークし、4本の手足すべてにテープで優しく拘束します。
  4. 首の部分を剃り、70%ヨウ素-ポビドン溶液スワブで滅菌します( 材料の表を参照)。
  5. #11ブレードを使用して、皮膚に1cmの正中線の首を切開します。左耳下腺と筋膜を慎重に解剖し、左頸動脈が露出するまで観察します。止血剤を使用して血管を穏やかに動員し、筋膜から血管を解放します。
  6. 小さな止血剤を使用して、2つの5-0縫合糸( 材料の表を参照)を血管の周りに0.5cm離して慎重に通し、しっかりと結びます。
  7. 小さなハサミを使用して、2つの縫合糸の間に動脈を切断し、血流の不連続性を確保します。5-0シルク縫合糸で皮膚と筋膜を閉じます( 材料の表を参照)。
  8. ブプレノルフィン(滅菌生理食塩水800μLに10単位)を腹腔内に注入し、さらに800μLの生理食塩水を首の後ろに皮下注射して脱水症状を防ぎます。.
    注意: 手順は10〜12分以内に完了する必要があります。
  9. 子犬をダムのあるケージに戻し、子犬が目覚めて1〜2時間回復するのを待ちます。

3.対照群の偽の外科的処置

  1. ラットの子犬をウォーミングパッドの上に置きます。
  2. ピンチ反射が消えるまで、鼻円錐形を使用して、酸素中の4%イソフルラン(0.6 LPM)で麻酔を開始します。.麻酔を維持するために、ガスの流れを0.5%〜2%に落とします。呼吸ドライブを抑制せずに、子犬が意識を失っていることを確認します。
  3. 識別のために尾に子犬をマークし、4本の手足すべてにテープで優しく拘束します。
  4. 首の部分を剃り、70%ヨウ素-ポビドン溶液スワブで滅菌します。
  5. #11ブレードを使用して、皮膚に1cmの正中線の首を切開し、次に5-0シルク縫合糸で閉じます。
  6. HIグループと同じ水分補給、鎮痛、術後ケアを行います(ステップ2.8-2.9)。

4. CAL群と偽群の両方に対する低酸素曝露

  1. 透明なプレキシガラス製低酸素チャンバー( 材料の表を参照)を準備し、チャンバーの蓋にチューブを取り付けて、6 LPMの低酸素ガス混合物(8%酸素、92%窒素)の連続的な空気の流れを提供します。
  2. チャンバー内に青色の吸収パッドを置き、すぐに両方のグループのラットの子ラットをチャンバーに入れます。子犬を低酸素チャンバーに45分間留まらせます。
  3. チャンバー内を37°Cに設定した温度に保つために、連続的に流れる温水を含むウォーターバスにチャンバーを浸します。
  4. 子犬を経口生理食塩水で経口生理食塩水で水和させてから600μLで低酸素チャンバーに入れ、45分の終わりに600μLで水和させます。
  5. すべての子犬をダム(実験的および偽)のあるケージに移し、小動物イメージング施設の隣の部屋で2時間回復させます。

5. 磁気共鳴画像法・分光法

  1. MRIおよびMRSを実行して、頸動脈結紮の終了から4時間後に放射線マーカーと代謝マーカーを特定および評価します。小動物イメージング施設で継続的な心血管モニタリングを行いながら麻酔下で施術を行います。
  2. 各動物(1.5%イソフルランと0.7L / min酸素)を麻酔し、加熱パッドを覆う青い吸収パッドの仰臥位でMRプローブ( 材料の表を参照)に置きます。腹部の空気圧枕を使用して、動物の呼吸数を継続的に監視します( 材料の表を参照)。
  3. ヘッド表面コイルを信号受信機として使用し、直交ボリュームコイル(内径72 mm、 材料表を参照)を介して無線周波数パルスをサンプルに送信します。
  4. MRI を実行して、以前に発表された方法による脳血流 (CBF) の変化と水拡散定数 (ADC) の変化の両方を評価します 15,16,17。MRIの形態(T1およびT2)、拡散、および灌流を実行して、脳の最も影響を受けた領域と最も灌流されていない領域を特定します。
    注: 各グループの灌流拡散 (ADC) の平均値は、結紮側と対照側 (無傷の頸動脈側) で比較されます。
  5. 以前に公開された方法15,17に従ってMRSを実行し、Mathematicaソフトウェアを使用して社内のコード化されたプログラムを使用して分析します(資料の表を参照)。
  6. MRスペクトルを100万分の1(ppm)でスケーリングするには、水のピーク(4.78 ppm)に対してキャリブレーションします。主要な脳代謝ピークは、2.02 ppm の N-アセチルアラギン酸 (NAA)、3.22 ppm のコリン(Cho)、3.02 ppm のクレアチン(Cr)、3.53 ppm のミオイノシトールです。
    注:代謝産物のピーク面積測定値は、NAAとCho(NAA/Cho)、CrとCho(Cr/Cho)、およびMyo-InsとCho(Myo-Ins/Cho)の比率を計算するために使用されます15。

6. 血清・脳組織解析

  1. 頸動脈結紮または偽手術の5.5時間後に、以前に公開された方法18に従って採血を行う。
  2. 4%イソフルランで子犬に再度麻酔をかけます。
  3. 鋭利な#11ブレードを使用して腹部を切開し、続いて横隔膜を切開して心臓を露出させます。
  4. 前述のように心臓穿刺 による 採血を行う18.簡単に言えば、1 mLのシリンジに32 Gの針を右の心室に挿入し、1 mLの血液を穏やかに吸引します。
  5. 全血を凝固させた後、1,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。 血清はきれいな微量遠心チューブに分離されます。
  6. 脳の病理の肉眼的評価のために子犬の頭全体を斬首し、次にそれを氷に2分間浸します。
  7. 頭蓋骨の付け根から鼻先にかけて背側の頭皮を切開し、脳の周りから頭蓋骨を剥がします。無傷の全脳をきれいなペトリ皿に移します。
  8. 脳の右側に無毒のマーカーで印を付けます。頭側筋の表面を上に向けて脳を配置し、両方の半球が見えるようにします。氷のように冷たいカミソリの刃を使用して、脳を冠状面に平行な4つの等しいセクションにスライスします。
  9. 光増感を防ぐためにホイルで覆われたシャーレ内の2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC、 材料表を参照)溶液に脳切片を浸し、37°Cで15分間インキュベートします。
    注:梗塞領域は、赤いTTC染色のない白い領域として描かれています。
  10. 梗塞が微妙または検出が難しい場合は、腹部切開および開胸術後に、リン酸緩衝生理食塩水に0.5〜1 mLのTTC(1%)を直接右心臓に注入し、子犬の斬首前に2分間灌流します。
  11. さらに分析が必要な場合は、脳組織と血清を-80°Cで保存してください。

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結果

HIE後の早期脳変化を生じさせ、評価するための現在のプロトコルは、実施が容易であり、P10のラット仔における仔ラットの傷害から6時間以内の脳損傷の肉眼的病理学的および放射線学的視覚化を可能にした。実験計画を 図 1 に示します。雌雄を合わせて解析し、各群で5匹の同腹児から24匹を調べました。動物の死亡率は非常に低く、最終実験が行われるまで動物の生存率は99%でした。

虚血の領域は、TCCで染色された脳切片上のCALおよび低酸素症の6時間後に明確に視覚化されます。これらの病変は、 図 2 に示されているように、汚れのない透明な白い損傷領域として見られます。TCCの心臓灌流は、損傷を視覚化するためのサンプルには必要ありませんでした。多くの動物は、梗塞の複数の領域が示されていました。大多数は脳の皮質表面にありました。

脳の結紮側でのMR灌流は、脳の対側または非外科的側の灌流と比較して減少しました。HIE群の結紮側の...

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ディスカッション

新生仔ラットの子犬を対象とした研究プロトコルは、HIEにおける脳損傷の初期マーカーを視覚化し、分析するために成功裏に設計されました。今日まで、新生児集団の早期脳損傷を検出するための客観的な評価ツールが不足しています。HI損傷後、脳の酸化代謝の障害がミトコンドリア機能の障害19の前に部分的に回復する可能性のある段階(1〜6時間)があり、これは不可逆的です。この潜伏期は、低体温療法6などの神経保護的介入の治療ウィンドウです。ほとんどの公開された臨床試験は、最初の6時間以内の治療開始を提唱しています5,7、そしてほとんどの施設はそれ以降のこの治療を提供していません。ただし、冷却は深刻な悪影響の可能性があるため、選択的に使用する必要があります20。これらには、不整脈、低血圧、血小板機能障害および血小板減少症、持続性肺高血...

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開示事項

著者のいずれにも利益相反はありません。

謝辞

オクラホマ医学研究財団の獣医スタッフには、動物管理プロトコルの変更に関する専門知識と支援に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.9% 生理食塩水フィッシャー サイエンティフィックZ1376
2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム クロリド (TTC)ミリポア シグマT8877
腹部空気圧枕SA Instruments, Inc., Stony Brook, NY
防水防湿バリア付き吸収性アンダーパッド、58.4 x 91.4 cm、680 mLフィッシャー サイエンティフィック501060566
BD 30 G針と注射器フィッシャーサイエンティフィックカタログNo.14-826-10
バイオスペック 7.0テスラ/30cm水平ボアマグネット小動物イメージングシステムブルカーバイオスピン、エットリンゲン、ドイツ
ブプレノルフィン獣医学提供
プローブ付きコンパクト温度計フィッシャーサイエンティフィックS01549
ガス混合物92% 窒素8% 酸素エアガス
ヘッド表面コイルBruker BioSpin MRI Gmbh, Ettlingen, Germany
イソフルランガス獣医学提供
Isotemp Immersion Circulator 2100フィッシャーサイエンティフィ製造中止チューブを介して連続的に流れる水で水浴室に浸漬
リードリング フラスコウェイトVWR29700-060げっ歯類の部屋が水浴に沈められたままであることを確認するためのウォーターバスウェイト
Mathematica SoftwareWolfram Research、シャンペーン、イリノイ州、米国バージョン6.0
Pedialyte Electrolyte Solution, Hydration Drink, 1 Liter, UnflavoredPedialyteCVS
Phosphate-buffered saline (DPBS, 1X), Dulbecco's formulaMillipore SigmaJ67670.AP
プラスチッククリアバケツ私たちは古いげっ歯類のハウジングケージを使用しました-これは良い代替品です:Cambro 182615CW135 Camwear食品収納ボックス、18 "X 26" X 15 "、モデル#:182615CW135
プレキシガラスげっ歯類拘束チャンバーPedialyte/ CVSVetinary医学は、げっ歯類を拘束するために使用される小さなチャンバーを提供しました。
チャールズ川ひずみコード400妊娠中のSprague Dawleyラット
 ベタジンスワブスティックフィッシャーサイエンティフィック19-061617
直交ボリュームコイル(内径72 mm)Bruker BioSpin MRI Gmbh, Ettlingen, Germany
Stoelting Silk SutureFisher ScientificCatalog No.10-000-656
Vicryl 5-0 sutureFisher Scientific 
ック E14パデュー製品で約6x4x4インチのNC1985424

参考文献

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