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聴覚回路における脆弱X精神遅滞タンパク質の細胞自律機能をIn Ovo エレクトロポレーション法で解剖

DOI:

10.3791/64187

⸱

July 6th, 2022

 ,  ,  , 
1Division of Histology & Embryology, Key Laboratory for Regenerative Medicine of the Ministry of Education, College of Medicine, Jinan University, 2Department of Clinical Pathology, First Affiliated Hospital of Jinan University, 3Program in Neuroscience, Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

In This Article

Summary

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ovoエレクトロポレーションを用いて、ニワトリ胚の聴覚内耳と蝸牛核を選択的にトランスフェクションし、回路アセンブリの離散期に脆弱X精神遅滞タンパク質の細胞群特異的ノックダウンを達成する方法を考案しました。

Abstract

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脆弱X精神遅滞タンパク質(FMRP)は、局所タンパク質翻訳を調節するmRNA結合タンパク質です。FMRPの喪失または機能障害は、知的障害、感覚異常、および社会的コミュニケーションの問題を特徴とする脆弱X症候群(FXS)において、異常なニューロンおよびシナプス活動につながります。FMRP機能とFXSの病因の研究は、主にトランスジェニック動物における Fmr1 (FMRPをコードする遺伝子)ノックアウトで行われています。ここでは、ニワトリ胚を用いた回路形成期およびシナプス形成期におけるFMRPの細胞自律機能を決定するための in vivo 法について報告する。この方法は、 Fmr1 低分子ヘアピンRNA(shRNA)とEGFPレポーターを含む薬物誘導性ベクターシステムのステージ、部位、および方向特異的エレクトロポレーションを使用します。この方法では、聴神経節(AG)とその脳幹標的の1つであるマグノセルラリス核(NM)で選択的なFMRPノックダウンを達成し、AG-NM回路内で成分特異的な操作を提供しました。さらに、トランスフェクションのモザイクパターンにより、動物内コントロールや隣接するニューロン/ファイバーの比較が可能になり、データ解析の信頼性と感度が向上します。誘導ベクターシステムは、遺伝子編集開始の時間的制御を提供し、蓄積された発生効果を最小限に抑えます。これらの戦略の組み合わせは、シナプスおよび回路発生におけるFMRPの細胞自律機能を解剖するための革新的なツールを提供します。

Introduction

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脆弱X症候群(FXS)は、知的障害、感覚異常、自閉症行動を特徴とする神経発達障害です。ほとんどの場合、FXSは、初期胚期1から始まる脆弱なX精神遅滞タンパク質(FMRP;Fmr1遺伝子によってコードされる)の全体的な喪失によって引き起こされます。FMRPはRNA結合タンパク質であり、通常、脳内のほとんどのニューロンおよびグリア細胞、ならびに感覚器官において発現される2,3,4。哺乳類の脳では、FMRPは、さまざまな神経活動に重要なタンパク質をコードする数百のmRNAに関連している可能性があります5。従来のFmr1ノックアウト動物の研究は、FMRP発現がシナプス神経伝達の集合および可塑性にとって特に重要であることを示した6。いくつかの条件付きおよびモザイクノックアウトモデルは、軸索投影、樹状突起パターニング、およびシナプス可塑性を含むいくつかの発生イベント中に、FMRPアクションおよびシグナルが脳領域、細胞型、およびシナプス部位間で異なることをさらに示しています7,8,9,10,11,12,13,14 ....

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Protocol

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卵と鶏の胚は、済南大学動物管理使用委員会によって承認された動物プロトコルに従って、注意と敬意を持って取り扱われました。

1.卵とプラスミドの調製

  1. 卵の準備
    1. 華南農業大学から新鮮な受精鶏卵(Gallus gallus)を入手し、孵卵前に16°Cで保存します。最適な生存率のために、到着後1週間以内にすべての卵を孵卵のために設定してください。
    2. 卵を水平に置き、神経管トランスフェクションの場合はハンバーガーとハミルトン(HH)のステージ1225 まで、耳嚢胞トランスフェクションの場合はHH13まで54〜56時間、38°Cで46〜48時間インキュベートします。卵の動物の棒は植物の棒よりも軽いので、水平に配置すると、操作が簡単になるように胚が卵の上に配置されます。この手順とそれに続くすべての手順で卵を水平に保つように注意してください。
    3. 胚の位置は、懐中電灯を使用して卵の底から光を当てると、卵殻の暗い領域として表示されます。目的のHH段階で、この懐中電灯法を使用して、卵殻上の胚の位置を鉛筆でマークします。
    4. 75%エタノールを含むガーゼで卵を拭きます。はさみの先端を使用して卵の先のとがった端に穴を開け、18 Gの針注射器で2 mLのアルブミンを取り除きます。穴が針を挿入できるのに十分な大きさであ....

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Results

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異なる部位および異なる発生段階で ovo エレクトロポレーションを行うことにより、聴覚末梢または聴覚脳幹のいずれかで選択的FMRPノックダウンを達成しました。

NM での FMRP ノックダウン
ニワトリFmr1に対する低分子ヘアピンRNA(shRNA)を設計し、前述のようにTet-Onベクター系にクローニングした20。 inovoエレクトロポレーションのセットアップを図1Aに示します。高速緑色に着色されたプラスミドDNAを、HH12のr5/r6レベルで神経管に注入しました(図1B-C)。白金バイポーラ電極を神経管の両側にr5/6レベルで配置しました(図1D)。12 Vで2つのパルスを送達して、プラ.......

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Discussion

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FMRPの細胞自律機能を決定するためには、個々の細胞群または細胞型におけるFMRPの発現を操作する必要があります。FMRPの主要な機能の1つはシナプス形成と可塑性を制御することであるため、特定の回路の各シナプスコンポーネントを選択的に操作することは、シナプス通信におけるFMRPメカニズムを完全に理解するための前提条件です。ニワトリ胚のovoエレクトロポレーションを用いて、シナプス前AGニューロンまたはシナプス後NMニューロンのいずれかのAG-NM回路におけるFMRP発現を標的とする方法を実証しました。これを達成するためには、エレクトロポレーションに適した発生段階を選択し、エレクトロポレーション電極を胚に正確に配置することが重要なステップです。NMニューロンは、HH1223でr5 / 6レベルで神経管内の神経前駆細胞から生じる。同じ段階で、脳神経堤細胞は、神経管の背側先端から蝸牛前庭神経節に移動し、将来のAGニューロン33を包み込む。したがって、AG内のNMニュ.......

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Disclosures

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著者は開示するものは何もありません。

Acknowledgements

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この研究は、中国国家自然科学基金会の助成金(No.32000697)によってサポートされました。広州の科学技術プログラム(202102080139);広東自然科学財団(2019A1515110625、2021A1515010619);中央大学の基礎研究費(11620324)済南大学教育部再生医療重点研究所研究助成(No.ZSYXM202107);中国中央大学の基礎研究基金(21621054);中国広東省医学科学研究財団(20191118142729581)。済南大学の医学実験センターに感謝します。原稿を注意深く編集してくれたテラ・ブラッドリー博士に感謝します。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
卵の孵化
16 °C冷蔵庫MAGAT精卵の保管に使用されます。
卵インキュベーターSHANGHAI BOXUNGZX-9240MBE
受精卵中国南部農業大学の農場 卵は、最適な生存率のために1週間で使用する必要があります。
プラスミド調製
遠心分離機 Sigma10016
Fast greenSolarbioG1661蒸留水とオートクレーブで0.1%の作業溶液を作ります。
プラスミドマキシプレップキットQIAGEN12162プラスミドDNAをTris-EDTA(TE)バッファーに溶解します; エンドトキシンフリー調製キット
酢酸ナトリウムSigma-AldrichS2889ヌクラーゼフリー水で7.5Mのワーキングソリューションを作ります。
エレクトロポレーションおよびドキシサイクリン投与
エレクトロポレーターBTXECM399
1 mL / 5 mLシリンジ州KANGFULAI
解剖顕微鏡CNOPTECSZM-42
DoxcyclineSigma-AldrichD9891各用量に新鮮なアリコートを使用し、-20 &度;C.
ガラス毛細管BEIBOBOMEIRD09100.9-1.1 mm * 100 mm
実験室パラフィルムPARAFILMPM996透明フィルム
ピペットプーラー成都楽器工場WD-2っ張り条件:500°;15 s
プラチナ エルクトロードホーム製直径 0.5 mm、間隔 1.5 mm
ゴムチューブSigma-AldrichA5177
Tissue Dissection and Fixation
ForcepsRWDF11020-11チップサイズ:0.05*0.01 mm
その他の手術ツールRWD
パラホルムアルデヒドSigma-Aldrich158127リン酸緩衝生理食塩水に新たに調製した4%PFA溶液は、4°Cで保存できます。Cは最大1週間。
SYLGARD 184 シリコーン エラストマー キットダウ01673921黒の背景プレートには、食品グレードのカーボン パウダーが塗布されています。
セクショニング
クライオスタットLEICACM1850
ゼラチンSigma-AldrichG9391ウシの皮膚から。
スライド式ミクロトームLEICASM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウスAbcamab1501131:500 希釈、RRID:
AB_2576208 Alexa Fluor 555 ヤギ抗ウサギAbcamab1500781:500 希釈、RRID: AB_2722519
DAPIAbcamab2853901: 1000希釈
フルオロマウント-G 封入用メディウムサザン BiotechSb-0100-01
FMRP抗体Y. Wang, Florida State University#82631:1000 希釈, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibodyDSHB39.3F71:100 希釈, RRID: AB_1157901
Netwell plateCorning3478
Neurofilament antibodySigma-AldrichN41421:1000 希釈, RRID: AB_477272
パルブアルブミン抗体Sigma-AldrichP30881:10000希釈、RRID:AB_477329
SNAP25抗体Abcamab660661:1000希釈、RRID:
AB_2192052Imaging
Adobe photoshopADOBE画像編集ソフト
共焦点顕微鏡LEICASP8
蛍光実体顕微鏡OLYMPUSMVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0OlYMPUS商用画像処理ソフトウェアパッケージ
受広引 の C

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065(2017).
  2. Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1....

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Fragile X SyndromeFMRP KnockdownIn Ovo ElectroporationAuditory CircuitChicken EmbryoSmall Hairpin RNAEGFP ReporterAuditory GanglionNucleus MagnocellularisNeural Tube Transfection

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