聴覚回路における脆弱X精神遅滞タンパク質の細胞自律機能をIn Ovo エレクトロポレーション法で解剖

サマリー

ovoエレクトロポレーションを用いて、ニワトリ胚の聴覚内耳と蝸牛核を選択的にトランスフェクションし、回路アセンブリの離散期に脆弱X精神遅滞タンパク質の細胞群特異的ノックダウンを達成する方法を考案しました。

要約

脆弱X精神遅滞タンパク質(FMRP)は、局所タンパク質翻訳を調節するmRNA結合タンパク質です。FMRPの喪失または機能障害は、知的障害、感覚異常、および社会的コミュニケーションの問題を特徴とする脆弱X症候群(FXS)において、異常なニューロンおよびシナプス活動につながります。FMRP機能とFXSの病因の研究は、主にトランスジェニック動物における Fmr1 (FMRPをコードする遺伝子)ノックアウトで行われています。ここでは、ニワトリ胚を用いた回路形成期およびシナプス形成期におけるFMRPの細胞自律機能を決定するための in vivo 法について報告する。この方法は、 Fmr1 低分子ヘアピンRNA(shRNA)とEGFPレポーターを含む薬物誘導性ベクターシステムのステージ、部位、および方向特異的エレクトロポレーションを使用します。この方法では、聴神経節(AG)とその脳幹標的の1つであるマグノセルラリス核(NM)で選択的なFMRPノックダウンを達成し、AG-NM回路内で成分特異的な操作を提供しました。さらに、トランスフェクションのモザイクパターンにより、動物内コントロールや隣接するニューロン/ファイバーの比較が可能になり、データ解析の信頼性と感度が向上します。誘導ベクターシステムは、遺伝子編集開始の時間的制御を提供し、蓄積された発生効果を最小限に抑えます。これらの戦略の組み合わせは、シナプスおよび回路発生におけるFMRPの細胞自律機能を解剖するための革新的なツールを提供します。

概要

脆弱X症候群(FXS)は、知的障害、感覚異常、自閉症行動を特徴とする神経発達障害です。ほとんどの場合、FXSは、初期胚期¹から始まる脆弱なX精神遅滞タンパク質(FMRP;Fmr1遺伝子によってコードされる)の全体的な喪失によって引き起こされます。FMRPはRNA結合タンパク質であり、通常、脳内のほとんどのニューロンおよびグリア細胞、ならびに感覚器官において発現される^2,3,4。哺乳類の脳では、FMRPは、さまざまな神経活動に重要なタンパク質をコードする数百のmRNAに関連している可能性があります⁵。従来のFmr1ノックアウト動物の研究は、FMRP発現がシナプス神経伝達の集合および可塑性にとって特に重要であることを示した⁶。いくつかの条件付きおよびモザイクノックアウトモデルは、軸索投影、樹状突起パターニング、およびシナプス可塑性を含むいくつかの発生イベント中に、FMRPアクションおよびシグナルが脳領域、細胞型、およびシナプス部位間で異なることをさらに示しています7,8,9,10,11,12,13,14 .シナプス伝達の調節におけるFMRPの急性機能は、脳スライスまたは培養ニューロンにおける阻害性FMRP抗体またはFMRP自体の細胞内送達によって研究された¹⁵、^16、17、18。ただし、これらの方法では、開発中にFMRPの誤発現が引き起こす結果を追跡する機能はありません。したがって、FMRPの細胞自律機能を調査するためのin vivoメソッドの開発は非常に必要であり、FXS患者で報告された異常が関連するニューロンおよび回路におけるFMRP喪失の直接的な結果であるか、または開発中のネットワーク全体の変化に由来する二次的な結果であるかを決定するのに役立つと期待されています¹⁹。

ニワトリ胚の聴覚脳幹は、回路およびシナプスの発生におけるFMRP調節の詳細な機能解析のための独自の有利なモデルを提供します。ニワトリの胚の脳に簡単にアクセスできることと、遺伝子操作のための確立された卵エレクトロポレーション技術は、初期の胚期における脳の発達の理解に大きく貢献しています。最近発表された研究では、この技術は、FMRPの誤発現の時間的制御を可能にする高度な分子ツールと組み合わされました^20,21。ここでは、シナプス前ニューロンとシナプス後ニューロンの選択的操作を別々に誘導する方法論が進められています。この方法は、聴覚脳幹回路で開発されました。音響信号は、聴覚内耳の有毛細胞によって検出され、聴覚神経節(AG、哺乳類ではらせん神経節とも呼ばれます)に伝達されます。AGの双極性ニューロンは、末梢突起で有毛細胞を神経支配し、次に中枢投影(聴神経)を脳幹に送り、そこで2つの一次蝸牛核、マグノセルラリス核(NM)と角核(NA)で終わります。NMのニューロンは、構造的および機能的に、哺乳類の前腹側蝸牛核の球状のふさふさした細胞に匹敵します。NM内では、聴神経線維(ANF)は、Held端子²²の大きな終末球を介してNMニューロンの体細胞上にシナプスする。発生中、NMニューロンは後脳²³の菱形5および6(r5/6)から生じ、AGニューロンは耳嚢胞²⁴に存在する神経芽細胞に由来する。ここでは、シナプス前AGニューロンとシナプス後NMニューロンにおけるFMRP発現を選択的にノックダウンする手順を別々に記載する。

プロトコル

卵と鶏の胚は、済南大学動物管理使用委員会によって承認された動物プロトコルに従って、注意と敬意を持って取り扱われました。

1.卵とプラスミドの調製

1. 卵の準備
   1. 華南農業大学から新鮮な受精鶏卵(Gallus gallus)を入手し、孵卵前に16°Cで保存します。最適な生存率のために、到着後1週間以内にすべての卵を孵卵のために設定してください。
   2. 卵を水平に置き、神経管トランスフェクションの場合はハンバーガーとハミルトン(HH)のステージ12²⁵ まで、耳嚢胞トランスフェクションの場合はHH13まで54〜56時間、38°Cで46〜48時間インキュベートします。卵の動物の棒は植物の棒よりも軽いので、水平に配置すると、操作が簡単になるように胚が卵の上に配置されます。この手順とそれに続くすべての手順で卵を水平に保つように注意してください。
   3. 胚の位置は、懐中電灯を使用して卵の底から光を当てると、卵殻の暗い領域として表示されます。目的のHH段階で、この懐中電灯法を使用して、卵殻上の胚の位置を鉛筆でマークします。
   4. 75%エタノールを含むガーゼで卵を拭きます。はさみの先端を使用して卵の先のとがった端に穴を開け、18 Gの針注射器で2 mLのアルブミンを取り除きます。穴が針を挿入できるのに十分な大きさであることを確認してください。漏れているアルブミンをガーゼで拭き取り、透明なテープで穴を塞ぎます。
   5. 亀裂を最小限に抑え、窓際の殻の破片の落下を防ぐために、鉛筆でマークされた暗い領域を中心に、卵の上部を透明なテープで覆います。
2. プラスミドDNA抽出
   1. クローンニワトリ Fmr1 shRNAは、前述の²⁰に記載のトランスポゾンベースのテトオンシステムを用いた。このシステムは、pCAGGS-T2TP、pT2K-CAGGS-rtTA-M2、およびpT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNAの3つのプラスミドを含み、トランスフェクション後に Fmr1 shRNAおよびEGFPの発現がサイレンシングされ、ドキシサイクリン(Dox)誘導によってオンにできる薬物誘導性ベクターシステムを提供します。
      注:これらのプラスミドは現在、リポジトリで利用できません。著者らは、合理的な要求に応じてプラスミドを提供することに同意します。
   2. 製造元の指示に従ってエンドトキシンフリー調製キットを使用してプラスミドDNAを抽出し、1/15容量の7.5 M酢酸ナトリウムと1容量の100%イソプロパノールを加えて沈殿させます。
   3. プラスミドを-20°Cで一晩沈殿させ、13,000 x g で10分間遠心分離します。キットに付属のTris-EDTAバッファーでペレットを最終濃度4〜5 μg/μLに溶解します。 プラスミドは、トランスフェクション効率を低下させることなく、-20°Cで12ヶ月間保存できます。
   4. エレクトロポレーション当日、ピペットチップを用いて滅菌遠沈管内で各プラスミド2 μLを十分に混合します。得られた6μL容量のプラスミド混合物は、3ダースの卵をエレクトロポレーションするのに十分である。エレクトロポレーション中にプラスミドを可視化しやすくするために、DNA混合物²⁶ μLごとに1 μLの0.1%ファストグリーン(滅菌ddH₂Oで調製)を加えると、プラスミド混合物が青色になります。

2. ovo エレクトロポレーション

1. 卵窓と胚の識別
   1. エレクトロポレーションの日に、一度に1ダースの卵をインキュベーターから取り出します。卵をインキュベーターから1時間以上遠ざけると、発達上の変動が生じ、生存率が低下します。
   2. 75%エタノールを含むガーゼですべての手術器具を拭きます。
   3. 各卵をカスタムメイドのフォームホルダーに入れます。テープで覆われた領域を75%エタノールで拭き、小さなはさみを使用して鉛筆マークの周囲に窓(1〜2 cm²)を切ります(図1A)。切るときは、下の胚を傷つけないようにハサミを平らに持ってください。
   4. 窓付きの卵を10倍接眼レンズと2倍ズームを備えた実体顕微鏡の下に置き、胚を特定します。光源の角度と明るさを調整して、見やすくします。
      注:この段階で胚を視覚化し、神経管を特定するには、練習と経験が必要です。
      1. 初心者の場合は、胚の識別を容易にするために、次のオプションのインクインジェクションを使用します。0.01 Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)とオートクレーブで10%インドのインク溶液を事前に調製します。1 mLシリンジにインク溶液を満たし、27Gの針をはめ込みます。鉗子で針を45°の角度に曲げます。
      2. 顕微鏡下で、領域オパカの端から慎重に突いて、胚の下に針を挿入します。~50 μLのインクを注入すると、胚の可視化のために透明領域の下に拡散します。インクは、胚を明確に視覚化するために暗い背景を形成します。
         注意: 挿入および注入する前に、シリンジから空気を排出してください。視覚化に長けている場合は、生存率を低下させるため、インク注入ステップを避けてください。
2. 神経管注入とエレクトロポレーション
   注:この手順は、脳幹のNMニューロンをトランスフェクションするためにHH12で実行されます。
   1. ピペットプーラーを使用して、ガラスキャピラリー(直径~1 mm、長さ100 mm)をピペットに引き込みます。解剖顕微鏡下で、毛細血管針の先端を鉗子で直径10〜20μmまで慎重に開きます。ピペット(通常は一度に5〜10個)は、使用するまで収納ボックスに保管してください。
   2. キャピラリーピペットの端にあるゴムチューブを通して負圧を適用することにより、0.5〜1 μLのプラスミド混合物をキャピラリーピペットに充填します。これは、シリンジまたはエアポンプによって達成することができる。
   3. 胚が尾を近づけて垂直に向けられるように(または3軸マニピュレーターを使用してキャピラリーピペットを注入する場合は水平になるように)卵を顕微鏡の下に置きます。キャピラリーピペットを片手または3軸マニピュレーターで持ち、ピペットの先端をr5/6に尾から頭の方向に駆動します。
      注:最も前後脳領域はr1であり、神経管に沿った後続の各膨らみは個々の菱形です。R5/6は耳嚢胞と同じ前後レベルにあり、耳嚢胞は容易に認識できるカップ状の構造です(図1B-C)。
   4. 先端を卵子膜を通して背側神経管にそっと突っ込み、次にピペットを少し引き出して、先端が神経管の内腔に入るようにします。着色されたプラスミドがr5/6に完全に拡散し、r3およびr4に伸びるまで空気圧を加えてプラスミド混合物を注入します。
      注:注射のために卵子膜にスロットを作る必要はありません。
   5. 青色プラスミド溶液が漏れずに神経管を急速に拡散したときに達成される注射が成功したことを確認します(図1B-C)。漏れが発生すると、青はすぐに消えます。
   6. 注入直後に、神経管の両側に白金バイポーラ電極を配置します(図1D)。エレクトロポレーターで12Vと50msの持続時間の2つのパルスを供給します。バイポーラ電極の端に気泡があり、マイナス側に気泡があるのを観察します。
   7. 着色されたプラスミド混合物が電極の正極側近くの神経管組織に入ったときに達成されるエレクトロポレーションの成功を確認します。エレクトロポレーション後、バイポーラ電極を慎重に取り外します。
   8. 卵殻の窓を、正方形に2つに事前にカットし、75%エタノールをスプレーした透明なフィルムで覆います。卵をインキュベーターに戻します。
   9. 次の卵に進む前に、生理食塩水中で12 Vおよび50 ms持続時間の10〜20パルスを供給して、バイポーラ電極を洗浄します。
3. 耳嚢胞注射とエレクトロポレーション
   注:この手順は、内耳の有毛細胞とAGニューロンをトランスフェクションするためにHH13で実行されます。
   1. HH13(~胚の2.5日目)では、胚は頭の右側が上を向くように向きを変えています。顕微鏡下で、尾をあなたの近くにして、胚が垂直になるように卵を置きます。キャピラリーピペットを持ち、右耳鼻咽喉科を背外側方向にそっと突っ込みます(図2A)。
      注:この段階では、耳嚢胞はr5 / 6と同じ前後レベルで体の上部に小さな円形の構造として現れます。
   2. 耳嚢胞が青色溶液²⁷で満たされるまで、プラスミド混合物を空気圧で注入する。青色プラスミド混合物が耳嚢胞内に閉じ込められ、漏れないときに達成される注射が成功したことを確認します。
   3. 注入直後に、 図2Bに示すように、バイポーラ電極を耳嚢胞上に置きます。プラス側とマイナス側をそれぞれ耳嚢胞の前方と後方に配置します。エレクトロポレーターで12Vと50msの持続時間の2つのパルスを供給します。
   4. 青色プラスミド混合物が電極の正極側近くの耳嚢胞の組織に入ったときに達成されるエレクトロポレーションの成功を確認します。エレクトロポレーション後、バイポーラ電極を慎重に取り外します。卵殻の窓を透明なフィルムで覆い、卵をインキュベーターに戻します。

3.プラスミド転写を開始および維持するためのDoxの投与

1. Dox溶液の調製
   1. 化学フードの下で100 mgのDox粉末を測定し、100 mLの滅菌PBSに溶解して1 mg / mLの作業溶液を作ります。溶液を0.22 μmフィルターでろ過し、1 mLアリコートを-20°Cで保存します。 光から保護する^20,28。
2. ドックスの管理
   1. 全強度の遺伝子編集のために、希望年齢の24時間前に、氷上でDoxアリコートを解凍します。透明フィルムを貫通する注射器を使用して、卵の絨毛尿膜に直接50μLのDoxを滴下します。注入後、針穴を透明なフィルムまたはテープで密封します。
   2. ノックダウン効果を維持するには、目的の発達段階で組織が採取されるまで、一日おきにDoxを投与します。.

4.組織解剖と切片作成

1. 脳幹
   1. 胚期3(E3)およびE6の胚の場合は、卵殻を開き、関連する膜をハサミで切ります。胚をスプーンで取り出し、0.1 Mリン酸緩衝液中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)に浸します。
   2. E9胚の場合は、卵殻を開き、ハサミで胚を断頭し、PBSで満たされたシリコン底プレートに頭を移します。頭を軌道に固定し、頭蓋骨の上部を切り裂きます。鉗子を両側から脳の下に慎重に置き、鉗子の肩で脳全体を頭蓋骨から持ち上げます。脳を4%PFAに浸します。
   3. E15およびE19胚の場合は、卵殻を開き、ハサミで胚を断頭し、PBSで満たされたシリコン底プレートに頭を置きます。頭蓋骨を露出させるために頭の上の皮膚を切り開きます。
   4. かみそりで頭蓋骨を垂直に切開し、前脳と尾脳を分離します。尾ブロックをPBSに浸し、頭蓋骨の上部を取り外してから、頭蓋骨から脳を取り除きます。
   5. 視葉を通して脳を固定し、小脳と脳幹を分離します。小脳の真下にある聴覚脳幹を傷つけないように注意してください。脳幹からできるだけ多くの硬膜を取り除き、4%PFAに浸します。
   6. 胚と脳組織は、同じ条件下で24時間保持する必要があるE19脳幹を除いて、4°Cで4%PFAで一晩保持します。
   7. 固定後、30%スクロースを含むPBSで組織を落ち着くまで脱水しますが、年齢にもよりますが、通常は1〜3日かかります。
   8. 脳幹(E15およびE19)を摺動ミクロトームを用いて冠状面で30μmで切片化する。切片をPBSに採取し、免疫染色前に4°Cで保存してください。
   9. E3およびE6胚およびE9脳幹の場合、横方向に50μmで切片化します。切片をPBSに集め、4°Cで保存します。 免疫染色の前に、ゼラチンコーティングされた顕微鏡スライドに切片を取り付けます。これらの年齢のためにより厚い切片を集めることは、組織の取り扱いを容易にします。
2. 耳管
   1. E9、E15、およびE19胚から脳幹を取り除いた後、側頭骨に埋め込まれている聴覚管は頭蓋骨の下に横たわっていることを容易に識別でき、側頭骨は周囲の頭蓋骨から容易に分離できます。E9胚の場合は、側頭骨全体を4%PFAで固定します。古い胚の場合は、側頭骨の骨構造を取り除き、耳管を隔離し、聴覚管を4%PFAに固定します。
   2. 組織を包埋する前に、すべての側頭骨と聴覚管を4%PFAで4°Cで一晩保持します。
   3. 説明されているように組織包埋を実行します。次のように包埋溶液を調製します:ゼラチン顆粒が膨潤して落ち着くまで(約30分)冷水に10%ゼラチン(牛の皮膚から)を浸します。混合物を~50°Cに加熱してゼラチンを溶解し、ゼラチン溶液に20%スクロースを加えて攪拌して溶解させる。ゼラチン-ショ糖溶液を4°Cで最大1か月間保存します。
   4. 使用のために、ゼラチン - スクロース溶液を37°Cで温める。 側頭骨/耳管を96ウェルプレート上の温かいゼラチン-スクロース溶液に37°Cで、落ち着くまで(通常は30〜60分)浸します。
   5. 12ウェルプレートのウェルの底部を透明フィルムのストリップで裏打ちします。温かいゼラチン-スクロース溶液の層を追加し、固まるまで待ちます。側頭骨/耳管を各ウェルに移します。
   6. 温かいゼラチン - スクロース溶液の第2層で組織を移植する。組織がゲルの中心にあり、耳管が水平になるように組織の位置を調整します。プレートを慎重に4°Cの冷蔵庫に移動し、ゲルが固まるまで待ちます。
   7. 透明フィルムストリップを引き出して、ゲル組織ブロックをウェルから移動します。余分なゲルを正方形のブロックにトリミングし、ブロックの角を切り取って向きを特定します。ゼラチンブロックをホイルで包み、ドライアイスで凍結し、切片化まで-80°Cで保管します。
   8. クライオスタットで聴覚管の経度に沿って20μmでブロックを切断します。切片をゼラチンコーティングされた顕微鏡スライドに直接取り付けます。免疫染色の前にスライドを-80°Cで保存してください。
   9. 免疫染色の前に、スライドを予熱したPBS(45°C)に5分間浸してゼラチンを溶解し、次にスライドを室温PBSで3回洗浄して残留ゼラチンを除去します。

5. 免疫染色と顕微鏡イメージング

注:切片をスライドにマウントするか、PBSでフリーフローティングするかに応じて、2種類の免疫染色が行われます。

1. スライド上の免疫染色
   1. スライドをPBSでそれぞれ10分間3回洗浄します。切片を含む部分をオイルペンで丸で囲み、染色時の液漏れを防ぎます。PBS中の5%正常ヤギ血清を含むブロッキング溶液で切片を覆い、室温で30分間インキュベートします。
   2. 一次抗体(使用する最終濃度については、材料の表を参照)を0.3%TritonX-100および5%正常ヤギ血清を含むPBSで希釈します。.ブロッキング溶液を除去し、切片を一次抗体溶液で覆います。底部に蒸留水の層が入った箱の中でスライドを4°Cで一晩インキュベートします。
   3. スライドをPBSで10分間3回すすぎます。0.3% TritonX-100を含むPBSで1:500に希釈した蛍光二次抗体をスライドに塗布します。スライドを室温で4時間インキュベートし、光から遮蔽する。
   4. スライドをPBSで3回洗浄します。スライドに2滴の封入剤をそっと落とし、カバーガラスでセクションを覆います。カバーガラスとスライドの間に気泡が発生しないように注意してください。
2. ホールマウント胚およびフリーフローティング切片の免疫染色
   1. 胚/切片をPBS 3xでウェルプレートでそれぞれ10分間洗浄します。0.3%TritonX-100および5%正常ヤギ血清を含むPBSで一次抗体を遠心チューブで希釈します。各胚/切片をガラスフック付きのチューブに移し、シェーカーで60rpm、4°Cで一晩インキュベートします。
   2. 胚/切片をPBSで3回、ウェルプレートでそれぞれ10分間洗浄します。各胚/切片を蛍光二次抗体溶液で満たされた暗所の遠心チューブに移し、シェーカー上で室温で4時間インキュベートします。
   3. ウェルプレートでPBSで胚/切片を3回洗浄します。ブラシを使用して、PBSを含む15cmの皿にゼラチンコーティングされた顕微鏡スライドに切片を取り付けます。スライドがわずかに(~5分)乾いたら、封入剤を2滴塗布し、カバーガラスを置きます。カバーガラスとスライドの間に気泡が発生しないように注意してください。イメージングのためにマウント組織全体をPBSに保管してください。
3. イメージング
   1. カーボンパウダーを含むシリコン底部が黒い背景を提供する皿のPBSでマウント組織全体を画像化します。前述のように、市販の画像処理オリンパスソフトウェアパッケージを使用して画像をキャプチャおよび処理する²⁹。
   2. スライド上の切片を共焦点顕微鏡で画像化する^{(前述のように20})。10倍、20倍、63倍の対物レンズを持つ単一の焦点面でセクションを画像化します。同じパラメーターを使用して、同じ動物からすべての画像をキャプチャします。信号が飽和しないように、レーザーレベルと画像取得の設定を調整するように注意してください。
   3. フィジーのソフトウェアを使用して画像処理を実行します。説明のために、プロの画像編集ソフトウェアを使用して画像の明るさ、コントラスト、およびガンマを調整します。

結果

異なる部位および異なる発生段階で ovo エレクトロポレーションを行うことにより、聴覚末梢または聴覚脳幹のいずれかで選択的FMRPノックダウンを達成しました。

NM での FMRP ノックダウン
ニワトリFmr1に対する低分子ヘアピンRNA(shRNA)を設計し、前述のようにTet-Onベクター系にクローニングした²⁰。 inovoエレクトロポレーションのセットアップを図1Aに示します。高速緑色に着色されたプラスミドDNAを、HH12のr5/r6レベルで神経管に注入しました(図1B-C)。白金バイポーラ電極を神経管の両側にr5/6レベルで配置しました(図1D)。12 Vで2つのパルスを送達して、プラ...

ディスカッション

FMRPの細胞自律機能を決定するためには、個々の細胞群または細胞型におけるFMRPの発現を操作する必要があります。FMRPの主要な機能の1つはシナプス形成と可塑性を制御することであるため、特定の回路の各シナプスコンポーネントを選択的に操作することは、シナプス通信におけるFMRPメカニズムを完全に理解するための前提条件です。ニワトリ胚のovoエレクトロポレーションを用いて、シナプス前AGニューロンまたはシナプス後NMニューロンのいずれかのAG-NM回路におけるFMRP発現を標的とする方法を実証しました。これを達成するためには、エレクトロポレーションに適した発生段階を選択し、エレクトロポレーション電極を胚に正確に配置することが重要なステップです。NMニューロンは、HH12²³でr5 / 6レベルで神経管内の神経前駆細胞から生じる。同じ段階で、脳神経堤細胞は、神経管の背側先端から蝸牛前庭神経節に移動し、将来のAGニューロン³³を包み込む。したがって、AG内のNMニュ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
卵の孵化
16 °C冷蔵庫	MAGAT		精卵の保管に使用されます。
卵インキュベーター	SHANGHAI BOXUN	GZX-9240MBE
受精卵	中国南部農業大学の		農場 卵は、最適な生存率のために1週間で使用する必要があります。
プラスミド調製
遠心分離	機 Sigma	10016
Fast green	Solarbio	G1661	蒸留水とオートクレーブで0.1%の作業溶液を作ります。
プラスミドマキシプレップキット	QIAGEN	12162	プラスミドDNAをTris-EDTA(TE)バッファーに溶解します; エンドトキシンフリー調製キット
酢酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	S2889	ヌクラーゼフリー水で7.5Mのワーキングソリューションを作ります。
エレクトロポレーションおよびドキシサイクリン投与
エレクトロポ	レーターBTX	ECM399
1 mL / 5 mLシリンジ	州KANGFULAI
解剖顕微鏡	CNOPTEC	SZM-42
Doxcycline	Sigma-Aldrich	D9891	各用量に新鮮なアリコートを使用し、-20 &度;C.
ガラス毛細管	BEIBOBOMEI	RD0910	0.9-1.1 mm * 100 mm
実験室パラフィルム	PARAFILM	PM996	透明フィルム
ピペットプーラー	成都楽器工場	WD-2	っ張り条件:500°;15 s
プラチナ エルクトロード	ホーム製		直径 0.5 mm、間隔 1.5 mm
ゴムチューブ	Sigma-Aldrich	A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps	RWD	F11020-11	チップサイズ:0.05*0.01 mm
その他の手術ツール	RWD
パラホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	158127	リン酸緩衝生理食塩水に新たに調製した4%PFA溶液は、4°Cで保存できます。Cは最大1週間。
SYLGARD 184 シリコーン エラストマー キット	ダウ	01673921	黒の背景プレートには、食品グレードのカーボン パウダーが塗布されています。
セクショニング
クライオスタット	LEICA	CM1850
ゼラチン	Sigma-Aldrich	G9391	ウシの皮膚から。
スライド式ミクロトーム	LEICA	SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス	Abcam	ab150113	1:500 希釈、RRID:
AB_2576208 Alexa Fluor 555 ヤギ抗ウサギ	Abcam	ab150078	1:500 希釈、RRID: AB_2722519
DAPI	Abcam	ab285390	1: 1000希釈
フルオロマウント-G 封入用メディウム	サザン Biotech	Sb-0100-01
FMRP抗体	Y. Wang, Florida State University	#8263	1:1000 希釈, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody	DSHB	39.3F7	1:100 希釈, RRID: AB_1157901
Netwell plate	Corning	3478
Neurofilament antibody	Sigma-Aldrich	N4142	1:1000 希釈, RRID: AB_477272
パルブアルブミン抗体	Sigma-Aldrich	P3088	1:10000希釈、RRID:AB_477329
SNAP25抗体	Abcam	ab66066	1:1000希釈、RRID:
AB_2192052Imaging
Adobe photoshop	ADOBE		画像編集ソフト
共焦点顕微鏡	LEICA	SP8
蛍光実体顕微鏡	OLYMPUS	MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0	OlYMPUS		商用画像処理ソフトウェアパッケージ