Method Article

細胞外小胞サブセット解析のための多重化表面プラズモン共鳴イメージングチップ上のマルチモーダル解析プラットフォーム

DOI:

10.3791/64210

⸱

March 17th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Université de Franche-Comté, CNRS UMR-6174, FEMTO-ST Institute, 2Lille Neuroscience & Cognition research centre, 3Institut Galien Paris-Saclay, CNRS UMR-8612 , Université Paris-Saclay, 4Interdisciplinary Lab Carnot Bourgogne LICB, CNRS UMR-6303, Université de Bourgogne Franche-Comté

In This Article

Summary

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この論文は、細胞外小胞サブセットの特性評価のためのスループットを向上させた新世代のマルチパラメトリック分析プラットフォームを提案します。この方法は、多重化されたバイオセンシング法と、原子間力顕微鏡による計量学的および形態力学的分析とラマン分光法の組み合わせに基づいており、マイクロアレイバイオチップにトラップされた小胞ターゲットを認定します。

Abstract

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細胞外小胞(EV)は、直径50ナノメートルから数百ナノメートルの範囲のすべての細胞によって産生される膜由来の小さな小胞であり、細胞間コミュニケーションの手段として使用されます。それらは、さまざまな疾患の有望な診断および治療ツールとして浮上しています。サイズ、組成、内容が異なるEVを生成するために細胞が使用する2つの主要な生合成プロセスがあります。サイズ、組成、および細胞起源が非常に複雑であるため、それらの特性評価には分析技術の組み合わせが必要です。このプロジェクトには、EVの亜集団の特性評価のためのスループットが向上した新世代のマルチパラメトリック分析プラットフォームの開発が含まれます。この目標を達成するために、研究グループは、マイクロアレイバイオチップに閉じ込められた小胞ターゲットの原子間力顕微鏡(AFM)による計量および形態力学的分析と多重バイオセンシング法の組み合わせに基づいてEVの独自の調査を可能にする、グループが確立したナノバイオ分析プラットフォーム(NBA)から始まります。目的は、ラマン分光法による表現型および分子分析でこのEV調査を完了することでした。これらの開発により、臨床的可能性を秘めた体液中のEVサブセットを識別するためのマルチモーダルで使いやすい分析ソリューションの提案が可能になります。

Introduction

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診断および治療におけるEV研究への関心の高まり1,2,3,4,5は、この分野が直面する課題と相まって、これらの小胞を定量化または特徴付けるための多種多様なアプローチと技術の開発と実装をもたらしました。EVの同定に最も広く使用されている方法は、EVの起源を確認するためのタンパク質特異的イムノブロッティングとプロテオミクス、その構造を確認するための透過型電子顕微鏡(TEM)、およびサンプルボリューム中のそれらの数とサイズ分布を定量化するナノ粒子追跡分析(NTA)です。

ただし、これらの手法だけでは、EVサブセットの特性評価に必要なすべての情報を提供するものではありません。生化学的および物理的特性の多様性によるEVの固有の不均一性は、特に混合物(粗サンプル)に含まれるEVの場合、信頼性が高く再現性のあるグローバルな分析を妨げます。したがって、検出および特性評価の方法は、EVに個別にも一般的にも、より高速であるが選択的ではない他の方法を補完するために必要です6。

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Protocol

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1.金基板の準備

注:金チップ上には、1)裸の表面、2)化学的に機能化、3)生体機能化(C11C16層にグラフトされた配位子)の3種類の表面が生成されます。これ以降、それぞれ「ネイキッド」、「C11C16」、「リガンド」と呼ばれます。

  1. 金基板の準備:
    注:このプロトコルでは、金バイオチップはクリーンルームで社内で製造されました。自家製のバイオチップは、クロム(2 nm Cr)と金(48 nm Au)のコーティングを施したスライドガラス(SF11)で構成されていました。バイオチップの長さは28mm、幅は12.5mm、厚さは0.5mm20であった。
    1. DCマグネトロンスパッタリング15 を使用して、物理蒸着(PVD)によってスライドをコーティングします。
  2. 化学機能化:
    1. 裸のチップを、メルカプト-1-ウンデカノール(11-MUOH:C11)とメルカプト-1-ヘキサデカン酸(16-MHA:C16)の90%/10%モル混合物中で、無水エタノール中で1 mM、攪拌下、室温で一晩インキュベートすること....

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Results

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リガンドグラフトに最適なpH条件の決定
バイオチップの調製に使用されるさまざまなリガンドは、pHとチオレート化学層と相互作用するそれらの可用性の関数としてテストされます(図3)。リガンドは、異なるpH値で酢酸塩バッファーで希釈され、C11C16層で化学的に機能化されたバイオチップに注入されます。溶液を表面にランダムに注入し、各リガンド注入後に界面活性剤(40 mMのOG)を注入してベースラインを回復させます。この 予備濃縮 試験により、各リガンドグラフトに最適なpHを決定することができます。 図3に示す例では、傾きとリガンドグラフトのレベルの観点から、pH6が最良のpHとして選択されました。

SPRi CCD イメージ
SPRiマシンに挿入した後、バイオチップ(裸、化学的に機能化された、または提示マイクロアレイ)に登録されたSPRi CCD画像を

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Discussion

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最近最も広く使用されているEV同定法は、EVの起源を確認するためのタンパク質特異的イムノブロッティング、その構造を確認するためのTEM、およびサンプル量中の数とサイズ分布を定量するNTAです3。それにもかかわらず、(生物)医学研究におけるEVへの高い関心と既存の分析ツールの限界により、科学界はEVの特性評価、識別、および定量化のための新しい方法を開発するようになりました。

ほとんどの開発は、免疫標識または免疫捕捉の原理をEV検出のための高度な物理的方法と組み合わせることに焦点を当てています。これらのアプローチのいくつかは、ナノオブジェクトスケールで最大限に信頼性の高いデータを取得するために、個々のEVの識別に焦点を当てています。他の人は、臨床使用のために手頃な価格で信頼できるグローバルな方法を提案することにもっと関心を持っています。

多重化された金基板上のEVのバイオ検出とAFM特性評価を組み合わせたNBAプラットフォームは、複雑な生体液中に存在するナノベシクルの深い認定を可能に.......

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Disclosures

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著者は開示する利益相反を持っていません。

Acknowledgements

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IVEThコア施設(パリ)のケリー・オベルタンとファビアン・ピコは、ラマンイメージング実験で認められています。Thierry Burnouf(台北医科大学、台湾)とZuzana Krupova(フランス、ヘリンクール出身)は、それぞれ血小板と牛乳のサンプルに由来するEVサンプルを提供したことで認められています。この作業は、ブルゴーニュフランシュコンテ地域とEUR EIPHI大学院(BEGINNERプロジェクト、2021-2024)によってサポートされました。この作業の一部は、CLIPPプラットフォームとFEMTO-ENGINEERINGのRENATECHクリーンルーム施設を使用して行われ、Rabah Zeggariに感謝します。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CD41a抗体Diaclone SAS (France)447528
CP920Microparticles GmbH, Germany 448303
DXR3xi サーモフィッシャーサイエンティフィックT1502
EDCSigmaA6272
エタノールアミンSigmaP5368-10PAK
血小板濃縮物由来の Evs共同研究 : Pr T. Burnouf (東京都、台北市)S2889
牛乳由来の Ev共同研究 : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - France)3450
グルタルアルデヒドΣ56845
グウィディオン 853.223.020
ネトロンスパッタリングPLASSYSSAB5300165
メルカプト-1-ヘキサデカン酸SigmaG5882
メルカプト-1-ウンデカノール シグマO8001
マウンテンズ SPIP onesデジタルサーフ
NanoWizard 3 バイオサイエンス ブルカーJPK 
オクチルグルコシド(OG) シグマ
オボアルブミン抗体Sigma
Phosphate Buffer 生理食塩水 (PBS)Sigma
ラット アルブミン血清 (RSA)Sigma
酢酸ナトリウムバッファー Sigma
SPR-Biacore 3000GE Healthcare/ Cytiva life sciences
SPRi BiochipMIMENTO テクノロジープラットフォームバイオチップは、クリーンルーム、Besancon
SPRi Plex IIHoriba Scientificで
スルホNHSシグマ
マグ社内で製造されました。

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Silva, A. K. A., et al. Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group "Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France". Advanced Drug Delivery Reviews. 179, 114001(2021).
  2. Xunian, Z., Kalluri, R.

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Extracellular VesiclesSurface Plasmon ResonanceMultiplexed BiochipAtomic Force MicroscopyRaman SpectroscopyVesicle Subset AnalysisNanomechanical PropertiesBiochip PreparationNanoparticle TrackingWestern Blotting

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