方法論記事

マウス肝臓における血小板-白血球-内皮相互作用を研究するための生体内顕微鏡検査

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DOI：

10.3791/64239

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2022年10月6日

 ,  , 
1Center for Translational Research on Inflammatory Diseases, Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 2Department of Medicine, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine

この記事について

サマリー

生体内顕微鏡検査は、急速なプロセスやシーケンシャルなプロセスの時間的関係と空間的関係の両方についての洞察を提供する強力なツールです。ここでは、実験的敗血症(内毒素血症)のマウスモデルにおける肝臓正弦波におけるタンパク質-タンパク質相互作用と血小板-好中球-内皮相互作用の両方を評価するためのプロトコルについて説明します。

要約

炎症と血栓症は、主に微小循環で発生する複雑なプロセスです。標準的な組織型では、炎症と血栓症の両方の終末経路に関する洞察が得られるかもしれませんが、これらのプロセスの時間経過を通じて発生する時間的変化を示すことはできません。生体内顕微鏡検査(IVM)は、 生体内の生理学的プロセスを時間的に把握するために、生きた動物イメージングを使用することです。この方法は、これらの相互作用が発生するためにしばしば必要となる急速かつ連続的なイベントにより、循環内の細胞およびタンパク質の相互作用を評価する場合に特に強力です。IVMは、 in vivoで複雑なプロセスを見ることができる非常に強力なイメージング方法論ですが、IVM研究を計画する際に考慮すべき重要な方法論的要因がいくつかあります。この論文では、肝臓の生体内イメージングを行うプロセスの概要を説明し、重要な考慮事項と発生する可能性のある落とし穴を特定します。したがって、この論文では、IVMを使用して肝正弦波の血小板-白血球-内皮相互作用を研究し、急性肝障害のさまざまなモデルにおけるそれぞれの相対的な寄与を研究する方法について説明します。

概要

炎症と血栓症は、主に微小循環で発生する複雑なプロセスです。このプロトコルは、 in vivoでの肝臓微小血管系のイメージングを可能にする外科的製剤の概要を示しています。標準的な組織型は、炎症と血栓症の両方の終末経路についての洞察を提供するかもしれませんが、プロセス全体で発生する時間的変化を示すことはできません。さらに、この方法は、生体システム内で発生することが多い急速かつ連続的な相互作用をビデオ顕微鏡 で 捉えることができるため、微小血管循環内で発生する一過性の細胞およびタンパク質の相互作用を評価する場合に特に強力です。この論文では、肝正弦波における血小板-白血球-内皮相互作用を研究するための生体内顕微鏡法の使用について説明し、急性肝障害のさまざまなモデルにおけるそれぞれの相対的な寄与を研究します。

この外科的製剤と画像診断法は、多くの炎症モデルや病理学的モデルに適応できる可能性がありますが、ここでは、マウス敗血症とアセトアミノフェン(APAP)誘発性肝障害のエンドトキサ血症モデルという血管炎症の2つのモデルについて概説します。エンドトキシン(リポ多糖;LPS)は、マウス敗血症の実験モデルを誘導するために、1930年代には早くも始まり、その分離とその後の敗血症1の進行における重要な分子としての調査が行われました。このモデルは、LPSがグラム陰性菌の単一の成分にすぎないという点で制限されていますが、これは広く受け入れられ、利用されている方法であり、比較的簡単で迅速に実行できます。さらに、敗血症1の生理学的症状を迅速かつ正確に再現します。腸管内毒素吸収が肝疾患や炎症の発症に果たす役割を考えると2、これはマウス肝臓における血小板-白血球-内皮相互作用を研究するための優れたモデルです。

敗血症のLPSモデルに加えて、APAPの過剰摂取は、肝臓の病理学的細胞間相互作用の研究のための優れたモデルを提供します。APAPの過剰摂取は、血小板減少症と肝臓での血小板の蓄積を特徴とする急性肝不全を引き起こし、その後、白血球を介した肝臓の回復を妨げる可能性があります3。このモデルの外科的調製とイメージングの方法論は、多くの生物学的問題やさまざまな病理学的プロセスの研究に適合させることができますが、敗血症のLPSモデルとAPAP誘発性肝障害はどちらも、 in vivoでの血小板-白血球-内皮相互作用の研究のための優れたモデルです。

IVMには、標準的な組織学的手法に比べていくつかの固有の利点があります。標準的な組織学的手法では、組織サンプル全体または切片化された組織サンプルの研究や、タンパク質や組織構造の鑑賞が可能ですが、これらの方法論には限界があります。設計上、これらのプロセスには組織処理が必要であり、生体システムに見られるものを歪めたり隠したりする可能性があります。組織は組織学的調製中に固定する必要があり、固定アーティファクトや自家蛍光の増強の可能性をもたらします。また、固定は組織の細胞内変化を引き起こす可能性があり、不適切な固定の可能性は組織の劣化につながる可能性があります。さらに、組織学的手法は、タンパク質または細胞相互作用の時間的側面を直接研究する可能性を欠いており、一時的な相互作用またはまれな相互作用を見逃す可能性があります。

逆に、蛍光生体内顕微鏡法では、標準的な組織学に内在する多くの合併症や制限を回避することができます。IVMは、固定を回避し、それによって組織学的調製中に発生する可能性のあるアーティファクトや組織の劣化を回避します。また、設計上、生体システム内の組織のイメージングも可能であり、そのため、組織の単離や切片化は必要ありません。さらに、組織学を使用して捕捉するのが困難または不可能な一過性またはまれなプロセスのイメージングと研究を可能にします。このIVM法は、連続したプロセス(例えば、血小板または白血球が開始する相互作用により、血管内皮に結合した血小板-白血球凝集体)を捕捉し、同定するためにも使用できます。最後に、この方法は多くのイメージングシステムに適応させることができます。研究のニーズと目的のデータセットに応じて、外科的準備後、外部化された肝臓を必要なほぼすべてのイメージングシステムに配置できます。このプロトコルを、広視野蛍光顕微鏡、スピニングディスク顕微鏡、共鳴ヘッドスキャナーを使用したレーザー走査型共焦点顕微鏡、および2光子顕微鏡を使用したイメージングにうまく適用しました。しかし、この方法を前述の顕微鏡システムに限定されるべきだと考える理由はありません。

この手法論文では、マウス肝臓における血小板-白血球-内皮相互作用の研究に以前に使用されていたIVMのプロトコールを概説しています。このプロトコルは、蛍光標識抗体で標識された血小板の時間的血小板-内皮接着を比較するために使用されてきました。これは、蛍光標識抗体で標識されたか、または内因性蛍光4のために遺伝子組み換えされたものです。このプロトコルは、肝臓炎症のエンドトキセミックモデルにおける肝臓正弦波における一過性の血小板-白血球-内皮相互作用を評価し、P-セレクチンと組換えタンパク質を共局在化するために使用されています。さらに、このプロトコルにより、標準的な組織型を用いて好中球密度に見られる差が、赤血球の速度の違いによるものかどうか(体積流量の代用として)5 を判定することが可能になりました。最後に、この方法は、APAP誘発性肝障害の急性モデル6において、肝正弦波中のKupffer細胞による血小板動員を評価するために使用されています。このような一連の研究は、標準的な組織学的方法では不可能であったでしょう。述べたように、このプロトコルは、さまざまなイメージングシステムに適応させることができ、適切な外科的準備、蛍光抗体の選択、およびイメージング設定により、このプロトコルは肝臓の病理学の研究に対して高い信頼性と再現性を備えています。

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プロトコル

すべての動物プロトコルは、ベイラー医科大学の施設動物管理および使用委員会とマイケルE.デベイキー退役軍人医療センターの研究開発委員会によって承認されました。すべての実験は終末期であり、最後に麻酔の手術面下で安楽死が行われます。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器に関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。

1. 抗体および染料の調製

  1. 抗体と色素の選択
    注:同時に観察される色の数は、特定の顕微鏡のセットアップによって異なります。ここで使用したシステムでは、4つの異なる波長を同時に視覚化できます。
    1. 船舶の視覚化:
      1. 実験デザインに基づいて、内皮特異的抗体(CD31など)および/または血漿中に均一に分布する分子(デキストランやアルブミンなど)で血管系を標識します。
        注:この記事では、Texas Red標識デキストラン(150 kDa、250 μg/マウス)の使用について説明しています。この高分子量タンパク質の利点は、急性炎症時に血管系内に留まる能力にあります。抗体標識を使用する際には、内皮機能を阻害する可能性のある抗体を避けるように注意する必要があります。
    2. 血小板の可視化:
      1. 血小板を同定するには、遺伝子改変マウス(R26R-EYFPf/f/PF4-Creなど)またはIVM用の血小板特異的抗体(抗GPIbβなど)を使用します。血小板の蛍光標識の使用に関する詳細な情報については、以前の論文4を参照してください。
        注:ここでは、DyLight488標識抗GPIbβ抗体(X488;6 μg/マウス)を使用します。抗体標識を使用する際には、血小板の機能や接着に干渉しないように注意する必要があります。
    3. 白血球の可視化:
      1. イメージング血小板と同様に、遺伝子改変マウス(顆粒球の場合はLysM-EGFPなど)または白血球特異的抗体(マウス好中球の場合はLy6Gなど)を使用して、目的の白血球を視覚化します。このプロトコルに従うには、Brilliant Violet 421 (BV421) 標識抗 Ly6G 抗体 (3 μg/マウス) を使用します。急性(<6時間)実験では、好中球を動物あたり3μgの抗Ly6G(クローン1A8)で標識します。
        注:抗Ly6G抗体(クローン1A8)を使用する場合、この抗体は、少なくとも24時間後および/または繰り返し注射して好中球(0.05-1 mg抗体/マウス)7-9を枯渇させるために使用されていることに留意すべきである。抗Ly6G(1A8)抗体は、すべてではないが特定の状況において、高い(しかし低いではない)せん断応力で好中球の接着および転生に影響を与えることも報告されている9,10。したがって、抗体の投与量は、それぞれのケースで慎重に選択する必要があります。
    4. 追加のタンパク質:
      1. 特定のイメージングシステムで利用可能なレーザーとフィルターセット/検出器の数に応じて、スペクトルのオーバーラップを避けながら、より多くのオブジェクトを同時に識別するために、より多くの波長を追加します。
        注:このプロトコルは、PerCP-eFluor 710標識抗P-セレクチン抗体(4 μg/マウス)を使用して、4番目のオブジェクトであるP-セレクチン(クローンPsel.KO2.3)のイメージングについて説明しています。この論文の説明と画像の大部分はLPS誘発性急性肝障害に関するものですが、他の損傷モデルが興味を持ち、代替ラベルが必要になる可能性があります。APAP誘発性傷害6に使用される抗体の説明については、ディスカッションを参照してください。
  2. 防腐剤の除去と滅菌
    注:動物に注射する準備ができている市販の抗体や色素がありますが、それらのほとんどは、動物に有害であったり、交絡変数を追加したりする可能性のあるキャリアまたは防腐剤(アジ化ナトリウムなど)を持っています。担体または防腐剤を含む抗体および色素は、カルシウムまたはマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS-/-;またはその他の生理学的緩衝液)に対して透析する必要があります。
    1. 500 mL DPBS-/- (透析する抗体/色素の~1,000倍の量)をマグネティックスターバー付きのビーカーに注ぎます。7,000 MWCOのカセットをフロートブイに取り付け、透析バッファーに少なくとも5分間置いて、メンブレンをプレコンディショニングします。カセットを取り外し、プラスチックの端を糸くずの出ないティッシュで拭き取ります。透析膜には触れないでください。
    2. 18-20 Gの針を使用して、4つのポートのいずれかから抗体/色素をカセットに注入します。抗体/色素の入ったカセットを透析バッファーに入れます。ビーカーをマグネチックスターラーに置き、4°Cで少なくとも1時間透析します。 透析バッファーを交換します。
    3. ステップ 1.2.2 の透析と透析バッファーの交換を、さらに少なくとも 2 回 (少なくとも 3 回の交換) 繰り返します。
    4. カセットを取り外し、プラスチックの端を糸くずの出ないティッシュで拭き取ります。透析膜には触れないでください。18-20 Gの針を使用して、未使用のポートを介してカセットから抗体/色素を吸引します。
    5. 組織培養フードで、動物に使用する前に0.2μmフィルターを使用して調製物を滅菌します。未使用部分は4°Cの滅菌チューブに保管してください。
  3. コントロール
    1. 各実験に必要な正確なコントロールは、研究のデザインによって異なりますが、研究結果を分析する際に非特異的な標識と生物学的影響を排除するために、適切な偽コホート、ビヒクル処理群と非ビヒクル処理群、およびアイソタイプコントロールを必ず含めてください。

2. 腹腔内エンドトキシン注射

注:マウス敗血症の実験モデルで肝臓の正弦波における血小板-好中球-内皮相互作用を評価するために、エンドトキシン注射を使用できます。

  1. マウスの体重を量り、注入するエンドトキシンの量を決定します(5 mg / kg; 大腸菌 血清型O111:B4;エンドトキシン含有量 1 x 106 EU/mg)。
    注:エンドトキシンの効力と効果は種と菌株に依存し、ロット11ごとに異なる場合があります。したがって、結果の一貫性を最大化するために、実験は同じロットのエンドトキシン12で実施する必要があります。
  2. 生理食塩水(0.9%塩化ナトリウム)で希釈したエンドトキシンを、27Gの針を取り付けたシリンジに吸い上げます。利き手ではない方の手では、親指と人差し指を使ってマウスの首筋を持ちます。もう一方の手を使って、尾に牽引力を乗せて腹部を露出させ、5番目の指と利き手でない手のひらの間に尾を置きます。
  3. 70%エタノールで腹部を洗浄します。左下(または右)の腹部に針を挿入し、エンドトキシンを注入します。
    注:実験を混乱させる可能性のある臓器損傷のリスクがあるため、針を深く挿入しすぎないように注意する必要があります(例:腸、腸、腎臓などの損傷)。
  4. 対照動物で、通常の生理食塩水(またはビヒクル)を使用して手順2.1〜2.3を実行します。
    注:APAP誘発性肝障害は、エンドトキシン6ではなくAPAPを使用して、上記と同様の方法を使用して達成できます。APAP誘発性肝障害モデルに関連する詳細については、ディスカッションを参照してください。

3.動物の麻酔の導入と維持、および安楽死

  1. 動物を麻酔の手術面の下に置きます。ノーズコーンまたは気管切開チューブ を介して 吸入イソフルランを使用して麻酔を維持します。つま先をつまんだ後の動きを監視することにより、麻酔のレベルを評価および調整します。
  2. すべての実験の終わりに、麻酔の手術面下での放血とそれに続く両側の気胸による安楽死を行います。

4. 頸静脈と気管のカテーテル法

  1. 呼吸と、標識された抗体/色素の注射のための血管カテーテルの配置を容易にするために気管切開を行います。
    注:外科用解剖顕微鏡またはルーペは、カテーテル挿入に役立ちます。
  2. 首と腹部から毛皮を剃ります。余分な髪を取り除きます。動物を温めパッドの上に置いて体温を37°Cに保ち、直腸プローブを使用してコア温度を監視します。ベタジンで首をこすり、続いて70%エタノールでこすります。
  3. 首に垂直な正中線切開を行い、鈍的解剖を使用して気管を露出させます。
    1. 気管 切開
      1. 90 Gの鈍い針を挿入した気管切開チューブPE21チューブを準備します(図1A)。
        注:気管切開チューブの端に~45°のベベルを追加すると、気管への挿入が容易になる場合があります。あるいは、18〜20Gの末梢静脈内カテーテルをPE90チューブの代わりにすることもできる。
      2. 皮膚と筋膜を切開したら、唾液腺を中心から遠ざけて反射させます。
      3. 鈍的解剖を使用して、胸骨甲状筋を分離し、気管へのアクセスを改善します。
        注意: 供給血管と気管に隣接する頸動脈を避けるように注意してください。
      4. 気管の腹側/前側の気管リングの間に小さな(~1-2 mm)水平切開を行います(図1B)。
        注:Vannasハサミを使用すると、適切な解剖が容易になります。気管の前面 のみが 切開されていることを確認してください。気管が完全に切断されると、気管のカニューレ挿入が困難になり、近くの血管構造が損傷するリスクがあります。
      5. 気管切開チューブを穴に通します。チューブの先端がカリーナを超えて挿入されていないことを確認してください。
      6. 気管リングを支えとして使用して、気管とチューブの周りに#4-0シルク縫合糸を結び、気管切開チューブを気管内に固定します(図1C)。
    2. 外部頸静脈カニューレ挿入術
      1. PE50チューブ(OD 0.97 mm、ID 0.58 mm)を使用して頸静脈カテーテル(図2)を準備し、PE10チューブ(OD 0.61 mm、ID 0.28 mm)を一方の端(図2の挿入図)に挿入し、22 Gまたは23 Gの鈍い針をもう一方の端に挿入します。接着剤を使用して、チューブが滑ったり漏れたりしないようにします。滅菌生理食塩水を充填したシリンジを取り付けて、カテーテルを洗い流します。
      2. 唾液腺反射後に外頸静脈(EJV)を露出させます。鈍的解剖を使用して、EJVを周囲の結合組織から解放します(図3A)。
      3. #4-0シルク縫合糸を使用して、視覚化されたEJVの頭蓋端を結紮し、EJVの尾側端の周りに緩いループを配置します(図3B)。各縫合糸の端を止血剤と一緒にクランプし、2つの止血剤を互いにそっと引っ込めて、EJVを露出させます。
        注:カニューレ挿入に最適な領域は、頭蓋前頸静脈と尾側の内側頸静脈の枝の間です。縫合糸の配置を容易にするために、縫合糸の一部(~15cm)を半分に折り、曲げた端を1対の鉗子でEJVの下に通し、EJVを別の鉗子で持ち上げて血管の回転を防ぎます。次に、縫合糸をカットして2つの別々の長さにします。
      4. Vannasのはさみを使用して、EJVの前面に小さな(~1 mm)切開を行います。曲げた30Gの鈍い針(0.15mmの細いピンを鈍くヤスリで削って針先に挿入したもの)を切開部からEJVに挿入し、ゆっくりと持ち上げて、生理食塩水を含むカテーテルがEJVに通過しやすくします。
        注:マウスに挿入してフラッシュする前に、カテーテルとハブに気泡がないことを確認してください。空気塞栓は動物にとって致命的かもしれません。
      5. カテーテルがEJV内に入ったら、カテーテルが静脈の奥深くまで通過できるように、尾側ループを十分に緩めます。血液を吸引し、カテーテルを洗い流して漏れがないか確認することにより、カテーテルの配置を確認します(図3C)。
      6. 尾側ループを使用して、カテーテルをEJV内に固定します。頭蓋縫合糸を使用して、カテーテルをEJVの頭蓋端に固定し、偶発的な抜管を最小限に抑えます(図3D)。
      7. #4-0シルク縫合糸で首の皮膚切開を閉じます。

5.肝臓の外部化

  1. ベタジンスクラブと70%エタノールで腹部を清掃します。
  2. 胸骨の付け根から上腹部の皮膚に ~1 cm の垂直切開を行います。鈍い解剖を使用して、皮膚を腹筋から分離します。皮膚と筋肉の大きな栄養血管を焼灼して、次のステップ中の出血を最小限に抑えます(図4A)。
  3. 皮膚を 1 ~ 2 cm 水平に切開し、続いて腹筋を横切開し、ステップ 5.2 で垂直切開を目に見える肝臓のほぼ上部で二等分します。焼灼ツールを使用して、皮膚の止血を支援します(図4B)。
    注:腹部切開のサイズは、肝臓の最適なイメージングにとって重要です。開口部が小さすぎると、肝動脈や門脈の過度の伸展やインピンジメントによる肝虚血のリスクがあります。開口部が大きすぎると、腸などの他の臓器も外部化され、イメージングに支障をきたす可能性があります。
  4. 2 in x 2インチのガーゼの中央に約1 cmの円を切り取り、温かい生理食塩水で湿らせます。開口部が切開部の中央に来るようにガーゼを配置します。切開部の端をそっと引き離し、腹部に軽く上向きの圧力をかけて肝臓を外側に押し出し、肝臓が湿らせたガーゼの上に簡単に乗れるようにします(図4C)。
  5. マウスをイメージングトレイの腹臥位に置き、肝臓をカバーガラスの中央に置きます(図4D)。
    注:対照動物では、肝臓はあずき色に見えるはずです。このプロトコルでは、双方向共鳴ヘッドスキャナーを備えた倒立型レーザー走査型共焦点顕微鏡がIVMに使用されます。そのため、3Dプリンタを使用してカスタムIVMトレイを作成しました(図5)。3Dプリント用に作成された.stlファイルが提供されます(補足ファイル1)。個々のニーズに合わせて調整が必要な場合があります。
  6. 動物を倒立顕微鏡に移します。

6. 肝臓生体内顕微鏡イメージング

注:このプロトコルでは、生体内顕微鏡検査に双方向共振ヘッドスキャナーを備えたレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用します。共振ヘッドの周波数を安定させるには、イメージングの前に少なくとも30分間システムの電源を入れてください。システムが異なれば、機能も異なる場合があります。これらについての議論は、この記事の範囲外です。特定のシステムの技術的な詳細については、機器の担当者にお問い合わせください。

  1. 麻酔の手術面を維持するためには、動物をイソフルラン送達システムに接続します。
    注:実験プロトコルによっては、機械的な換気が必要になる場合があります(自発換気に対して)。
  2. 直腸プローブを使用して、動物に放射加温パッドを置き、コア温度を37°Cに保ちます。
    注:このプロトコルでは、IVMトレイの周りにフィットする長方形のフォームが、放射加温パッドを配置するための絶縁体およびスペーサーとして機能します(図4D)。
  3. 対物砲塔を希望の倍率に設定し、必要に応じて浸漬油を塗布します。このプロトコルに従うには、60倍/NA1.30シリコーンオイル対物レンズと1倍光学ズームを使用します。
  4. 焦点面が特定されたら、肝臓の端近くの領域を避けて、≥10のランダムな視野を特定します。
    注:肝臓はフルオレセインイソチオシアネート(FITC)チャネルで自家蛍光を示すため、落射蛍光を使用して一般的な焦点面を迅速に特定します。.
    1. システムに応じて、FITCチャネルの落射蛍光を使用して可視肝臓のエッジを特定し、(x,y)ステージ座標を記録します。
    2. 肝臓の(x,y)境界と乱数ジェネレータを使用して、ランダムな(x,y)座標を特定します。許容可能な視野については、(a)視野全体に分散した血管の存在を探します。(b)同じ焦点面にある血管の≥80%。(c)≥1 肝臓の縁から離れた視野( 図6の例)。画像解析の焦点が肝正弦波の血小板-白血球-内皮相互作用にある場合は、直径が≥15 μm(マウス正弦波は通常、直径≤10 μm)の血管を持つフィールドを除外します。

7. 画像解析

注:この論文のすべての画像を処理するためにImageJ / FIJIが使用されました。FIJI(fiji.sc)は、Image J(imagej.nih.gov)のオープンソースバージョンであり、追加のプラグインとマクロ13を使用することでより多くの機能を備えています。

  1. ImageJ / FIJIでマルチチャンネルのタイムラプスファイルを開きます。
    注:プラットフォームによっては、追加のプログラム/プラグインが必要になる場合があります。ImageJ/FIJIには、オリンパスの.oirファイルなど、複数の異なるタイプのファイルを開くことができるBio-Formats Importerがあります。ここでは、より広く使用されている形式であるため、ファイルは.tifに変換されています。
  2. 正しいスケールが設定されていることを確認します。メタデータ/プロパティでピクセル/μm 比と時間間隔を探します。
  3. バックグラウンドノイズを除去するには、さまざまなフィルターを使用します(例:このプロトコルで使用される半径が2ピクセルの中央値フィルター)。後処理のばらつきを最小限に抑えるために、すべての画像間で処理が類似していることを確認します。これらの実験ではカウントと長さが比較されるため、平均蛍光強度の代わりに、細胞間相互作用の明瞭さと同定と測定を改善するためにフィルタリングします。
    注:フィルターの使用と大きさは、対象のターゲットのサイズと画像内の信号対雑音比によって異なります。
  4. 視野間には血管密度に不均一性があるため、選択ブラシを使用して各視野の総血管面積を測定します(図7)。
    1. 楕円選択ツールを右クリックし、選択ブラシツールを選択します。
    2. ブラシのサイズを調整するには、 選択ブラシ ツールのアイコンをダブルクリックします。
    3. 船舶をトレースして、それらを強調表示/選択します。選択範囲の一部を削除するには、[ alt]-左クリック 、[ shift]-左クリックでパーツを追加します。
    4. [M]を押して、選択した領域を測定します。
      注:画像スケールが適切に設定されている場合、出力はμm2で、mm2に変換されます。
  5. フィールド内の血小板と白血球の数を数えます。細胞が細胞体を30秒以上移動した場合、細胞を接着細胞と考え<。mm2あたりの細胞数(血小板および/または白血球)を計算します。
  6. 各血管内の相対的な血流を推定するには、前述の5に示すように、ImageJ/FIJI(imagescience.org/meijering/ software/mtrackj)14のMTrackJプラグインを使用して、代理として平均赤血球(RBC)速度を測定する。RBCをデキストランチャネルの丸型または円盤状の充填欠陥として識別します。記録保持、非同期解析、および検証のためにトラックを保存します。
    注: この例は、 図 8 と 補足ビデオ S1 に示されています。

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結果

炎症を起こした内皮への白血球接着におけるビメンチン桿体ドメインの影響の評価
白血球のP-セレクチン糖タンパク質リガンド-1(PSGL-1)の内皮および血小板への結合 P-セレクチンは、敗血症誘発性肝障害炎症の急性期に発生します。しかし、ビメンチンの組換えヒト桿体ドメイン(rhRod)は、P-セレクチンに結合し、内皮と血小板の両方への白血球の接着をブロックすることが示されています。このプロトコルは、敗血症のマウスモデルで利用され、肝臓でのPSGL-1依存性白血球接着に対するrhRodのリアルタイム効果を視覚化しました。rhRodは肝臓の正弦波でP-セレクチンと共局在し、実際には肝臓の白血球接着を減少させることがわかった5。

アセトアミノフェン誘発性肝障害における肝臓血小板動員
肝臓への血小板の蓄積は、APAP誘発性肝障害の一因となります。このプロトコルは、肝正弦波内の血小板の動員におけるキチナーゼ 3-like-1 (Chi3l1) の寄与を評価するために使...

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ディスカッション

この手法論文の目的は、恒常性維持条件下でエンドトキシンまたはAPAPの投与後、マウス肝臓の高解像度の生体内画像とビデオを確実にキャプチャするために必要な手順を概説することです。このプロトコルにより、肝臓における血小板-白血球-内皮相互作用に関するデータを一貫して作成することができましたが、成功に必要な多くの重要なステップと、このイメージングパラダイムを使用する際に避けるべき重要な落とし穴があります。このプロトコールを成功に導くには、細胞/タンパク質機能への干渉を避けるための抗体選択時の徹底的かつ広範な計画、組織の損傷を回避し、恒常性を維持するための適切な外科的技術、肝臓虚血や追加の臓器の外部化を避けるための肝臓外部化時のケア、および光/色素による組織損傷を回避するための適切なイメージング設定が必要です。

実践により、このプロトコルは、 in vivo での肝臓微小血管系の高品質で再現性のあるイメージングを可能にし、既存の研究方法や代替の研究方法と比較して大きなメリットがあります。ここでは、エンドト...

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開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に関与していませんでした。内容は、米国退役軍人省または米国政府の見解を表すものではありません。

謝辞

この研究は、NIH/NIGMS GM-123261 (FWL) と NIH/NHLBI HL139425 (JC) の支援を受けました。研究支援は、NIH/NHLBI HL116524からも資金提供を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
外科用品
2" x 2" 不織布スポンジMcKesson Med. Surg92242000肝臓の隔離
用#4-0 針付きシルク編組縫合SOFSILKN/A4-0 Softsilk コーティングされた編組黒、非吸収性: C-1 カッティングニードル
#4-0 針なしのシルク編組縫合EthiconN/A4-0 ブラック ブレイド シルク、非吸収性
21 G 鈍針 (0.5 インチ)SAI Infusion TechnologiesB21-50これは、人工呼吸器への接続を可能にするために気管切開チューブの端に取り付けるために使用されます。別の供給源は、Instech
23 G鈍針(0.5インチ)SAI Infusion TechnologiesB23-50シリンジへの接続を可能にするために血管カテーテルに使用されます。別の情報源は、Instech
Dissecting Scissors (Pointed Tip)Kent ScientificINS600393-GMicro Dissecting Scissors;カーバイドブレード;直;シャープポイント;ブレードの長さ24mm;4 1/2 "全長
マクファーソン·バンナスマイクロはさみ(バンナス)ケント科学INS600124これらは、気管や血管の開口部を作成するのに役立ちます
ポリエチレンチューブ 10InstechBTPE-10これは、カテーテルの血管内部分を作るために使用されます。別の供給源はBD Intramedic
Polyethylene tubing 50InstechBTPE-50。これは、カテーテルの血管外部分を作るために使用されます。 別の供給源はBD Intramedic
Polyethylene tubing 90InstechBTPE-90。これは気管切開チューブの製造に使用されます。 別のソースは、BD Intramedic
USPグレードの滅菌生理食塩水Coviden8881570121Hospira 0.0%塩化ナトリウム注射、USP
顕微鏡供給
イソフルラン送達システムおよび人工呼吸器ケントサイエンティフィックソムノスイートげっ歯類人工呼吸器と揮発性麻酔薬送達システム
の組み合わせです顕微鏡検査中にパッドを温めるためのフォームスペーサーN/AN/Aこのスペーサーは、高品質のフォームからカットする必要があり、肝臓顕微鏡トレイの周りにフィットし、特定の高さの寸法は顕微鏡システムに依存します
リンパスFV3000を備えたレーザー走査型共焦点顕微鏡システム我々は、共鳴ヘッドスキャナを使用してオリンパスFV3000の使用を説明していますが、このプロトコルは、ほとんどのイメージングシステムで動作します
肝臓顕微鏡トレイN/AN/A 肝臓顕微鏡トレイは、倒立顕微鏡のために設計されました
抗体&関連試薬
Brilliant Violet 421/anti-mouse Ly6G antibodyBioLegend1276283 µg /マウス。好中球
BV421/F4/80抗体BioLegend1231320.75 mg/kgを標識します。クッパー細胞を標識するには
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 カルシウムまたはマグネシウムなしGibco/ThermoFisher Scientific14190144抗体からアジ化ナトリウムを除去する透析液として使用されます
DyLight649/anti-GPIbβ 抗体emfret AnalyticsX6493 µg /マウス。血小板を標識するには
DyLight488/抗マウス GPIb&β; 抗体emfret AnalyticsX4886 µg /マウス。
Escherichia coli serotype O111:B4Sigma-AldrichL30245 mg/kgからの血小板エンドトキシンを標識する;エンドトキシンの効力はロットごとに異なる場合があります。したがって、エンドトキシンロット
PerCP-eFluor 710/anti-mouse P-selectin antibodyInvitrogen46-0626-824 µによる変動を最小限に抑えるために、一連の実験に同じロットを使用する必要があります。g /マウス。P-セレクチンの標識
Slide-a-Lyzer 7,000 MWCO カセットThermo Scientific66370アジ化ナトリウムを除去するための抗体の透析に使用
テキサスレッド標識デキストランSigma-AldrichT1287~150 kDa; 250 µg/マウス
TRITC/ウシ血清アルブミンSigma-AldrichA2289500 µg /マウス。生理食塩水で50 mg / mL(5%)のストック濃度に希釈します。.血管系にラベルを付けるために使用されます。炎症時には、高分子量デキストランよりも簡単に間質腔に漏れ
糸 糸 ですこれは、ですです共鳴ヘッドスキャナーオる可能性があります

参考文献

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