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方法論記事

出芽酵母における近接ライゲーションと定量PCRによる相同組換え中間体の検出

2.3K 閲覧数

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DOI：

10.3791/64240

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2022年9月11日

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1Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of California, Davis, 2Laboratory of Biology & Modeling of the Cell, École Normale Supérieure de Lyon, 3Department of Molecular & Cellular Biology, University of California, Davis

この記事について

サマリー

D-ループキャプチャー(DLC)およびD-ループ伸長(DLE)アッセイは、近接ライゲーションの原理と定量的PCRを利用して、 出芽酵母の誘導性二本鎖切断部位でのDループ形成、Dループ伸長、および産物形成を定量化します。

要約

細胞周期のS期およびG2期に発生したDNA二本鎖切断および鎖間架橋を含むDNA損傷は、相同組換え(HR)によって修復することができる。さらに、HRは、ストールまたは崩壊後のレプリケーションフォークレスキューの重要なメカニズムを表します。この複雑な経路の多くの可逆的および不可逆的なステップの調節は、その忠実度を促進します。HR中に形成される組換え中間体の物理的分析により、さまざまな核タンパク質因子とその相互作用因子によるこれらのコントロールの特性評価が可能になります。組換え経路の特定のイベントと中間体をアッセイする方法は十分に確立されていますが、この経路の2つの重要なステップであるDループの形成と伸長の検出は、最近まで困難であることが証明されていました。ここでは、HR経路における重要なイベント、すなわちDNA二本鎖切断形成、Dループ形成、Dループ伸長、およびサッカロミセス・セレビシエにおける切断誘導複製(BIR)を介した産物の形成を検出するための効率的な方法について説明しています。これらのアッセイは、関連する組換え中間体および生成物を高感度で検出し、細胞の生存率とは無関係です。Dループ、Dループ伸長、およびBIR製品の検出は、近接ライゲーションに基づいています。これらのアッセイを組み合わせることで、集団レベルでのHRの動態の研究が可能になり、経路の重要なステップでHRタンパク質と調節因子の機能に細かく対処できます。

概要

相同組換え(HR)は、DNA二本鎖切断(DSB)、鎖間クロスリンク、およびssDNAギャップの修復の忠実度の高いメカニズムであり、DNA損傷耐性の経路でもあります。HRは、非相同末端結合(NHEJ)やトランス病変合成などのDNA損傷修復/耐性のエラーが発生しやすい経路とは異なり、修復イベントをテンプレート化するためのドナーとして無傷の相同二重鎖DNAを利用します。さらに、HR経路の主要な中間体の多くは可逆的であり、個々の経路ステップの絶妙な調節を可能にします。細胞周期のS期、G2期、およびM期の間、HRは両末端DSBの修復をめぐってNHEJと競合します1。さらに、HRは、ssDNAギャップや片側DSBを含む複製関連DNA損傷の修復、およびDNA病変バイパスのメカニズムとして、DNA複製に不可欠です2。

HR経路の重要な中間体は、変位ループまたはDループです(図1)。末端切除後、反応の中心的なリコンビナーゼであるRad51が、壊れた分子の新しく切除されたssDNAに負荷をかけ、らせん状のフィラメント2を形成します。次に、Rad51は相同性検索を実行して、適切な相同ドナー、通常は体細胞内の姉妹染色分体を同定します。Dループは、Rad51-ssDNAフィラメントが相同二重鎖DNAに侵入すると形成され、切断された鎖とドナーの相補鎖とのワトソン-クリック塩基対形成をもたらし、反対側のドナー鎖を置換します。DNAポリメラーゼによる切断鎖の3'末端の伸長は、DNA損傷イベント中に失われた塩基を置き換え、合成依存性鎖アニーリング(SDSA)、ダブルホリデイジャンクション(dHJ)、または切断誘発複製(BIR)HRサブ経路を介して、拡張されたDループ中間体のdsDNA産物への分離を促進します。

HR経路の中間体を物理的にモニタリングするアッセイは、各ステップの遺伝的要件の分析(すなわち、パスウェイ解析)を可能にする。DSB形成、末端切除、dHJ、BIR複製バブル、およびHR産物は、サザンブロッティング3,4,5,6,7によって容易に観察されます。しかし、サザンブロッティングはDループの発生期および伸長について報告していないため、これらの関節分子を確実に測定するための代替方法が必要です4,8,9。新生Dループ形成を分析するために広く使用されている戦略の1つは、定量的PCR(qPCR)と組み合わせたRad51のクロマチン免疫沈降(ChIP)です10,11。しかしながら、ChIP-qPCRによって測定されるdsDNAとのRad51会合は、配列相同性およびRad51付属因子Rad5410、11とは無関係である。対照的に、ここで紹介するDループキャプチャ(DLC)アッセイと呼ばれるDループ分析の方法を使用したかなりのシグナルは、DSB形成、配列相同性、Rad51、およびRad51アクセサリータンパク質Rad52およびRad54に依存します8。サッカロマイセス・セレビシエRad51が促進したDループ形成がin vivoのRad54に依存するという発見は、Rad54が相同性検索と出芽酵母Rad51によるDループ形成に必要であることを示す多数のin vitro再構成実験と一致しています8,12,13,14,15。

主に半定量的PCRによるDループ伸長の測定に対する現在のアプローチも同様に問題があります。D-loop伸長を検出するための典型的なPCRベースのアッセイは、切断部位と異所性ドナーとの間の組換えおよびその後の組換え関連DNA合成から生じる固有の配列を、切断鎖上の相同性領域の上流のプライマーおよびドナー鎖上の相同性領域の下流にある別のプライマーを介して増幅する。この方法を使用する場合、組換え関連DNA合成の検出には、必須ではないPol δ処理性因子Pol32が必要です16。この発見は、POL32欠失がインビボでの遺伝子変換に軽度の影響を与えるという観察と矛盾する17。さらに、これらのPCRベースのアッセイは、Dループの伸長とBIR産物の形成を時間的に解決できず、シグナルがssDNA中間体ではなくdsDNA産物に起因することを示唆しています17,18,19。Dループ伸長(DLE)アッセイは、これらの不一致に対処するために最近開発されました。DLEアッセイは、最初の3'浸潤末端9の下流~400塩基対(bp)の部位での組換え関連DNA合成を定量します。この方法では、Dループの伸長はPol32とは無関係であり、DSB誘導後4時間以内に検出可能ですが、BIRプロダクトは6時間で最初に観察されます。実際、ハーバー研究所とマルコバ研究所からの最近の出版物は、ゲノムDNAの調製この方法を単独で使用すると、ssDNAの保存がもたらされることを指摘しています9,20。

ここでは、DLCおよびDLEアッセイについて詳細に説明する。これらのアッセイは、S. cerevisiaeの新生および伸長Dループを検出するために近接結紮に依存しています(図2)8,9。BIR製品は、これと同じアッセイシステムを使用して定量できます。両方のアッセイについて、染色体上のURA3遺伝子座に位置するHOエンドヌクレアーゼ切断部位でのDSB形成(Chr.V)は、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下でのHOエンドヌクレアーゼの発現によって誘導される。Rad51を介したDNA鎖の侵入は、Chr. IIのLYS2遺伝子座に位置する異所性ドナーの部位で新生Dループ形成を引き起こします。DSBの右側はドナーとの相同性を欠いているため、SDSAおよびdHJ形成による修復は実行不可能です。BIRによるDSBの初期修復は可能であるが、生存可能な生成物の形成はセントロメア21の存在によって阻害される。この意図的な設計により、生産的なDSB修復が妨げられ、それによって、時間経過分析中に培養物を追い越す可能性のある、修復されたDBSを持つ細胞による増殖の再開を回避します。

DLCアッセイでは、Dループ内のヘテロ二本鎖DNAの2本鎖のソラレン架橋は、組換え中間体を保存します。切断された(切除された)鎖上の制限酵素部位の修復および消化に続いて、架橋は相同な切断およびドナーDNAの上流のユニークな配列のライゲーションを可能にする。qPCRを使用して、各サンプルに存在するキメラDNA分子のレベルを定量します。DLEアッセイでは、架橋は不要であり、制限酵素部位の回復と消化に続いて分子内ライゲーションを行い、代わりに壊れた分子の5'末端を新しく伸長した3'末端に結合させます。ここでも、qPCRを使用して、各サンプル中のこのキメラ産物の相対量を定量します。制限酵素部位の修復がない場合、DLEアッセイは、Dループ伸長後に形成されるBIR(dsDNA)産物の相対レベルについて報告します。

野生型株を用いた各アッセイの代表的な結果が示され、組換え変異株の分析のためのこれらのアッセイの使用について、読者はPiazzaら8およびPiazzaら9に参照される8、9。この貢献の目的は、他のラボがDLCおよびDLEアッセイを採用できるようにすることであり、リクエストに応じてそれらのサポートを利用できます。

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プロトコル

1.成長前、DSB誘導、およびサンプル収集

注:Ade-株には、0.01%のアデニンをすべての培地に補充することをお勧めします。.

  1. 酵母ペプトンデキストロースアデニン(YPDA)(1%酵母エキス、2%ペプトン、2%グルコース、2%寒天、0.001%アデニン)に適切な一倍体株( 表1を参照)をストリークアウトし、30°Cで2日間増殖させます。
  2. シングルコロニーを使用して、15 mLのガラス培養チューブに5 mLのYPDAを接種します。培養物を30°Cで飽和まで成長させ、通気のために振とうまたは回転させます。
  3. DLCアッセイ:5xソラレンストック溶液(200プルーフエタノール中の0.5 mg / mLトリオキシサレン)を、アルミホイルで包んだ50 mLコニカルチューブにソラレンを溶解し、室温で一晩、連続的に振とうまたは反転させることにより、ドラフトで調製します。蒸発を防ぐために、スクリュートップを透明フィルムで密封します。ソラレンの適切な溶解を確実にするために、50 mLのコニカルチューブあたり7 mLを超える5xソラレンストック溶液を調製しないでください。.
  4. 翌日、5 mLのYPDAを一晩培養して、50-100 mLのYEP乳酸塩(1%酵母エキス、2%ペプトン、2%w/w乳酸塩、0.001%アデニン)を適切なサイズのフラスコに接種します(出芽酵母は、培養物の少なくとも5倍の容量のフラスコで最適に増殖します)OD600 ~0.03。
  5. 培養物を30°Cで~16時間増殖させ、220rpmで振とうします。~16時間後、培養液のOD600 を測定すると、~0.5-0.8になります。生い茂った文化や生い茂った文化は使用しないでください。
  6. 各時点について、適切な量の細胞を円錐形のチューブに集め、氷の上に置きます。通常、これはDLCアッセイの場合は1 x 108細胞(一倍体野生株の場合はOD 600 1.0で約7.5 mLの培養)、DLEアッセイの場合は5 x 107細胞(OD600 1.0で約2.5 mLの培養)です。
  7. OD 600値の精度を確保するには、OD600≥0.2の培養液に対して1:5希釈液を調製して、OD測定値を0.2以下に保ちます。野生型株の場合、DLC分析の最適時点は2時間から6時間の間であり、DLE分析の最適時点は4時間から8時間の間です(図3および図4を参照)。
  8. DLCアッセイ
    1. 各時点の前に、ホイルで包まれた50 mLコニカルチューブ内のすべてのサンプルに対して、ヒュームフードで十分な1xソラレン溶液(0.1 mg/mLトリオキサレン、50 mM Tris-HCl pH 8.0、50 mM EDTA pH 8.0、20%エタノール)を準備します。RTに出発します。
    2. サンプルを2,500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 ペレットをヒュームフード内の2.5 mLの1xソラレン溶液に再懸濁し、60 mm x 15 mmのペトリ皿に移します。あるいは、ペレットを2.5 mLのTE1溶液(50 mM Tris-HCl pH 8.0、50 mM EDTA pH 8.0)に再懸濁して、非架橋制御を行います。
    3. サンプルをクロスリンクします。長波(365 nm)電球に適合するUV架橋剤の場合は、-20°Cで事前に冷却されたプラスチックまたはプレキシガラスプレートの上に蓋を外した状態で、UV光源の1〜2 cm下にペトリ皿を配置します。UVライトボックスの場合は、ペトリ皿をUV光源の真上に置きます。穏やかに振とうしながらサンプルを10分間露光します。
      注意: UV光源は、~50rpmに設定されたオービタルシェーカーの上に設定することをお勧めします。
    4. ドラフト内で、サンプルを新しい15 mLチューブに移します。ペトリ皿を2.5 mLのTE1溶液ですすぎ、これをチューブに加えます。サンプルを2,500 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を適切に廃棄し、ペレットを-20°Cで保存します。 サンプルは、次のステップに進む前に最大1週間保存できます。
  9. DLEアッセイ
    1. サンプルを2,500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 スピンを繰り返して-20°Cで保存する前に、2.5 mLの冷たいTE1溶液でセルペレットを洗浄します。 サンプルは、次のステップに進む前に最大1週間保存できます。
  10. 0時間での試料採取のために、20%ガラクトースを添加する前に試料を採取する。その後の時点で、20%ガラクトースを最終濃度2%まで培養物に添加することにより、DSB形成を誘導します。上記のように残りのサンプルを収集し、ペレットし、DSB誘導後の時間に対して凍結する(すなわち、20%ガラクトースの添加の4時間後に4時間サンプルを収集する)。

2. 細胞形成、溶解、制限部位の修復

  1. サンプルを氷上で解凍します。ドライバスを30°Cに予熱します。
  2. サンプルを1 mLのスフェロプラストバッファー(0.4 M ソルビトール、0.4 M KCl、40 mMリン酸ナトリウムバッファーpH 7.2、0.5 mM MgCl2)に再懸濁し、1.5 mLの微量遠心チューブに移します。
  3. 3.5 μLのザイモリアーゼ溶液(2%グルコース、50 mM Tris-HCl pH 7.5、5 mg/mL ザイモリアーゼ100T、17.5 μg/mLザイモリアーゼ最終濃度)を加えます。タップまたは反転して穏やかに混ぜます。30°Cで15分間インキュベートし、氷の上に置きます。15分間のインキュベーション中に、液体窒素またはドライアイスを入手します。
  4. 4°Cで2,500 x g で3分間遠心分離し、サンプルを氷上に置きます。サンプルを1 mLのスフェロプラストバッファーで3回洗浄します。サンプルを4°Cで2,500 x g で3分間遠心分離します。
  5. サンプルを1 mLの冷たい1x制限酵素バッファー(50 mM酢酸カリウム、20 mM酢酸トリス、10 mM酢酸マグネシウム、100 μg/mL BSA pH ~8.0 室温)に再懸濁し、4°Cで16,000 x g で3分間遠心分離します。 サンプルを氷の上に置きます。洗浄を1回繰り返します。
  6. サンプルを1 mLの冷たい1x制限酵素バッファーに再懸濁します。サンプル(各0.5 mL)を2本の1.5 mLマイクロ遠心チューブに分割します。サンプルを4°Cで16,000 x g で3分間遠心分離します。
  7. 各サンプルのチューブ1本をハイブリダイズオリゴを含む1.4倍制限酵素バッファー180 μLに再懸濁し( 表2を参照)、オリゴをハイブリダイズせずに180 μLの1.4倍制限酵素バッファーに1本チューブを再懸濁します。各ハイブリダイジングオリゴを1x TE(10 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM EDTA pH 8.0)に再懸濁し、最終濃度7 nMで使用します。1x TEは、ハイブリダイズオリゴを使用せずに、1.4x制限酵素バッファー中のハイブリダイズオリゴを置き換えます。
    注:ハイブリダイジングオリゴは、作業希釈で少量のアリコートで-20°Cで保存する必要があります。ハイブリダイズするオリゴの濃度は最適化を必要とするかもしれません。「ディスカッション」を参照してください。
  8. サンプルを液体窒素またはドライアイス/エタノールでスナップ凍結し、-80°Cで保存します。 サンプルはこの段階で数ヶ月間保管することができます。

3. 制限酵素消化物と分子内ライゲーション

  1. サンプルを氷上で解凍します。1つのドライバスを65°Cに、もう1つのドライバスを37°Cに予熱します。
  2. 36 μLのサンプルを氷上で新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れます。残りのサンプルは速やかに-80°Cに戻して保管してください。
  3. 4 μLの1% SDS(最終濃度0.1%)を加え、チューブの側面を軽くたたいて混ぜます。65°Cで15分間インキュベートし、5分ごとに軽くたたきます。インキュベーション直後にサンプルを氷上に置きます。
    注:このSDS処理は、制限酵素消化および分子内ライゲーションステップの前に、DNA関連タンパク質の変性、核膜の可溶化、およびクロマチンアクセシビリティを促進します。
  4. 4.5 μLの10%トリトンX-100(1%最終濃度)を加え、ピペッティングで混合します。各サンプルに20〜50 Uの制限酵素(EcoRI-HFまたは HindIII-HF)を加え、37°Cで1時間インキュベートし、20〜30分ごとに穏やかに攪拌します。この間、ドライバスを55°Cに予熱し、ウォーターバスを16°Cにプリセットします。
  5. 各サンプルに8.6 μLの10% SDS(最終濃度1.5%)を加え、ピペッティングとタッピングで混合します。55°Cで10分間インキュベートします。各サンプルに10%Triton X-100(最終濃度6%)を80 μL加え、ピペッティングで混合します。
  6. ATPを含まない660 μLの1xライゲーションバッファー(50 mM Tris-HCl pH 8.0、10 mM MgCl 2、10 mM DTT、2.5 μg/mL BSA)+ 1 mM ATP pH 8.0 + T4 DNAリガーゼ(8 U/サンプル)を各サンプルに加え、穏やかな反転で混合します。16°Cで1.5時間インキュベートし、30分ごとに反転させます。インキュベーション直後にサンプルを氷上に置きます。

4. DNA精製

  1. 1つのドライバスを65°Cに、もう1つのドライバスを37°Cに予熱します。 各サンプルに1 μLの10 mg/mLプロテイナーゼK(1x TE pH 8.0で調製)を加えます(最終濃度12.5 μg/mL)。65°Cで30分間インキュベートし、インキュベーション直後にサンプルを氷上に置いて冷えます。
  2. サンプルを2 mLチューブに移します。ドラフト内で作業し、各サンプルに等量(~800 μL)のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(P/C/IA;pH 8.0)を加えます。サンプルを~30秒間ボルテックスし、マイクロ遠心分離機で16,000 x g で5〜10分間遠心分離します。
  3. 各サンプルの上相600 μLを新しい1.5 mLチューブに慎重に取り出します。下相と2mLチューブは適切に廃棄してください。
  4. 各サンプルに1/10容量の3 M酢酸ナトリウムpH 5.2(~60 μL)を加え、続いて1容量のイソプロパノール(~660 μL)を加えてDNAを沈殿させます。サンプルを5倍〜10倍反転させ、RTで30分間インキュベートします。
  5. サンプルを氷上に2分間置き、マイクロ遠心分離機でサンプルを16,500 x g で4°Cで15分間遠心分離します。サンプルを氷に戻し、上清を注ぎ、ペーパータオルでチューブを排出します。
  6. DNAペレットを200 μLの70%エタノールで洗浄します。16,500 x g で4°Cで3分間遠心分離し、サンプルを氷上に戻し、上清を注ぎ、ピペットで残留アルコールを除去します。チューブのキャップを開いた状態でサンプルを37°Cで15〜20分間乾燥させます。
  7. DNAペレットをボルテックスにより1x TEの50 μLに再懸濁します。RTで30分間インキュベートし、ボルテックスした後、37°Cのドライバスで30分間インキュベートします。サンプルを再度ボルテックスしてから、氷の上に置きます。サンプルはこの段階で-20°Cで数ヶ月間保存できますが、脱架橋(DLCのみ)およびqPCRステップをすぐに進めることをお勧めします。

5.ソラレン架橋反転(DLCアッセイのみ)

  1. 精製されたDNA9 μLを氷上でPCRチューブに入れます。1 M KOH(最終濃度0.1 M)を1 μL加えます。サンプルをサーモサイクラーで90°Cで30分間インキュベートします。
  2. 19.73 μLの酢酸ナトリウム溶液(0.1 M酢酸ナトリウム、9.6 mM トリス塩酸塩pH 8.0、1.0 mM EDTA pH 8.0)を加えます。サンプルはこの段階で-20°Cで数ヶ月間保存できますが、すぐにqPCRステップに進むことをお勧めします。

6. 定量的PCR、コントロール、および分析

  1. 2 μLの精製DNAを使用して、架橋の有無にかかわらず、製造元の指示に従って20 μLのqPCR反応を設定します。各リアクションを重複して設定します。DLCアッセイとDLEアッセイの両方で、5つのコントロール反応と1つのDLC/DLE定量反応、またはサンプルあたり合計6つの反応が重複して実行されます。付表 S1 および 付録S2 は、これらの反応および分析をセットアップするためのテンプレートを提供し、qPCRプライマーの配列を 表3に列挙する。
  2. qPCRサイクル条件は、qPCRキットごとに最適化する必要があります。
    1. 使用する qPCR キットに応じて、以下のDLC qPCR条件を使用します: 初期変性 (95 °C で 3 分間);50ラウンドの増幅(1回のアクイジションで95°Cで15秒、61°Cで25秒、72°Cで15秒)。融解曲線解析(95°Cで5秒間、65°Cで1分間、97°Cで連続取得);冷却(37°Cで30秒間)。
    2. DLEアッセイには以下のqPCR条件を使用します:初期変性(95°Cで5分間);50ラウンドの増幅(1回の取得で15秒間で95°C、30秒間で60°C、15秒間で72°C);融解曲線解析(95°Cで5秒間、65°Cで1分間、97°Cで連続取得);冷却(37°Cで30秒間)。異なるqPCRマシン/キットの最適化が必要な場合があることに注意してください。
  3. DLCアッセイ
    1. コントロール: 表3のqPCRプライマーのリストを参照してください。プライマー結合部位のマップを 図S1に示す。関連するゲノムの特徴とアンプリコンの補足配列ファイルについては、Aプラスミドエディター(ApE)ファイルを確認してください。 補助シーケンスファイル 1-5.
      1. ARG4のゲノムDNA:olWDH1760/olWDH1761を使用して、ARG4にあるdsDNAを増幅します。この反応を負荷コントロールとして使用し、このコントロールに対するDLCシグナル反応を除く他のすべての反応を正規化します。
      2. DAP2での分子内ライゲーション効率:DLCライゲーションと並行して分子内ライゲーションにEcoRI消化によって作成された1,904 bpフラグメントを使用します。このライゲーション接合部を横切る増幅は、分子内ライゲーション効率を報告し、DLCシグナルが正規化されるコントロールとして機能します。
      3. DSB誘導:olWDH1766 / olWDH1767を使用して、誘導されたDSBにまたがる領域を増幅します。
      4. ソラレン架橋および切除:olWDH2019/olWDH2020を使用して、 EcoRI認識部位の下流にある固有のPhiX領域を増幅します。架橋反転なしで、 ARG4 (架橋dsDNA)に対するssDNA(架橋なし)の比率を使用して、架橋効率を決定します。クロスリンク反転では、切除は ARG4に対して信号の1から0.5への漸進的な減少をもたらす。
      5. エコアールI認識部位の修復と切断:olWDH1768 / olWDH1764を使用して、切除された鎖上のDSBの上流にある復元されたEcoRI認識部位にまたがる領域を増幅します。olWDH1769/olWDH1763は、DAP2のEcoRI制限酵素部位にまたがる領域を増幅します。この部位でEcoRI切断を行い、分子内ライゲーションコントロールとして使用する。
    2. DLCシグナル:olWDH1764/olWDH1765を使用して、切除(侵入)鎖とドナーの分子内ライゲーションによって作成されたキメラDNA分子を増幅します。
    3. 分析: 重複する各反応のCp値の平均と標準偏差を計算します。 ARG4 ゲノムDNA qPCR Cp値を基準として使用して、他のすべてのコントロールqPCRを正規化します。DLCシグナルを DAP2の分子内ライゲーションコントロールに正規化します。2時間での標準的なDLC信号値については 、図3 を参照してください。
  4. DLEアッセイ
    1. コントロール: 表3のqPCRプライマーのリストを参照してください。プライマー結合部位のマップを 図S1に示す。関連するゲノムの特徴とアンプリコンの補足配列ファイルについては、Aプラスミドエディター(ApE)ファイル(補足配列ファイル1〜5)を確認してください。
      1. ARG4のゲノムDNA:セクション6.3.1.1を参照してください。
      2. YLR050Cでの分子内ライゲーション効率:HindIII消化を使用して、DLEライゲーションと並行して分子内ライゲーションを受ける765 bpフラグメントを作成します。このライゲーション接合部を横切る増幅は、分子内ライゲーション効率を報告し、DLEシグナルが正規化されるコントロールとして機能します。
      3. DSB誘導:セクション6.3.1.3を参照してください。
      4. 後肢III認識部位の修復と切断:olWDH2010/olWDH2012およびolWDH2009/2011を使用して、それぞれ切除および伸長した切断鎖上の HindIII制限酵素部位にまたがる領域を増幅します。
    2. DLEシグナル:olWDH2009/olWDH2010を使用して、DSBの上流にある侵入鎖の切除された末端からDSBの下流の新しく伸長した末端への分子内ライゲーションによって作成されたキメラDNA分子を増幅します。
    3. 分析: 重複する各反応のCp値の平均と標準偏差を計算します。 ARG4 ゲノムDNA qPCR Cp値を基準として使用して、他のすべてのコントロールqPCRを正規化します。DLEシグナルを YLR050Cの分子内ライゲーションコントロールに正規化します。6時間での典型的なDLE信号値は、 図4 および以前の出版物9で報告されています。

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結果

DLCアッセイ
DLCアッセイは、部位特異的DSBの単一のドナーへの侵入によって形成される新生および拡張Dループの両方を検出します(図2)。ソラレン架橋は、Dループ内のヘテロ二本鎖DNA を介して 切断鎖とドナーを物理的に結合します。切断の切除された鎖上の長いハイブリダイズオリゴによる制限酵素部位の修復は、制限酵素切断を可能にし、続いて切断された鎖を近位ドナーにライゲーションして、qPCRによって定量されるキメラ生成物を形成します。特に、DLCシグナルは、ソラレン架橋、ハイブリダイズオリゴ、中央リコンビナーゼ、Rad51、およびRad51アクセサリー因子Rad52およびRad548に依存します。DNAヘリカーゼ/トポイソメラーゼSgs1-Top3-Rmi1、Mph1、およびSrs2の欠失は、DLCシグナルの増加につながります。

図 3は、ハイブリダイズオリゴの...

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ディスカッション

提示されたアッセイは、近接ライゲーションとqPCRを使用して、新生および伸長Dループ(DLCアッセイ)、Dループ延長(DLEアッセイ)、およびBIR産物形成(ハイブリダイズオリゴヌクレオチドを含まないDLEアッセイ)の検出を可能にします。DSBから離れた部位へのRad51のChIP-qPCRは、Rad51を介した相同性検索およびDループ形成のプロキシとして以前に使用されてきた。しかしながら、このChIP-qPCRシグナルは、切断部位と潜在的なドナーとの間の配列相同性、ならびにRad51関連因子Rad54とは無関係であり、したがって、Dループ中間体よりもRad51-ssDNAフィラメントとdsDNAとの間の一過性の関連を表す可能性が高い10,11。対照的に、DLCシグナルは、DSB形成、Rad51、Rad52、Rad54、およびDSBとアッセイされたドナー部位との間の共有配列相同性に依存する8。さらに、Mph1およびSrs2ヘリカーゼ、およびSgs1-Top3-Rmi1ヘリカ...

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開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

Heyer研究所での作業は、GM58015およびGM137751からW.-D.H.への助成金によってサポートされています。ピアッツァ研究所での研究は、欧州研究会議(ERC-StG 3Dループ、グランドコングリーメント851006)によってサポートされています。D.R.はT32CA108459とA.P.ジャンニーニ財団の支援を受けています。Shih-Hsun Hung(Heyer Lab)がDLC/DLEアッセイの結果を共有し、このプロトコルに詳述されているアッセイの変更をさらに検証してくれたことに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
<ストロング>1.成長前、DSB誘導、およびサンプル収集<
strong>機器
15および50 mLコニカルチューブ
15 mLガラス培養チューブ
250 mL、500 mL、または1 Lフラスコ
60 mm x 15 mmの光学的に透明なペトリ皿、平底推奨: コーニング、カタログ番号 430166; または Genesee Scientific、カタログ番号 32-150G
ベンチトップ遠心分離機、15 mL および 50 mL コニカルチューブアダプター
ベンチトップオービタルシェーカーまたはチューブローテータ/リボルバー
ローテーター
UV クロスリンカーまたはオービタルシェーカーの上に 365 nm UV 電球をセットしたライトボックス推奨: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) または Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK、カタログ番号
611110831Materials
60% w/w ナトリウム DL-乳酸シロップSigma-AldrichL1375培地調製用
寒天フィッシャーBP1423500培地調製用
バクトペプトンBD Difco211840培地調製用
バクト酵母抽出物BD Difco212750培地調製用
D-(+)-グルコースBD Difco0155-17-4培地調製用
TrioxsalenSigma-AldrichT6137ソラレン架橋用
2.スフェロプラスティング、溶解、および制限酵素部位の修復<
strong>消耗品
1.5 mLマイクロ遠心チューブ
ドライバス
液体窒素またはドライアイス/エタノール
冷蔵マイクロ遠心分離機またはマイクロ遠心分離機
Materials
10X制限酵素(CutSmart)緩衝液(500 mM酢酸カリウム、200 mMトリス酢酸、100 mM酢酸マグネシウム、1 mg / mL BSA、pH 7.8-8.0)
Zymolyase 100TUS BiologicalZ1004spheroplasting
3.制限酵素消化物および分子内ライゲーション
Supplies
Water bath
Materials
EcoRI-HFNew England BiolabsR3101DLCアッセイHindIII-HF用制限酵素消化
ニューイングランドバイオラボR3104DLEアッセイ
T4 DNAリガーゼニューイングランドバイオラボズM0202内ライゲーション
4。DNA 精製
Supplies
1.5 and 2 mL 微量遠心チューブ
材料
フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール (P/C/IA) at 25:24:1Sigma-AldrichP2069DNA purification
<ストロング>5。ソラレン架橋反転
サプライ
サーモサイクラー/PCRマシン
<ストロング>6. qPCR
<ストロング>サプライ
ライトサイクラー 480ロシュレ5015278001著者が使用したqPCR装置
著者が使用するLightcycler 96Roche5815916001qPCRマシン
Materials
LightCycler 480 96ウェルプレート、白色Roche472969200196ウェルプレート、qPCR用
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super MixBioRad1725271qPCRキット
著者が使用するSYBR Green I Master Mix著者4707516001qPCRキット
付き物のための制限酵素消化物 分子<ストロング>のらが使用したRoche

参考文献

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