1分子FRETを用いた膜受容体の立体構造ダイナミクスの可視化

Summary

この研究では、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)の単一分子蛍光共鳴エネルギー移動(smFRET)実験を実行するための詳細な手順を示します 非天然アミノ酸(UAA)の取り込み による 部位特異的標識を使用します。このプロトコルは、smFRETサンプル調製、実験、およびデータ分析のためのステップバイステップガイドを提供します。

Abstract

細胞が外部シグナルに応答する能力は、細胞の発生、成長、および生存に不可欠です。環境からの信号に応答するには、細胞がそれを認識して処理できなければなりません。この課題は主に膜受容体の機能に依存しており、その役割はシグナルを細胞の生化学的言語に変換することである。Gタンパク質共役型受容体(GPCR)は、ヒトにおける膜受容体タンパク質の最大のファミリーを構成しています。GPCRの中でも、代謝型グルタミン酸受容体(mGluRs)は、絶対二量体として機能し、リガンド結合部位を含む大きな細胞外ドメインを有するユニークなサブクラスです。mGluRの構造研究における最近の進歩は、それらの活性化過程の理解を改善しました。しかし、活性化および調節中のmGluRを介した大規模な立体配座変化の伝播はよくわかっていません。単一分子蛍光共鳴エネルギー移動(smFRET)は、生体分子の構造ダイナミクスを単一タンパク質レベルで視覚化および定量化するための強力な手法です。mGluR2活性化の動的プロセスを視覚化するために、非天然アミノ酸(UAA)の取り込みに基づく蛍光立体配座センサーが開発され、受容体の天然構造の摂動なしに部位特異的タンパク質標識が可能になりました。ここで説明するプロトコルでは、新しいUAAラベリングアプローチ、サンプル調製、smFRETデータの取得と分析など、これらの実験の実行方法について説明します。これらの戦略は一般化可能であり、さまざまな膜タンパク質の立体構造ダイナミクスを調べるために拡張することができます。

Introduction

原形質膜を横切る情報の伝達は、膜受容体の機能に大きく依存しています¹。受容体へのリガンド結合は、立体構造変化および受容体活性化をもたらす。このプロセスは、本質的にアロステリックであることがよくあります²。800を超えるメンバーを持つGタンパク質共役型受容体(GPCR)は、ヒトにおける膜受容体の最大のファミリーです³。ほぼすべての細胞プロセスにおける役割により、GPCRは治療薬開発の重要な標的となっています。GPCRシグナル伝達の標準モデルでは、アゴニストの活性化は受容体の立体構造変化をもたらし、続いてG_αのヌクレオチド結合ポケットでGDPとGTPの交換を介してヘテロ三量体Gタンパク質複合体を活性化します。活性化されたG_α-GTPおよび_Gβγサブユニットは、下流のエフェクタータンパク質の活性を制御し、シグナル伝達カスケードを伝播します^4,5。このシグナル伝達プロセスは、本質的に、受容体の三次元形状を変化させるリガンドの能力に依存する。リガンドがこれを達成する方法の機構的理解は、新しい治療法を開発し、合成受容体とセンサーを設計するために重要です。

代謝型グルタミン酸受容体(mGluRs)は、クラスC GPCRファミリーのメンバーであり、グルタミン酸の遅い神経調節効果とニューロンの興奮性を調整するために重要です^6,7。すべてのGPCRの中で、クラスCのGPCRは、それらが絶対二量体として機能するという点で構造的に独特である。mGluRには、ハエトリソウ(VFT)ドメイン、システインリッチドメイン(CRD)、膜貫通ドメイン(TMD)の3つの構造ドメインが含まれています⁸。活性化プロセス中の立体配座変化は複雑であり、12 nmの距離にわたって伝播する局所的およびグローバルな立体配座結合、および二量体の協調性が含まれます。中間的な立体配座、状態の時間的秩序、状態間の遷移速度は不明です。個々の受容体の立体構造をリアルタイムで追跡することにより、活性化中の一過性の中間状態と立体構造変化のシーケンスを特定することができます。これは、mGluR2 11の活性化中の立体構造変化の伝播を視覚化するために最近適用されたように、単一分子蛍光共鳴エネルギー移動^9,10(smFRET)を適用することによって達成することができる。FRET実験の重要なステップは、目的のタンパク質にドナーおよびアクセプター蛍光色素を部位特異的に挿入することによるFRETセンサーの生成です。非天然アミノ酸(UAA)取り込み戦略が採用されました^12,13,14,15システインレス変異体の作成または大きな遺伝的にコードされたタグの挿入を必要とする典型的な部位特異的蛍光標識技術の限界を克服するため。これにより、mGluR2のリガンド結合ドメインとシグナル伝達ドメインを結合した必須のコンパクトなアロステリックリンカーの立体構造再配列を観察することができました。このプロトコルでは、銅触媒によるアジ化環化反応を用いて蛍光色素を結合させるためのUAAによるmGluR2の部位特異的標識のアプローチなど、mGluR2でsmFRET実験を行うためのステップバイステップガイドを紹介します。さらに、このプロトコルは、膜タンパク質の直接捕捉およびデータ解析のための方法論を記述する。ここで概説したプロトコルは、他の膜タンパク質の立体構造ダイナミクスの研究にも適用できます。

Protocol

プロトコルの全体的なワークフローを 図 1 に示します。

1.サンプルチャンバーの準備

1. スライドとカバーガラスのクリーニング
   注意: これらの手順は、スライドの表面とカバーガラスを洗浄し、アミノシラン化の準備をすることを目的としています。表面テザー分子で単一分子蛍光実験を実施するための重要な要件の1つは、不動態化表面です。最も信頼性が高く再現性のあるパッシベーション技術は、不活性ポリマー鎖を緻密な層としてガラス表面に共有結合させることを含む。ポリエチレングリコール(PEG)は、表面パッシベーションに使用される最も効率的なポリマーです¹⁶。PEG(PEG化)を用いたパッシベーション手順の詳細を以下に説明する:
   1. スライドに開ける穴をマーカーでマークします(~6 mm離れて、端から離れています)。ドレメルを使用して、スライドガラスに小さな穴(直径1 mm)を開けます。掘削プロセス中にスライドを水に浸します。
   2. スライドをアセトンで洗って、マーカーから残留インクを取り除きます。
   3. アセトンから取り出し、スライドを水ですすぎ、高出力(700 W)の水中で5分間電子レンジで加熱します。
   4. 超音波処理するためにガラス染色瓶に入れる前に、水でスライドをきれいにします。カバーガラスを別の染色瓶に入れます。
   5. 23°Cのバス超音波処理器で30分間アセトンでスライドとカバーガラスを超音波処理します。
   6. その間に、次工程で用いるアミノシラン化溶液を調製するためのガラス製フラスコを洗浄する。フラスコを1M KOHで満たし、フラスコを30分間超音波処理し、KOHを水で徹底的に洗い流し、メタノール中でさらに30分間超音波処理する。アミノシラン化工程の時点までフラスコをメタノール中に置いておく。
   7. その間に、アミノシラン、mPEG、およびビオチン-PEGを冷凍庫(-20°C)から取り出し、暗所で室温(RT)にします。
   8. スライドとカバーガラスの瓶からアセトンを適切な化学廃棄物容器に処分し、水で十分にすすぎ、5 M KOHでスライドを30分間超音波処理します。
   9. スライドとカバーガラスを水ですすぎ、メタノールで2分間超音波処理します(2回繰り返します)。アミノシラン化ステップまでメタノールで満たされたジャーを残します。
      注:この研究では、特に明記されていない限り、脱イオン水が使用されます。23°Cで動作するバス超音波処理器が使用されます。
2. アミノシラン化
   注意: このステップは、アミノシランをきれいなスライドとカバーガラスの表面に共有結合させることを目的としています。官能化されたmPEGおよびビオチン-PEGは、次のステップでこの表面に共有結合します。
   1. 清潔なフラスコでアミノシラン化混合物を調製する(ステップ1.6)。メタノール(150 mL)、酢酸(7.5 mL、ガラスピペットを使用)、およびアミノシラン(2.5 mL)を混合して溶液を調製します。
   2. 化学ヒュームフードで溶液を穏やかに混合し、スライドジャーとカバーガラスジャーに注ぎます。カバーガラスには50 mL、スライドには100 mLを使用します。スライドとカバーガラスが溶液に完全に浸されていることを確認してください。
   3. 10分間インキュベートし、次に1分間ジャーを超音波処理し(超音波処理は表面から不純物を除去します)、さらに10分間インキュベートします。
   4. アミノシラン化溶液を廃棄物収集容器に廃棄する。瓶にメタノールを加え、蓋で瓶を閉め、手でそっと振る。メタノールを処分し、瓶に水を入れます。
   5. アミノシランボトルを冷凍庫(-20°C)に戻します。
3. ペグ化
   注意: これらの手順では、PEG化手順について説明します。
   1. アミノシラン化の際には、ペグ化バッファーを調製します。84 mgの重炭酸ナトリウム(NaHCO₃)を量り、10 mLの水(10 mM)に加えます。さらに、mPEGとビオチン-PEGの重量を量り、脇に置きます。6枚のスライドとカバーガラスには、96 mgのmPEGと1.2〜2.4 mgのビオチン-PEGを使用します。
      注:ビオチン-PEGはバックグラウンドスポットの数を増やす可能性があるため、あまり多く追加しないことが重要です。スライドに適用する直前までPEG混合物を溶解しないでください。
   2. スライドを水ですすぎ、穏やかなエアブローで乾かしてから、加湿した組み立てボックスに入れます。
      注:クリーンな航空会社を使用することが不可欠です。ガラスに残留物を残す可能性のある圧縮された缶詰の空気の使用は避けてください。
   3. PEG粉末混合物にペグ化バッファーを加え、ピペットでゆっくりと上下に複数回ピペットで溶解します。スライドあたり55 μLのペグ化バッファーを追加します(6枚のスライドの場合は、330 μLのペグ化バッファーを追加します)。
   4. 9,600 x g で23°Cで1分間遠心分離し、未溶解粒子を沈殿させます。次のステップで使用する上清を収集します。
      注:ビオチン-PEGは、NHSグループの存在により急速に加水分解します。混合と遠心分離のステップを迅速に行うことが重要です。
   5. 各スライドに60 μLのPEG化溶液を塗布し、PEG化溶液をスライドとカバーガラスの間に挟むようにカバーガラスを上に置きます。
      注意: スライドとカバーガラスの間に気泡を導入すると、不動態化効率が低下するため、避けてください。カバーガラスとスライドをピペットチップで調整して、気泡を取り除きます。
   6. スライドを平らで暗い引き出しに置きます。スライドは一晩保存できます。ただし、4〜6時間のインキュベーションでは、最適な不動態化が得られます。
      注意: どちら側がペグされているかを覚えておくことが重要です。
   7. 保管する前に、ペグ化されていない側に印を付けてください。インキュベーション後、スライドとカバーガラスを静かに分解し、水で十分にすすいでください
   8. 空気を吹き付けてスライドとカバーガラスを乾かします。スライドとカバーガラスを滅菌チューブ(50 mL)に入れ、PEG化表面を互いに反対側に向けて保管します。実験当日まで−20°Cで保存する。
      注意: 準備から4週間以内にスライドとカバーガラスを使用するのが最善です。PEG化表面は互いに反対側を向いている必要があります。PEG化スライドとカバーガラスを真空シールされたバッグに保管すると、貯蔵寿命を延ばすことができます。

2. 非天然アミノ酸を組み込んだmGluR2の発現、蛍光標識、抽出

注:このプロトコルは、UAA 4-アジド-L-フェニルアラニン(AZP)を含むmGluR2を発現するための細胞の調製、試薬、および治療の概要を示しています。この手順は、18mmのガラスカバーガラス上で増殖させたHEK293T細胞を対象としています。この手順は、必要に応じてスケールアップできます。

1. シード
   注:HEK293T細胞を、10%(v / v)ウシ胎児血清、100ユニット·mL-1ペニシリン^-ストレプトマイシン、および15 mM HEPESバッファー(補足ファイル1)(pH 7.4)を添加したDMEMで、5%CO2下で37°Cで維持_します。
   1. 細胞を0.05%トリプシン-EDTAで継代する。HEK293T細胞をポリL/D-リジン(PLL/PDL)ガラスカバーガラスカバースリップ上に播種し、トランスフェクション時に≥80%のコンフルエントに達するようにします。
2. トランスフェクション
   1. 0.1 M NaOH中のAZPの40 mMストック溶液を調製します。
   2. 細胞およびmGluR2発現を増殖させるためのAZP添加培地を調製します。40 mM AZPストック溶液を使用して、標準培地(+FBS、ペン/連鎖球菌、15 mM HEPES)を補足します。最終的なAZP濃度を0.6 mMにします。1 M HEPES溶液を追加します(40 mM AZPストック溶液の半分の容量を追加)。例えば、10 mLのAZP添加培地を調製するには、9.775 mLの標準培地、150 μLの40 mM AZPストック溶液、および75 μLの1 M HEPES溶液を組み合わせます。
   3. シリンジフィルター(0.2 μm、PES)を使用して培地をろ過(滅菌)します。
   4. トランスフェクションの前に、標準培地をAZP添加培地を含む培地と交換してください。
      注意: 培地の交換中に細胞を乾燥させないように注意してください。
   5. メーカーのマニュアルに従って、トランスフェクション試薬(材料表)で細胞をトランスフェクションします。合計2 μgのDNA(1000 ngのtRNA/シンテターゼ+ 1000 ngのアンバーコドン含有タンパク質プラスミド)を使用して、HEK293T細胞を18 mmのカバーガラスにトランスフェクトします。使用した成分の濃度と量については 表1 を参照してください。
   6. トランスフェクションの24時間後に培地を新鮮なAZP添加培地に変更し、細胞をさらに24時間増殖させます。
3. アルキンシアニン色素による標識
   1. ラベル貼付の20分前に、カバーガラスを温かい(37°C)記録バッファー(RB)(補足ファイル1)で2回洗浄し、AZPを含まない温かい(37°C)標準培地(+FBS、ペン/ストレプト、15 mM HEPES)に移動します。
   2. Cy3-アルキン、Cy5-アルキン、BTTES、硫酸銅(II)(CuSO4)、(+)L-アスコルビン酸ナトリウム、およびアミノグアニジンを含む標識溶液を調製します。
   3. ソリューションの作成と追加の順序に従います(表2)。
      1. 50 mM BTTESを準備します。
      2. 100 mMアミノグアニジンを調製します。
      3. 100 mMのアスコルビン酸Naを準備します。
      4. 655.5 μLのRBを準備します。
      5. Cy3/Cy5アルキン色素(DMSOストックで10 mM)をRBに追加します。
         注:RBにアミノグアニジンを追加します。
      6. 20 mM CuSO 4を準備します_。
      7. CuSO4とBTTESを新しいチューブに混ぜます(溶液が青色に変わります)。
      8. CuSO4 と BTTES の混合物を RB に追加します (2.3.3.6)。
      9. Na-アスコルビン酸塩を追加します。
      10. 下の 表2 に示す容量に従って、18mmのカバーガラスを確認してください。
   4. 溶液を完全に混合し、細胞を標識する前に氷上および暗所で10分間インキュベートします。
   5. カバーガラスにラベル付け溶液を追加する前に、メディアを取り外してRBで洗浄します。標識溶液を加え、暗所条件下で37°Cで15分間インキュベートします。
   6. 注:標識を改善するには、10分後にグルタミン酸(最終濃度~0.5 mM)を加え、さらに5分間インキュベートします。銅は細胞に対して非常に有毒であり、標識反応は in vivoで15分以上継続してはなりません。すべてのコンポーネントを新鮮に準備します。最後にNa-アスコルビン酸塩を追加します。調製中は反応液を4°Cに保ちます。但し、標識液を添加するに際し、細胞はインキュベーター内で37°Cで保存することになっている。
4. 細胞を採取し、タンパク質を抽出する(細胞溶解)
   1. 標識溶液を取り出し、mGluR2トランスフェクト細胞を含むカバーガラス(18 mm)をRBで2回洗浄します。
   2. ピペットを使用して、カバーガラスから細胞を洗い流し、RB(1 mL)に再懸濁します。
      注意: この時点以降、サンプルの光への露出をできるだけ最小限に抑えてください。
   3. 細胞を1,000 x g で4°Cで5分間回転させてペレット化し、上清を除去します。細胞ペレットを80〜130 μLの溶解溶液に再懸濁します。
      注:細胞ペレットは目で見えるはずです。溶解量は、標識および洗浄プロセス中に失われるサンプルの量によって異なります。
   4. ピペッティングで穏やかに混ぜてペレットを砕きます。ホイルで包み、4°Cのロッカーに0.5〜1時間置き、細胞を溶解します。
   5. 不溶性画分を20,000 x g および4°Cで20分間遠心分離してペレット化します。上清を新鮮なコールドチューブ(目的の蛍光タグ付きタンパク質を含む溶解タンパク質)に移し、実験のために氷上に保管します。

3. 1分子フローチャンバーの組み立てと機能化

1. 冷凍庫からスライドとカバーガラスを取り出し、暗闇の中でRTで温めます(~30分)。
2. スライドとカバーガラスの間に両面テープのストリップを挟んで、両面テープを使用してチャンバーを組み立てます。PEG化表面がフローチャンバーの内部を形成していることを確認してください。
3. ピペットチップを使用してカバースリップを押し、テープがカバースリップとスライドの両方に完全に接触していることを確認します。カバーガラスを壊さないように注意してください。スライドの端にエポキシを塗ります。
   注意: ドリルで開けた穴にエポキシが充填されるほど多く追加しないでください。
4. カバーガラス側を下に向けてフローチャンバーを加湿された暗い箱に入れ、エポキシを乾燥させます(~30分)。
   注意: 乾燥期間中にエポキシが穴(10〜15μL)を覆うのを防ぐために、ドリルで開けた穴にT50バッファー(補足ファイル1)を追加します。
5. 各チャンバーレーンに~40 μLをゆっくりと塗布し、500 nMニュートラアビジン(T50で希釈)で各チャンバーレーンをインキュベートします。
6. 加湿した暗い箱の中でRTで2分間インキュベートします。レーンあたり~100 μLのT50バッファーで洗浄します。
7. 各チャンバーレーンを20 nMビオチン化抗体¹¹でインキュベートします。抗体の選択は、タンパク質のタグに依存します。
   注:一次抗体がビオチン化されていない場合は、最初にビオチン化二次抗体と30分間インキュベートし、次に一次抗体とインキュベートします。
8. 加湿した暗い箱の中でRTで30分間インキュベートします。レーンあたり~200 μLのT50で洗浄します。
   注意: 準備プロセス中にレーンが乾かないようにしてください。

4. 単一分子バッファー

1. トロロックスバッファ
   注:Troloxバッファーは、イメージングバッファーを作成するための開始バッファーです。緩衝液の成分は実験に依存し、目的のタンパク質に応じて変化し得る。ここで説明するプロトコルで使用されるバッファーには、塩(NaCl、KCl、CaCl₂、MgCl₂)、緩衝剤(HEPES)、およびトロロックス(pH ~7.35)が含まれます。
   1. 9〜10 mgのトロロックスを10 mLの単一分子記録バッファーに溶解します(SRB、 補足ファイル1)
      注:トロロックスはバッファーをわずかに酸性にします。この段階で、水酸化ナトリウム(NaOH)溶液、10 M(pH 7.35)を使用してpHを調整します。微調整は、トロロックスが完全に溶解した後に行われます。しかしながら、この時点でpHを上げると、トロロックスの溶解度が増加する。
   2. ベンチトップロッカー(アルミホイルで包んだ)を使用してRTで溶液を4〜8時間混合し、トロロックスを完全に溶解します。
   3. pHを確認し、必要に応じて調整します。
   4. トロロックスが完全に溶解していることを確認してください。溶液をシリンジフィルターで滅菌し、4°Cで保存します。
      注:バッファーは、2〜10日間のエージング後に使用する必要があります。トロロックスはまばたきを抑制するのに役立ち、単一分子研究で一般的に使用されています¹⁷。アンチブリンキング特性は、トロロックス¹⁸の酸化誘導体に由来します。したがって、成熟するには少なくとも数時間はRTに保つことをお勧めします。さらに、新鮮なトロロックス溶液のUV放射は酸化プロセスをスピードアップし、トロロックス^{バッファー18}の「老化」を加速するために使用できます。
2. イメージングバッファーレシピ:トロロックスバッファー+界面活性剤(界面活性剤のCMC値の~2倍)+4 mMプロトカテク酸(PCA)を混合します。
   

1. 
   
4. 
   
7. 
   

1. 2. 
      
2. 
   
   2. 
      
   3. 
      
3. 1. 
      
   2. 
      
   3. 
      
   4. 
      
4. 2. 

Results

UAAベースのFRETセンサーの発現と蛍光標識
本明細書では、mGluR2(548UAA)のCRD内へのUAA(AZP)の挿入および蛍光標識の例示的な結果が考察^される11。前述のように、AZPをmGluR2に挿入するには、改変tRNA合成酵素と相補的tRNA(pIRE4-Azi)を含む改変翻訳機構と、突然変異誘発法を用いて作成された548位のアンバーコドンを含むmGluR2の共発現が必要です(図2A、B)。シアニン色素によるAZPの標識は、銅触媒による環化付加反応によって達成され(図2C)、548UAAの効果的な原形質膜標識をもたらします(図2D)。全長548UAAの翻訳および二量体受容体の完全性を検証するために、Cy5で標識された548UAAを発現するHEK293T細胞からの細胞ライセートに対してSDS-PAGE電気泳動を行った。250K...

Discussion

GPCRは、細胞膜上で作用してシグナル伝達を開始するタンパク質です。多くのGPCRは複数のドメインで構成されており、シグナリングはドメイン間の協調的相互作用に依存しています。これらの膜受容体の特性を調節するためには、複数のドメインの動的挙動を理解することが不可欠です。単一分子蛍光共鳴エネルギー移動(smFRET)は、タンパク質の立体構造とダイナミクスをリアルタイムで測定できる蛍光技術です^11,32。ここでは、smFRET、単一分子プルダウン(SiMPull)、および全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を組み合わせて、不動態化された表面に固定化された個々のタンパク質の再配列を直接視覚化するアプローチについて説明します^5,11,33。FRETは距離に非常に敏感で、分子内変化(3-8 nm)のプローブに適したナノスケール定規として効果的に機能します。...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(+)-Sodium L-Ascorbate	Sigma Aldrich	Cat # 11140-250G
4-azido-L-phenylalanine	Chem-Impex International	Cat # 06162
548UAA	Liauw et al. 2021		Transfected construct
Acetic Acid	Fisher Chemical	64-19-7
Acetone	Fisher Chemical	67-64-1
Adobe Illustrator (2022)	https://www.adobe.com/	RRID:SCR_010279	ソフトウェア、アルゴリズム
アミノグアニジン (塩酸塩)	ケイマンケミカル	81530
アミノシラン	アルドリッチ	919-30-2
バス ソニケーター 2.8 L	フィッシャーサイエンティフィック		超音波バス 2.8 L
ビオチン-PEG	レイサン バイオ インク	アイテム#ビオチン-PEG-SVA-5000-100mg
BTTES	クリックケミストリーツール	1237-500
硫酸銅 (II) シ	グマ・アルドリッチ	Cat # 451657-10G
カバースリップ	VWR	16004-306	サンプルチャンバー
Cy3アルキン	クリックケミストリーツール	TA117-5
Cy5 アルキン	クリックケミストリーツール	TA116-5
DDM	Anatrace	Part# D310 1 GM	洗剤
DDM-CHS (10:1)	Anatrace	Part# D310-CH210 1 ML	コレクテロール含有洗剤
定義されたウシ胎児血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	SH30070.03
Di01-R405/488/561/635	Semrock		ノッチフィルター
DMEM	コーニング	10-013-CV
EMCCD	Andor	DU-897U	カメラ
ET542lp	クロマ		ロングパス エミッションフィルター
FF640-FDi01	Semrock		エミッションダイクロイックフィルター
FLAG-tag 抗体	Genscript	A01429
蛍光ビーズ	Invitrogen T7279	テトラスペック マイクロスフィア	球状ビーズ
ガラススライド	フィッシャーファイネスト	12-544-4	サンプルチャンバー
グルタミン酸	Sigma Aldrich	Cat # 6106-04-3
HEK 293T	Sigma Aldrich	Cat # 12022001	細胞株
HEPES	FisherBioReagents	7365-45-9
イメージスプリッター	OptoSplit II
KOH	Fluka	1310-58-3
レーザー	Oxxius		4ラインレーザーコンバイナー
リポフェクタミン3000 トランスフェクション試薬	サーモフィッシャーサイエンティフィック	L3000015	トランスフェクション試薬
メタノール	フィッシャーケミカル	67-56-1
顕微鏡	オ	リンパス オリンパス IX83
ミリQ水	バーンステッド		水 脱イオン装置
m-PEG	Laysan Bio Inc	Item# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635	Semrock		ダイクロイックミラー
OptiMEM	Thermo Fisher Scientific	51985091	Reduced Serum Medium
OptiMEM/Reduced serum medium	Thermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b)	https://www.originlab.com/	RRID:SCR_014212	データ解析・グラフ作成ソフトウェア
ペニシリン-ストレプトマイシン	Gibco	15140-122
pIRE4-Azi	Addgene	プラスミド # 105829	トランスフェクトコンストラクト
Poly-L-リジン臭化水素酸塩	Sigma Aldrich	Cat # P2636
プロトカテク酸 (PCA)	HWI グループ	99-50-3
smCamera (Version 1.0)	http://ha.med.jhmi.edu/resources/		Cameraソフトウェア
重曹	FisherBioReagents	144-55-8
水酸化ナトリウム (NaOH)	Sigma	1310-73-2
シリンジフィルター	Whatman UNIFLO	Cat#9914-2502	液体ろ過
Trolox	Sigma	53188-07