Method Article

Srcキナーゼ活性を阻害するメチル化ナノ構造ジペプチドのin vitro での抗がんアプリケーションのための開発と試験

DOI:

10.3791/64256

⸱

November 30th, 2022

 ,  , 
1Biochemistry Department, College of Science, King Abdulaziz University, 2Independent Scholar, 3School of Health Sciences and Biomedical Engineering, Hebei University of Technology, 4School of Engineering, Saveetha University, 5Programa de Pós-graduação em Ciência e Engenharia dos Materiais, UFPI

In This Article

Retraction Notice

The article Developing and Testing Methylated Nano-Structured Dipeptides that Inhibit Src Kinase Activity In Vitro for Anti-Cancer Applications has been retracted by the journal due to authorship and reproducibility concerns.

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、抗がんアプリケーションのための無細胞および細胞アッセイを使用して、Srcキナーゼ酵素活性を阻害できるジペプチドを設計および試験するためのプロトコルを示します。ここで調製したペプチド(W-RCH3、WCH3-R CH3、およびW-R(CH3)2)は、それぞれ510 nM、916 nM、および1 μMのIC50 値でSrcキナーゼを阻害しました。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究では、新規抗がん治療薬の開発を目指し、メチル化トリプトファンおよび/またはメチル化アルギニンを含む7つのジペプチドを設計し、Fmoc固相ペプチド合成法を用いて作製しました。Srcチロシンキナーゼ酵素の過剰発現は、さまざまながんの発症に関与しています。メチル化アルギニン(RCH3)、ジメチル化アルギニン(R(CH3)2)、および/またはメチル化トリプトファン(WCH3)残基などの非天然アミノ酸を含むジペプチドは、Srcキナーゼを阻害することが以前に示されています。本研究では、このような3つのジペプチド、W-RCH3、WCH3-R CH3、およびW-R(CH3)2を無細胞アッセイを用いて試験し、それぞれ510 nM、916 nM、および1 μMのIC50 値(50%阻害が起こる濃度)を有することを見出しました。これらの値は、以前の研究で合成された環状ペンタからナノのW-Rペプチド([W-R]5-[W-R]9)について得られた値と同等でした。しかし、ジペプチドの非メチル化バージョンは、Srcキナーゼに対する阻害活性を示さなかった。これらのジペプチド(50 μM)はすべて、白血病(CCRF-CEM)、乳腺がん(MDA-MB-231)、卵巣腺がん(SK-OV-3)細胞株を含む3つの異なるがん細胞株と72時間までインキュベートした後、細胞毒性を示さず、細胞膜を通るペプチドの透過性が限られていることを示しています。したがって、これらのペプチドの透過性を抗がん用途で改善するには、ペプチドキャリアの使用や追加のペプチド機能化などにより、さらなる研究が必要です。要約すると、この研究は、Srcキナーゼ活性を阻害するペプチドを合成および試験するためのプロトコルを提供し、したがって、無細胞および細胞アッセイを使用して実証されたように、有望な抗癌能力を持っています。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

がんは、正常細胞の異常な増殖によって引き起こされ、世界中で最も致命的な病気の1つです。これらの異常な細胞は、転移と呼ばれるプロセスによって体内のさまざまな臓器に広がります。がんの最も一般的な形態は乳がんで、2020年には226万人に発生しました。さらに、2020年には肺がんによる死亡者数は約180万人でした1。世界保健機関(WHO)によると、2020年には約1,000万人ががんで亡くなりました2。がん細胞は、タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)などの特定の酵素を過剰に発現するという点で正常細胞とは異なります。米国国立がん研究所(NIN)は、キナーゼを他のタンパク質や糖をリン酸化できる酵素と定義しています3。キナーゼの調節機能に関する知識は、効果的な抗がん剤の設計を容易にすることができます。例えば、PTKは他のタンパク質や糖のリン酸化を触媒し、その結果、リン酸基が失われることでATPはADPに変換されます。がん遺伝子とがん原遺伝子の合計80%がPTKをコードしています4。Srcキナーゼは、Lck、Fyn、Hck、Blk、Yes、Yrkなどの非受容体型チロシンキナーゼのファミリーであり、がん細胞、特に乳がん5,6で過剰発現しています。Srcチロシンキナーゼは、分裂形成、分化、T細胞活性化、および細胞形質転換に関連しています。Srcは、がん細胞の接着を減少させる能力があるため、がん細胞の浸潤と転移を助けます。Srcキナーゼには、N末端からC末端の順に、脂肪酸ドメイン、Srcホモロジー3ドメイン(SH3)、Srcホモロジー2ドメイン(SH2)、チロシンキナーゼドメイン(SH1)、C末端調節ドメイン7の5つの異なるドメインがあります。

figure-introduction-1
図1:SH3ドメイン、SH2ドメイン、キナーゼドメイン(SH1)、および短いC末端調節セグメントを含むSrcキナーゼ酵素の標的ドメイン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

キナーゼドメインSH1は、ATPと基質結合のための2つの保存された部位を含んでいるため、Srcキナーゼ阻害剤を設計する際に最も一般的に標的とされます(図1)。キナーゼドメインのアミノ酸配列が既知である場合、基質は、Srcキナーゼ8への基質結合を模倣する化合物を設計するための標的としても使用できる。また、SH3ドメインやSH2ドメインなど、他のサイトもターゲットとして利用することができます。他の化学療法剤と比較して、キナーゼ阻害剤は毒性が低く、有効性が高い9。2021年9月現在、FDA10によって承認されたキナーゼ阻害剤として作用する小分子は73あります。イマチニブは、チロシンキナーゼの活性を選択的に阻害する抗がん剤の一例です。しかしながら、一部の患者は、キナーゼドメイン11における点変異の出現により、薬物に対して耐性を有する。アストラゼネカは、チロシンキナーゼのSrcファミリーを阻害する薬剤であるサラカチニブを発売し、IC50 値(50%阻害が起こる濃度)が2.7 nMでしたが、第2相試験では割引されました12。2020年初頭の時点で米国FDAによって承認された52のPTK阻害剤のうち、13は28の標的受容体PTKのみ、11は非受容体PTKをブロックし、11はタンパク質-セリン/スレオニンプロテインキナーゼを阻害し、2つはMEKをブロックします1/213。腫瘍学への研究関心の高まりは、潜在的な抗がん剤としてのキナーゼ阻害剤の発見を引き続き促進します。しかし、これまでに治療対象とされたプロテインキナーゼは500種類中50種類に過ぎません。そのため、近い将来、より多くのキナーゼが医薬品開発のために研究されることが予想されます14。さらに、がんにつながる未同定のキナーゼ変異を探索するために、キナーゼ阻害剤を発見する必要があります。

したがって、この研究は、Srcファミリーの阻害剤として使用でき、異なるキナーゼ間の保存部位として機能するATP結合部位を標的とするペプチドを開発することを目的としていました。この目的のために、メチル化トリプトファンおよび/またはメチル化アルギニンを含む一連のジペプチドを合成し、Srcキナーゼを阻害するそれらの相乗的能力について試験しました。トリプトファンのインドール環は、ATPのアデニンを模倣し、ATPと競合してATP結合部位に結合します。研究者らは、脱メチル化アルギニンを含有するポリペプチドが、おそらくSH3結合モチーフ(すなわち、PXXP)上の特定の保存された配列によるSH3ドメインを阻害することを示し、これは、N末端に2〜3個のArg残基またはリガンドのC末端に1〜2個のArg残基を含むリガンドに結合親和性を有することを示した15。16、17。Argのグアニディノ基は、SH3ドメイン18,19の保存Asp-99残基に結合し、一方、Argの残りの部分は酵素の保存Trp-118に結合すること、これはNMR分析およびいくつかのSH3ドメインの結晶構造から確認された19。ここでは、7つのメチル化ジペプチドの合成とSrcキナーゼに対するそれらの阻害能力の試験のためのプロトコルが提示されます。さらに、これらのペプチドがin vitroでいくつかの癌細胞株を殺傷する能力を調べました。

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Protocol

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1. ペプチドの合成

注:W-Rの合成は代表的な例として説明されています(図2)。

  1. 566 mg(0.3 mmol)のH-Arg(Pbf)-2-クロロトリリル樹脂を秤量し、Mandal etal 20が使用した手順に従って、ペプチド合成容器(材料の表を参照)に加えます。確立された固相ペプチド合成(SPPS)戦略21を用いてペプチド合成を行う。
    注:非天然アミノ酸を含むメチル化またはジメチル化ジペプチドは、リンクアミド樹脂(0.3 mmol / gの負荷容量)に組み立てられ、天然アミノ酸を含むジペプチドは、H-Arg(Pbf)-2-クロロトリリル樹脂(0.3 mmol / gの負荷容量)などの最初のアミノ酸が付着した樹脂に組み立てられました。重要なことに、リンクアミド樹脂は、C末端NH2でキャップされたペプチドを生成します。
  2. ペプチド容器に接続された窒素ガス圧下で、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)の5 mLで乾燥樹脂を1時間膨潤させます。
    注:合成プロセス全体をヒュームフードで実行します。実験中は、ゴーグル、手袋、白衣を着用する必要があります。また、化学試薬の添加ステップ間を追跡するためにもタイマーが不可欠です。
  3. 合成プロセス全体を通して、ペプチド合成容器に接続された窒素ガス圧を使用して、余分なDMFを除去します。
  4. カップリング試薬として、473.9 mgのFmoc-trp(Boc)-OH(0.9 mmol)と341 mgの2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)(0.9 mmol)を秤量します。粉末を試験管に加え、5mLの乾燥DMFに溶解します。
  5. 313.4 μL (1.8 mmol) の N,N-ジイソプロピルエチルアミン (DIPEA) を活性化剤として試験管に加え (ステップ 1.4)、チューブを振って混合します。
  6. 試験管の内容物を樹脂に加え、室温の窒素ガス下で1時間反応を進めます。次に、窒素ガス圧を使用して余分なDMFを排出し、DMFで樹脂を3回洗浄します。
  7. 窒素ガス下で 5 mL の 20% ピペリジンを DMF (v/v) 中で 20 分間使用して 、N 末端 Fmoc を脱保護します。レジンをDMF(3 x 5 mL)で3回洗浄します。
  8. ジクロロメタン(DCM)を5mL加えて樹脂を乾燥させ、窒素ガス下で5分間保持した後、窒素ガス圧でDCMを排出します。メタノール5mLを窒素ガス下で5分間加え、樹脂の乾燥度を高めます。
  9. 新たに調製したTFA/チオアニソール/ジチオスレイトール/アニソール(90:3:5:2 v/v/w/v)の切断カクテル10 mLを2.5時間加えて、すべての側鎖を脱保護し、ジペプチドを樹脂から切断します。
    注意:TFAは酸性で危険であるため、劈開カクテルはガラス製の測定シリンダーに追加する必要があります。ご使用の際はご注意ください。
  10. 2.5時間後、窒素圧を使用してペプチド容器から反応溶液を丸底フラスコに排出します。粗ペプチドを含む丸底フラスコに250mLの冷たいジエチルエーテル(Et2O)を加えて、ペプチドを沈殿させます。
  11. 沈殿したペプチドを、水で接続された片側アームを備えた円錐形の漏斗で濾紙を使用してろ過し(水圧によりろ過が行われるように)、沈殿物(ペプチド)を収集してエーテルを完全に除去します。粗ペプチドは10分以内に沈殿します。
  12. グラジエントシステムを使用して、逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)カラム( 材料表を参照)で粗ペプチドを精製します。0.1% TFAを含む水に0.1%TFAを含む0%〜100%アセトニトリルのグラジエントを1 mL/minの流速で30〜60分間使用します。

figure-protocol-1
図2:W-Rの固相ペプチド合成。 略語:HBTU = 2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸;ジペア= N、N-ジイソプロピルエチルアミン;TFA =トリフルオロ酢酸;DMF = ジメチルホルムアミド。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. 合成ペプチドの細胞毒性の判定

  1. SK-OV-3細胞は2,000細胞/ウェル、MDA-MB-231細胞は5,000細胞/ウェル、CCRF-CEM細胞は5×106細胞 /ウェル(総容量100μL/ウェル)を96ウェルマイクロプレートにプレートします。細胞を5%CO2、95%空気、37°Cの加湿雰囲気で75%〜80%のコンフルエントに達するまでインキュベートします。
    注:RPMI-16培地は、CCRF-CEM細胞の培養に使用され、MDA-MB-231およびSK-OV-3細胞株のEagleの最小必須培地(EMEM)の培養に使用されます。両培地には、10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン/ストレプトマイシン(0.9% NaCl中に10,000単位/mLのペニシリンと10 mg/mLのストレプトマイシン)が補充されています。実験を開始する前に、すべての培地とサプリメントを37°Cのウォーターバスに30分間入れます。実験は、バイオセーフティフードを着用し、手袋と白衣を着用して行う必要があります。
  2. ピペットを使用して培地を吸引し、ポジティブコントロールとして使用した50 μMペプチドまたは10 μMドキソルビシン(Dox)を100 μLを、96ウェルプレートに播種した3種類のがん細胞を含むウェルにトリプリケートで加えます。プレートをインキュベーターに72時間戻します(ステップ2.1で説明したのと同じ条件下で)。
  3. 72時間後、20 μLの3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム(MTS)を96ウェルプレートに加えます。プレートをアルミホイルで包み、加湿雰囲気下でプレートを37°Cで1〜4時間インキュベートします。
    注:MTSは、生細胞のみがMTSテトラゾリウムを490nmで測定可能な着色ホルマザン色素に変換するため、生細胞(未処理またはペプチドで処理)を視覚化するために使用される色素です。
  4. マイクロプレートリーダーで490 nm(A490)でのホルマザン製品の吸光度を測定します( 材料の表を参照)。MTSと混合した培地を実験用のブランクとして含めます。ネガティブコントロールとして、水のみ(ペプチドは水溶性であるため)および0.1 N HCl(WCH3 は溶解にHClを必要とするため)を使用します。
  5. スプレッドシートプログラムを使用して、次の式(式1)を使用して細胞生存率を測定します( 材料の表を参照)。この手順は、Mandal et al20 によって使用されたものと同じです。
    figure-protocol-2式 (1)

3. c-Srcキナーゼ活性アッセイ

注:Srcキナーゼ活性アッセイは、市販のアッセイキット( 材料の表を参照)を使用して、Chhikaraらの手順に従ってトリプリケートで実施しました22。コントロールとしてWCH3 およびRCH3 のみを使用し、キナーゼに対するメチル化アミノ酸のみの効果、および他のメチル化アミノ酸または非メチル化アミノ酸への影響を比較します。

  1. 384ウェルの低容量黒色非結合表面丸底マイクロプレートに、アッセイキットの一部であるキナーゼバッファーに0.7 nM His6-Srcキナーゼドメインを含む反応カクテル2.5 μLを、10% DMSO(4倍目標濃度)に溶解した2.5 μLのプレ希釈ペプチドに加えます。マイクロプレートシェーカー(5 rpm)を使用して、メーカーのプロトコルに従って室温で10分間インキュベートします。
    注:反応カクテルは、キナーゼ緩衝液(200 mM HEPES、pH 7.5)、MgCl2 (16 mM)、DMSO(4%)、EGTA(8 mM)、2-メルカプトエタノール(43 mM)、およびBrij-35(0.04%)で構成されています。この実験のキナーゼ反応の最適な基質は(AEEEIYGEFEAKKKK)です。
  2. ATP/基質(40 μM/600 μM)カクテル5 μLをプレートに加え、室温でマイクロプレートシェーカーで30分間インキュベートします。
  3. その間に、8 nMのADPトレーサーと10 μg/mLの色素標識ADP2 抗体( 材料表を参照)を含む1x ADP検出混合物をストップに調製し、キットからバッファーB(1x)を検出します。1x ADP検出混合物10 μLを添加してキナーゼ反応を停止し(ステップ3.2)、室温で1時間インキュベートします。
  4. マイクロプレートリーダーを使用して、励起580 nm、蛍光630 nm、バンド幅10 nmで蛍光強度を測定します。装置から相対蛍光単位(RFU)を取得し、式(2)に従って酵素阻害の割合を取得します。
    figure-protocol-3式 (2)
  5. 会社のウェブサイト23に記載されているIC50の値を計算します。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W-RCH3、WCH3-R CH3、W-R(CH3)2、WCH3-R、W CH3-R(CH3)2、およびコントロールW-Rペプチドを、それぞれ95%、98.7%、99%、100%、100%、99.5%の純度でFmoc固相ペプチド合成(図3)を使用して合成しました。これらのジペプチドの化学構造は、ESI-MSを用いて確認しました。これらのジペプチドのm/z値は、それぞれ374.1624、388.1949、388.1794、374.1815、402.2022、361.1457でした。

figure-results-1

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Srcキナーゼの阻害とそれに伴うがん細胞の死滅についてここで作製および試験されたペプチドには、非天然アミノ酸であるメチル化トリプトファンおよび/またはメチル化アルギニンが含まれていました。ジエチルエーテルを添加すると白色沈殿物が形成されることは、これらのペプチドの合成における重要なステップです。ただし、すべての合成ペプチドが沈殿物を形成できるわけではありません。したがって、沈殿物が形成されない場合でも、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)を使用して目的の質量を決定することにより、ペプチド合成の成功を確認できます。ペプチド質量は、ペプチドの 1H-NMRスペクトルを予測するためにさらに使用できます。非天然アミノ酸は、天然アミノ酸よりもプロテアーゼによるタンパク質分解に対して安定性と耐性があることが知られており25、したがって、Srcキナーゼ活性をよりよく阻害できる可能性がある。さらに、メチル化アラニンなどの非天然メチル化アミノ酸(すなわち、α-アミノイソ酪酸)は、抗癌活性および抗菌活性を示す<...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示していません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロジェクトに助成金番号に基づいて資金を提供してくださったサウジアラビアのジェッダにあるキングアブドゥルアズィーズ大学(KAU)の科学研究学部長(DSR)に感謝します。(G:031-130-1443)

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-ジチオスレイトールSigma-Aldrich10708984001ペプチド合成
固相合成用Aldrichフリットフィルター漏斗Sigma-AldrichZ283304ペプチド合成容器
Alexa594 TracerBell Brook Labs, Madison, WI3013
AnisoleSigma-Aldrich8014520500
CellTiter 96 Aキュースワン ソリューション Cell Proliferation Assay試薬 PromegaG3582細胞増殖アッセイ(MTS試薬)
ジクロロメタン、99.9%、Extra DryFishersciAC326850025
Fmoc-ADMA(Pbf)-OHSigma-Aldrich8521070001
Fmoc-Arg(Me,Pbf)-OHSigma-Aldrich8521050001
Fmoc-Arg(Pbf)-OHSigma-Aldrich8520670025
Fmoc-TRP(Boc)-OHSigma-Aldrich47561-25G-F
HPLC C18 カラム 島津製作所 (RP-HPLCシステム)水/アセトニトリルグラジエン
IRDye QC-1 クエンチャーBell Brook Labs, Madison, WI3013
マイクロプレートリーダー SpectraMax M2e分子デバイス
Microsoft Excelマイクロソフトスプレッドシートソフトウェア
N,N-ジイソプロピルエチルアミン (DIPEA)Sigma-Aldrich496219
N,N-ジメチルホルムアミド,無水、99.8%フィッシャーシAA43997M1
ピペリジン 20%Sigma-Aldrich80645
リンクアミド樹脂 (100-200 メッシュ)Sigma-Aldrich8550010025
チオアニソールSigma-Aldrich92358
トランスクリーナー ADP2 FI アッセイBell Brook Labs, Madison, WI3013c-Src キナーゼ活性アッセイキット
ト

References

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