Method Article

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における微小電極アレイおよびパッチクランプ記録の技術的応用

DOI:

10.3791/64265

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August 4th, 2022

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1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

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ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、薬物誘発性心毒性スクリーニングおよび疾患モデリングのための有望な in vitro モデルとして浮上しています。ここでは、hiPSC-CMの収縮性と電気生理機能を測定するためのプロトコルについて詳しく説明します。

Abstract

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薬物誘発性心毒性は、薬物の減少と市場からの撤退の主な原因です。したがって、適切な前臨床心臓安全性評価モデルを使用することは、医薬品開発中の重要なステップです。現在、心臓の安全性評価は依然として動物実験に大きく依存しています。しかし、動物モデルは、特に心臓の電気生理学的特性の点で、種固有の違いのために、ヒトに対する翻訳特異性が低いことに悩まされています。したがって、前臨床心臓安全性評価のための信頼性が高く、効率的で、人間ベースのモデルを開発することが急務です。ヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、薬物誘発性心毒性スクリーニングおよび疾患モデリングのための貴重な in vitro モデルとして浮上しています。hiPSC-CMは、多様な遺伝的背景やさまざまな病状を持つ個人から取得できるため、薬物誘発性心毒性を個別に評価するための理想的な代理となります。そのため、hiPSC-CMの機能特性を網羅的に調べるための方法論を確立する必要があります。このプロトコルでは、収縮性、電界電位、活動電位、カルシウム処理の測定など、hiPSC-CMで評価できるさまざまな機能アッセイについて詳しく説明します。全体として、前臨床心臓安全性評価にhiPSC-CMを組み込むことは、医薬品開発に革命をもたらす可能性を秘めています。

Introduction

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医薬品開発は長くて費用のかかるプロセスです。2009年から2018年の間に米国食品医薬品局(FDA)によって承認された新しい治療薬の研究では、資本化された研究および臨床試験の推定中央値は製品あたり9億8500万ドルであると報告されています1。薬物誘発性心毒性は、薬物の減少と市場からの撤退の主な原因です2。特に、心毒性は治療薬の複数のクラスの間で報告されています3。したがって、心臓の安全性評価は、医薬品開発プロセスにおける重要な要素です。心臓の安全性評価の現在のパラダイムは、依然として動物モデルに大きく依存しています。しかし、動物モデルの使用との種の違いは、ヒト患者における薬物誘発性心毒性の不正確な予測の主な原因としてますます認識されています4。例えば、心臓活動電位の形態は、異なる再分極電流からの寄与のために、ヒトとマウスの間で実質的に異なる5。さらに、心臓生理学に影響を与える可能性のある心筋ミオシンおよび環状RNAの差次的アイソフォームは、種の間で十分に文書化されています6,7。これらのギャップを埋めるには、前臨床心臓の安全性評価のための信頼性が高く、効率的な、人間ベースのモデル....

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Protocol

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1.培地と溶液の準備

  1. 50x B27サプリメントの10 mLボトルと500 mLのRPMI 1640培地を混合して、hiPSC-CM維持培地を調製します。培地を4°Cで保存し、1ヶ月以内に使用してください。使用前に培地を室温(RT)に平衡化してください。
  2. 20 mLの血清置換培地と180 mLのhiPSC-CM維持培地(10%希釈、v/v)を混合して、hiPSC-CMシーディング培地を調製します。新たに調製した播種培地が好ましいが、4°Cで2週間以内保存することができる。使用前に培地をRTに平衡化してください。
  3. 基底膜マトリックス1本(10 mL)を4°Cで一晩解凍し、500 μLの基底膜マトリックスを滅菌1.5 mLチューブに分注して、細胞外マトリックスコーティング溶液を調製します。さらに使用するには、-20°Cで保存してください。500 μLの基底膜マトリックスと100 mLの氷冷DMEM/F12培地(1:200希釈、v/v)を混合して、基底膜マトリックスコーティング溶液を作ります。
  4. 135 mM NaCl、5.4 mM KCl、1 mM MgCl 2、1.8 mM CaCl2、5 mM グルコース、および10 mM HEPESを含むタイロード溶液50 mLを調製します。NaOHでpHを7.4に調整します。実験当日に新鮮なTyrodeの溶液を準備します。

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Results

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このプロトコルでは、hiPSC-CMの収縮運動、電界電位、活動電位、およびCa2+ 過渡現象の測定方法について説明します。酵素消化、細胞播種、維持、および機能アッセイ伝導を含む概略図を 図1に示します。収縮運動測定にはhiPSC-CM単分子膜の形成が必要です(図2B)。hiPSC-CMの収縮-緩和運動の代表的な痕跡を 図2Cに示します。アナライザソフトウェアは、デフォルト設定を使用して収縮開始、収縮ピーク、収縮終了、緩和ピーク、および緩和終了を検出することにより、収縮-緩和モーショントレースを自動的に解析できます(図2D)。収縮および緩和ピークの速度は、hiPSC-CMの収縮および緩和能力を評価するために使用されます。さらに、収縮および緩和変形距離も求めることができる。

MEAアッセイは、電界電位として知られる活動電位の細胞.......

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Discussion

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ヒトiPS細胞技術は、疾患モデリングと薬物スクリーニングのための強力なプラットフォームとして登場しました。ここでは、hiPSC-CMの収縮性、電界電位、活動電位、およびCa2+過渡現象を測定するための詳細なプロトコルについて説明します。このプロトコルは、hiPSC-CMの収縮性と電気生理学の包括的な特性評価を提供します。これらの機能アッセイは、我々のグループ12、13、18、24、25、26、27からの複数の出版物に適用されている。

良好なビート条件にあるhiPSC-CMを使用することが不可欠であり、.......

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Disclosures

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J.C.W.はGreenstone Biosciencesの共同創設者ですが、ここで紹介する研究は完全に独立しているため、競合する利害関係はありません。他の著者は、競合する利益を宣言しません。

Acknowledgements

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原稿を校正してくれたブレイク・ウーに感謝します。この研究は、国立衛生研究所(NIH)R01 HL113006、R01 HL141371、R01 HL163680、R01 HL141851、U01FD005978、NASA NNX16A069A(JCW)、およびAHAポスドクフェローシップ872244(GMP)の支援を受けました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm ガラス底皿、20 mm マイクロウェル #1.5 カバーガラスCellvisD35-20-1.5-Nパッチクランプ
50x B27 サプリメントLife Technologies17504-044hiPSC-CM 培養培地
6 ウェル培養プレートE &K ScientificEK-27160hiPSC-CM 培養
96ウェル フラットクリアボトム ブラックポリスチレン TC処理マイクロプレートコーニング3603収縮運動測定
AccutaseSigma-AldrichA6964酵素解離
Axion's Integrated Studio (AxIS)Axion Biosystemsnavigator software
ホウケイ酸ガラスキャピラリーハーバード装置BF 100-50-10、パッチクランプ
CaCl2 1 M in H2OSigma-Aldrich21115Tyrode'溶液
細胞計数チャンバースライドThermoFisher ScientificC10228細胞計数
CytoView 48ウェルMEAプレートAxion BiosystemsM768-tMEA-48BMEA
DMEM/F12Gibco/Life Technologies12634028細胞外マトリックス培地
DPBS、カルシウム、マグネシウムなしFisher Scientific14-190-250
EGTASigma-AldrichE3889細胞内ピペットソリューション
EPC 10 USB パッチクランプアンプWarner Instruments89-5000パッチクランプ
Fura-2, AM, cell permeantThermoFisher ScientificF1221Ca2+ 過渡測定
GlucoseSigma-AldrichG8270Tyrode'S solution
HEPESSigma-AldrichH3375Tyrode'スタン
フォード心臓血管研究所、iPSCバイオバンク
、KCl、シグマ・アルドリッチ、529552タイロード」S solution
KnockOut Serum ReplacementThermoFisher Scientific10828-028hiPSC-CM 播種培地
KOH 8 MSigma-AldrichP4494細胞内ピペットソリューション
Lambda DG 4Sutter Instrument CompanyCa2+ 過渡測定; 超高速波長スイッチング光源
Luna-FL 自動蛍光セルカウンターWISBIOMEDLB-L20001Cell counting
Maestro Pro MEAシステムアクシオンバイオシステムズMEA
マトリゲル成長因子還元型(GFR) 基底膜マトリックスコーニング356231細胞外マトリックス培地
MgATPSigma-AldrichA9187細胞内ピペット溶液
MgCl2Sigma-AldrichM8266Tyrode'の解決策
NaClグマ-アルドリッチS9888ロード'溶液
NaOH 10 Mシグマ アルドリッチ72068タイロードs solution
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)サーモフィッシャーサイエンティフィックP3000MPCa2+ 過渡測定
RPMI 1640 mediumLife Technologies11875-119hiPSC-CM 培地
ソニー SI8000 セルモーションイメージングシステムソニーバイオテクノロジーコントラクションモーション測定
サッターマイクロピペットプーラーSutter InstrumentsP-97パッチクランプ
トリパンブルーステインLife TechnologiesT10282細胞計数
シチ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
  2. Pang, L., et al.

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Microelectrode ArrayPatch Clamp RecordingHuman iPSC CardiomyocytesCardiac Safety AssessmentDrug Induced CardiotoxicityCalcium Transient MeasurementField Potential RecordingAction Potential RecordingWhole Cell RecordingCardiac Electrophysiology

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