単一分子局在顕微鏡を用いた細胞核中の絶対DNA密度のマッピング

Summary

本プロトコルは、単一分子局在顕微鏡データ、既知の体積、ゲノムサイズ、および細胞周期段階のボロノイテッセレーションを使用して、接着細胞核内の絶対DNA密度を測定する方法を説明する。

Abstract

細胞核内では、サイレント遺伝子は一般にヘテロクロマチンと呼ばれる高密度のクロマチン領域に存在しますが、活性遺伝子は主にクロマチンとユークロマチンと呼ばれるクロマチン間空間との間の界面に見られます。現在、ユークロマチンとヘテロクロマチンの特性評価は、主にDNA配列に沿ったヒストンタンパク質のエピジェネティックな修飾に基づいていますが、細胞核全体の絶対DNA密度とその機能的影響についてはほとんど知られていません。生化学的データのみに基づく核のモデルと、ポリマーとしてのクロマチンの性質に関する仮定は、高解像度顕微鏡によって生成されたイメージングデータと根本的に異なります。これは、構造的に関連する重要な情報がまだ欠けていることを示しています。遺伝子制御には空間的制約が関与している可能性があると考え、ボロノイテッセレーションによって超解像局在データを実尺度の密度マップに変換することで、哺乳類細胞核の絶対DNA密度を測定できる方法を開発しました。

Introduction

細胞生物学の黎明期から、遺伝情報の座である細胞核は生物学者を魅了してきました。自社開発の細胞学的染色法を適用した後、エミール・ハイツは1928年に細胞核内の異なる、強く染色された領域を発見し^{ました1。}彼は、より強く染色され、密度の高い領域を「ヘテロクロマチン」と呼び、染色強度が低く、密度の低い領域を「ユークロマチン」と名付けました。時間が経つにつれて、活性遺伝子は主にユークロマチンに位置し、密度の高い領域には反復要素とサイレント遺伝子が豊富であることが明らかになりました。ヘテロクロマチンとユークロマチンという用語は、その定義が構造特性から分子特性に変更されましたが、今日まで生き残っています(以下を参照)。今日、細胞核が2つの主要な段階に分かれていることがわかっています。核体、スプライシングコンパートメント、および核質を収容する1つの液体(染色質間コンパートメント)と、染色体領域と核小体²を含む固体のヒドロゲルのようなクロマチンドメイン。染色質間空間への界面では、クロマチンの密度が低く、転写、複製、修復などの遺伝的に活性なプロセスが^{主に行われる場所}です^3,4,5一方、ラミナに隣接し、核小体の周囲、およびセントロメアの近くでは、クロマチンは高い圧縮レベルを示し、一般に転写的にかなり^{不活性です}6。

分子レベルでは、クロマチンはヌクレオソーム(コアヒストンタンパク質のオクタマー)に巻き付けられたDNAから構築されます。ヒストンは本質的に無秩序な尾部ドメインを有しており、いくつかの化学基(メチル-、アセチル-、リン-、ビオチン)、アミノ酸(アルギニン)、さらにはタンパク質(SUMO、ユビキ^チン)を添加することによって翻訳後に修飾することができます7。これらの修飾は、他のタンパク質(クロマチンリモデラー、HP1、修復タンパク質、RNAなど)を読み取って引き付けることができ、それによって、その配列を直接変更することなく、DNA配列の生理学的状態(転写許容/制限)を定義することができます(したがって、「エピ」遺伝的)⁷。特定の配列に関する修飾の種類と数は、細胞型によって大きく異なり、可逆的であり、発生、老化、および疾患を通じて変化する可能性があります^8,9,10。高度に転写された領域でより一般的なヒストンテールの修飾と、転写活性がほとんどまたはまったくないゲノムの領域で優勢な修飾があります。

例えば、H3K4修飾が豊富な、またはヒストンテールがアセチル化されている高度に転写された領域は、通常、ユークロマチンとして説明されますが、抑制性ヒストン修飾が豊富な領域(H3K9me3、H3K27me3、またはH4K20me3)はヘテロクロマチンと呼ばれ、さらに構成的ヘテロクロマチン(すべての細胞で転写的に不活性)(例えば、H4K20me3)と通性ヘテロクロマチン(細胞型に応じてサイレンシングされたクロマチン、 例:H3K27me3)⁶。生化学的および分子生物学的方法は、配列レベルでの化学変化の測定に非常に適していますが、これらの方法を使用してメソスケールでの空間特性について記述するには、それらを使用するのがはるかに困難です。

例えば、配列領域間のDNAの近接性を検出し、マッピングするHi-C実験からの近接情報を使用して、ゲノム¹¹の空間モデルを再構築する試みがなされている。しかし、高解像度の光学顕微鏡や電子顕微鏡の画像と直接比較すると、これは限られた範囲でしか可能ではないことがわかります(図1)。Hi-C¹²などの方法は、間期細胞の染色体領域を別々の実体として正しく検出できますが、DNA配列の近接性だけではゲノムのより離れた部分間の空間的関係を反映することができないため、適切な3Dゲノム再構成にはあまり適していないため、これらのモデルはかなり「近視」です。そのため、密度の違いも接触頻度情報では正しく反映できません。これにより、核内のゲノムの「スパゲッティ化された」表現( 図1Bを参照)が生まれ、羊毛のような自由にアクセスできるループのボールで発生するように見えます。

生化学的情報と生物物理学的および構造的データを組み合わせた、核の統合的でより現実的な全体像への道を開くには、核組織のさまざまな側面に関するデータを生成できる方法を開発する必要があります。また、最近まで、画像データから細胞核の絶対DNA密度を決定することも困難でした。その理由は、従来の光学顕微鏡では解像度が限られていること、DNAを特異的に染色する電子顕微鏡の問題、電子顕微鏡の観察量が小さいことなどでした。

従来の蛍光顕微鏡の解像度は、光の回折によって制限されます。点光源の画像は回折限界によって広がり、 点拡散関数 (PSF)で記述できます。PSFによると、点光源として良好に近似すると見なすことができる蛍光色素の画像は、その起源(蛍光色素)¹³の周囲で一定のサイズの体積を占める。回折限界像の寸法よりもはるかに近い位置にある多くの蛍光色素が同時に励起されると、画像化された強度分布が重なり合わされ、単一の蛍光色素の位置を解消できません。蛍光色素からの逐次確率的発光(点滅)により、個々の分子を光学的に分離できるため、信号の強度重心を決定することで正確な位置を見つけることができます。

これは、多くの記録画像から蛍光色素局在化データを蓄積することにより、サンプルの構造情報を再構築するために使用できます。この方法は一般に単一分子局在顕微鏡(SMLM)と呼ばれます(詳細については^、14を参照してください)。蛍光色素が「オンタイム」中に放出する光子が多いほど、強度重心をより正確に決定できます。ビーム経路の乱視レンズは、光学焦点面の上下にある蛍光団の信号を楕円に変換し、これを使用して光軸に沿った蛍光団の位置を決定できます。焦点面の下の蛍光信号に由来する楕円の長軸は、焦点面の上の蛍光色素から発生する楕円の軸と比較して90°回転します。さらに、これらの楕円の軸比により、±300 nmの範囲内で焦点面に対する光軸に沿った分子の位置を決定することができる¹⁵。

確率的点滅イベントの再構成によって生成される超解像画像の品質は、ラベリング密度と点滅イベントの数に大きく依存します。後者は、蛍光色素の光安定性と、最終的に故障するまでの点滅イベントの数(オン/オフサイクルの数)に依存します。核内DNA分布の超解像画像を取得するためにここで説明する方法は、fBALM(DNA構造変動支援結合活性化局在顕微鏡)と呼ばれます。これは、核酸に一時的に挿入され、DNAに結合した後にのみ蛍光を発する蛍光色素に基づいています^16,17。蛍光体ジエステル骨格の荷電残基により、DNAは負に帯電したポリマーです。生細胞内の相補的なDNA鎖を安定化するには、正に帯電したタンパク質(ヒストンなど)とイオンによる中和が必要です。pHを下げることにより、塩基の相補的な対の安定性が低下し、インターカレート染料が内外に拡散できるようになります^16,17。

挿入する蛍光色素によっては、この状態は特定のpH範囲内で到達することができます。YoYo-1やSYTOX Orangeなどの蛍光色素は、DNAに結合した場合にのみ蛍光を発し、インターカレート色素(ヘヒストや4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール[DAPI]などのDNAのマイナーグルーブに結合する色素とは対照的に)は通常、配列に依存しない方法で結合するため、局在顕微鏡による細胞核内のDNAの分布をマッピングするのに適しています。

ボロノイテッセレーションは、ポイントの位置に基づいて空間をさまざまなパーティションに細分化できる数学的方法です。2D空間では、結果のタイルのサイズは、ポイント¹⁸の密度の逆数を反映します。ローカリゼーション顕微鏡は、蛍光色素の位置を表す一連の点として画像を再構築するため、ボロノイテッセレーションはローカリゼーションシグナルの密度を決定するのに役立ちます(図2)。したがって、DNA特異的色素を蛍光色素として使用することで、DNA密度を測定することができます。

DNA含有量(塩基対の数)と核の空間的次元に関するアプリオリな知識により、相対的なDNA密度を絶対DNA密度に変換することができます。以下のプロトコルは、SMLMを非常に高い分解能で使用した接着細胞における絶対DNA密度のマッピングを示し、これらの密度が大きな変動の影響を受けることを示しています。

Protocol

メモ: 図 3 は、このセクションで説明するワークフローの概要を示しています。このプロトコルで使用される試薬、材料、機器、およびソフトウェアの詳細については、 材料表 を参照してください。この出版物に使用されているコードは、https://github.com/irradiator/Mapping-absolute-DNA-density-in-cell-nuclei-using-SMLM-microscopy から表示およびダウンロードできます。

1. 細胞培養

1. 5%CO₂を添加した加湿雰囲気中で、10%ウシ胎児血清を添加したDMEMで37°CでC3H10T1/2、HFB、およびHeLa細胞を培養します。細胞がコンフルエントに近づいたら、細胞をそれぞれ1:3(C3H10T1/2、HFB)と1:10(HeLa)の比率で分割して継代培養します。
2. 測定を行う1日前に、指数関数的に成長する培養物の細胞を35 mmの格子状の皿に播種します。観察皿が蛍光顕微鏡(厚さ170 μmのガラス底、#1.5)に優れた光学品質を提供し、細胞を明確に特定するためのグリッドを備えていることを確認します。また、細胞が単一細胞懸濁液中にあり、皿の表面の全領域が細胞で均一に覆われていることも確認してください。
   注:特定の細胞周期段階に割り当てられた正確な細胞をもう一度見つけるために、刻印されたグリッドを備えた皿を使用することをお勧めします。
3. 実験で必要な場合は、100 nMのトリコスタチンA(TSA)を細胞培養培地に加え、ステップ1.1で前述した条件下で細胞をインキュベートします。

2. サンプル調製

1. 測定当日、細胞を1x DPBSで1回洗浄してから、1x DPBSの4%パラホルムアルデヒド(PFA)で30分間固定します。
   注:再現性のある結果を得るには、毎回新しいPFA溶液を調製し、PFA濃度が正確であることに特に注意してください。
2. 固定液を除去した後、細胞を1x DPBSで再度2回洗浄し、0.4%Triton X-100を含む1x DPBSで20分間透過処理します。
3. ピペットで透過処理バッファーを除去し、1x DPBSで追加の洗浄ステップを実行してから、細胞をRNaseカクテルで処理します(1x DPBSで1:1,000に希釈)。細胞をインキュベーターに37°Cで30分間、加湿チャンバーに入れます。
4. fBALM対応のSYTOXオレンジストック溶液(1:10,000希釈で1x DPBSで5 mM)を希釈して染色液を調製します。
5. ピペットを使用してRNaseバッファーを除去し、染色溶液を加える前に1x DPBSで追加の洗浄ステップを適用します。細胞を室温で加湿チャンバー内で5分間インキュベートします。
6. ピペットで細胞からSYTOX Orange染色液を取り出し、1x DPBSで洗浄し、強光から保護して細胞を1x DPBSに保存します。

3. サイトメトリー細胞周期の決定

注:このステップでは、倒立高内容スクリーニング顕微鏡を使用しましたが、自動化された逆広視野蛍光顕微鏡を使用することもできます。核全体の強度は、そのDNA含有量の尺度です。したがって、共焦点システムを使用する場合は、必ずピンホールを完全に開いてください。油浸対物レンズよりも、低開口数 (NA) 対物レンズが好ましいです。

1. 細胞の入った皿を、自動で記録された画像をつなぎ合わせることでサンプル上の広い領域を再構築できる電動ステージとソフトウェアを備えた逆蛍光顕微鏡に置きます。
2. 細胞周期決定のための画像取得を妥当な時間内に実行できるように、視野ごとに十分な細胞(合計で少なくとも900個の単核[詳細については、Roukos et ^al.19を参照])を記録できる対物レンズを選択してください。中心と境界の強度の差が大きくないレンズを使用してください。このようなレンズが利用できない場合は、画像にフラットフィールド補正を適用します(手順7を参照)。このプロトコルに従うには、焦点深度 = 8 μm の 20x NA 0.4 エアレンズを備えた広視野蛍光顕微鏡を使用します。
3. 画像取得中は、使用した蛍光色素に適したフィルターを使用して、ディッシュの中央領域を覆います。透過光モードで明視野画像を撮影します。
   注:明視野画像は、ステップ4.6のグリッド上のセルの再配置に重要です。
4. 細胞の入った皿をステップ4.4まで4°Cの冷蔵庫に入れます。
5. 記録された1枚の画像を並べて、1枚の画像からスキャンした領域を再構築します。
6. 蛍光DNA染色の画像データを、オープンソースソフトウェアCellProfiler4.2.1²⁰を実行するコンピューターに転送します。
7. 蛍光画像のフラットフィールド補正が必要な場合は、記録された画像から使用する顕微鏡の参照画像を生成します。 Illumination Correction.cpproj パイプラインを開きます ( 補足ファイル 1 として含まれています)。パイプラインが画面にシーケンスとして表示され、さまざまなステップをクリックできることを確認します。パイプラインの最初のステップの 画像 の指定されたフィールドに画像をドラッグアンドドロップします。
   注: ウィンドウの下部にあるフィルタオプションを使用して、リストされたファイル内の画像以外のデータをすべて除外してください。
8. イルミネーション補正パイプラインの最後のステップで、[ 画像の保存] をクリックして参照画像を保存する場所を定義し、[ 画像の分析 ]ボタンをクリックします。
9. パイプライン CellCycleAnalysis.cpproj ( 補足ファイル 2 として含まれています) を開きます。参照画像(ステップ3.8)を含むステップ3.3で記録された画像(例として 図4A を参照)を、最初のステップ パイプラインの画像の 指定されたフィールドにドラッグアンドドロップします。
   注: ウィンドウの下部にあるフィルタオプションを使用して、リストされたファイル内の画像以外のデータをすべて除外してください。
10. パイプラインの CorrectIlluminationApply ステップで、ドロップダウンメニューで [ Select the Illumination (イルミネーションの選択)] 機能を選択して、参照画像を選択します。
11. 細胞周期解析パイプラインの最後のステップで、ステップ3.7で参照画像が保存された場所を定義し、[ 画像の解析 ]ボタンをクリックして、ステップ3.3で記録された画像内のすべての核の統合蛍光強度の一括測定を開始します。
    注:CellProfiler4.2.1は、測定された各核のデータ(画像、ObjectID、統合蛍光強度、画像座標)をCSV形式で含むテキストファイル「CellCycleAnalysis_Nuclei.txt」を生成します。
12. パイプラインの DisplayHistogram 要素がアクティブとしてチェックされていることを確認します。
13. G₁ とG₂のヒストグラム(例として 図4B を参照)のピークの統合蛍光強度に注意し、それらの周囲の間隔をパイプラインの FilteredObjects 要素に入力します。チェックボックスをクリックして、パイプライン要素をアクティブにします。
14. 対応する DisplayDataOnImage パイプライン要素をアクティブにして、G₁ または G₂ フェーズのセルを強調表示する画像を生成し、パイプラインを再度実行します (例として 図 4C を参照)。
15. 観察チャンバーのマーク領域で生成された画像から、目的の細胞周期期を表す細胞を最大5つ選択し、SMLM顕微鏡で細胞を再配置してみてください。
    注:ここではゲノムサイズが不明な2つの細胞株を使用するため、ゲノムサイズは、ヒト線維芽細胞株のG₁ ピークをHeLaおよびC3H10T1/2細胞のG₁ ピークと比較することによって決定されました。ヒストグラムおよびそれらのゲノムサイズ間の比例関係は、 補足図S1で見ることができます。

4. SMLM-fBALMの

注:これらの複合生化学反応における酸素の正味の合計はゼロですが、酸素濃度が限られているとD-グルコノ-1,5-ラクトンの生成が遅くなる可能性があるため、密閉されていない皿で反応を実行することをお勧めします。D-グルコノ-1,5-ラクトンの濃度が増加すると、pHが徐々に低下しますが、これはpHを直ちに下げると試料の超微細構造が変化するため、必要です。

1. 次の成分を混合して、1 mLのイメージングバッファーを調製します:900 μLのグルコース(1x DPBSで1 g / mLのグルコース)、50 μLのグルコースオキシダーゼ(1x DPBSで0.5 mg / mL)、および50 μLのカタラーゼ(1x DPBSで40 μg / mL)。
2. ピペットを使用してサンプルから1x DPBSを取り出し、細胞を含むディッシュに1 mLのイメージングバッファーを加えます。
3. 皿をSMLM対応顕微鏡のステージに取り付けます。高NA対物レンズと高光学倍率を使用してください。
4. ディッシュの座標系を使用して、選択した原子核の1つ(ステップ3.15から)を見つけ、カメラの視野の中央に配置します。
   注:酵素反応は、fBALM法の正しいpHに達し、適切なまばたきを容易にするまで~60〜180分かかります。温度変化は軸方向のドリフトにつながる可能性があるため、サンプルが機器の温度に適応するのに十分な時間を確保するために、できるだけ早く観察皿を取り付けることをお勧めします。SMLM顕微鏡を収容する部屋の温度が測定中ずっと安定していることを確認してください。
5. 顕微鏡のZドライブで焦点を変え、上限と下限の位置を記録することで、核の高さを決定します。
6. さまざまな時点で、レーザー出力を上げて、fBALMプロセスによって生成される適切な点滅を確認します。サンプルが適切な確率的点滅を示したら、超解像SMLMの再構成に必要な画像シリーズの取得を開始します。
   注:fBALMに使用される顕微鏡には、使用する蛍光色素を励起するのに適しており、フレームあたりの十分な光子数を確保するために十分に高い光子密度を生成できる励起レーザーを装備する必要があります。他のすべての実験の前に、パイロット実験でこれをテストします。
7. fBALMプロセスの適切な点滅が保証されたら、50ミリ秒の露光時間を使用して画像シリーズの取得を開始し、~20 fpsのフレームレートになります。
8. 200 nmのステップ間隔で、光光学セクションあたりわずか500フレームで、核(中央セクション付近)を通るzスタックを取ります。中央セクションに戻り、50,000フレームの画像シリーズを撮影して、高い位置特定精度で構造の詳細を適切に再構成するのに十分な点滅イベントを収集します(これには~45分かかります)。
   注:zスタックは、核全体に対するDNAシグナルの中間セクションの割合を決定するために重要です。有効ピクセルサイズがSMLM²² に適しており、カメラの信号がセンサーを飽和させていないことを確認してください。
9. 次の要件が満たされていることを確認します
   1. 16ビット画像の数とサイズによっては、画像スタックのファイルサイズが非常に大きくなる可能性があるため、取得コンピュータに十分なディスク容量があることを確認してください。
   2. 取得ソフトウェアを実行しているコンピューターが、大容量のファイルサイズ(>4 GB)を処理できる使用ストレージデバイス上のファイルシステムを処理できること、およびストレージデバイスへの転送速度が、画像データをストレージデバイスに直接記録する場合にリアルタイムでファイルを書き込むのに十分な速度であることを確認してください。
   3. 画像取得後にデータを保存する場合は、コンピュータに十分なRAM(64GBなど)が搭載されていることを確認してください。

5. SMLM顕微鏡のzキャリブレーション用の蛍光ビーズを含む皿の準備と記録

注:顕微鏡の乱視レンズの軸方向の校正を適切に行い、光軸に沿って正しい位置を割り当てるには、蛍光100 nmビーズのZスタックを記録することを検討する必要があります。

1. ビーズを1x DPBSで1:10,000に希釈し、SMLM測定に使用したのと同じタイプのディッシュに100 nmビーズをシードします。
   注意: #1.5カバーガラスなどの最高の光学品質と仕様のみを使用してください。
2. 校正皿を顕微鏡に取り付けます。ビーズの焦点面(合計~1.5 μm、ここでは10 nmステップ)を介して画像スタックを記録します¹⁵。
3. データをデータ分析コンピュータに転送します。
   注意: キャリブレーションスライドを長期間保管して使用しないでください。

6. SMLMデータ処理

注:ImageJ²³ プラグイン「ThunderSTORM」²⁴ は、ローカリゼーションの登録に使用されました(例えば、画像スタック内の点滅スポットをローカリゼーション座標、フレーム番号などを含むリストに変換)。ImageJまたはFiji²⁵ は、すべての主要なデスクトップオペレーティングシステム(Linux/Windows/macOS)で動作し、無料でダウンロードして使用できます。

1. FijI で ThunderSTORM を使用するには、必ず Hohlbein Lab の更新サイトを HELP |アップデート |更新サイトの管理、Hohlbein Lab のチェックボックスをオンにして、フィジーを再起動します。プログラムが十分なメモリにアクセスできることを確認してください。
   注:画像データは、ImageJ/Fijiで読み取ることができるファイル形式である必要があります。標準の商用システムでデータを記録する場合は、ImageJ 用の Bio-Formats プラグイン (フィジーに自動的に付属) を使用してデータを直接開きます。この場合、MATLAB スクリプト h52tif.m (プロトコルの冒頭で説明されている GitHub ページに記載されています) を使用して、カスタム セットアップによって記録された記録されたデータを hdf5 形式から TIFF 形式に変換しました。
   1. 使用するシステムで使用可能なメモリの量と記録するフレームの数に応じて、メモリ不足を避けるためにデータをいくつかのサブスタックに分割します。
      注:以下では、結果セクションに示されているデータの抽出に使用された設定が使用されています。ThunderSTORM 設定の詳細については、オンラインで見つけることができる ThunderSTORM チュートリアルを参照してください。
2. 希望の記録条件に応じて ThunderSTORM 設定を調整して、点滅信号の検出設定を最適化します。 ThunderSTORMをクリックします|解析を実行し、 カメラ設定 を選択し、画像データの正しい ピクセルサイズ 、 A/Dカウント、使用するカメラの 量子効率 、 ベースレベル、 およびEMゲイン を入力します(このセットアップでは、 ピクセルサイズ:65 nm、A/Dカウント:0.64、量子効率:0.8)。
3. 次に、点滅信号をフィッティングしてローカリゼーション座標を決定するアルゴリズムを選択します。[イメージ フィルタリング]セクションで、B-スプライン次数 3、B スプライン スケール 2.0 のウェーブレット フィルタ(B スプライン)を使用します。その他の設定では、分子の近似局在化方法を局所最大値に設定し、ピーク強度しきい値を 2*std(Wave.F1)に、接続性を 8 近傍に設定します。[分子のサブピクセル局在化] セクションで、[PSF: 積分ガウス]、[フィッティング半径 [px]: 3、[フィッティング方法: 最尤法]、および [初期シグマ [px]: 1.6 を選択します。
4. プラグインを実行して、検出された各ローカライゼーションのエントリとそのプロパティを含むテーブルを作成します。テーブルをハードドライブに保存します。
5. 複数の画像スタックを分析する必要がある場合、または画像スタックを複数のスタックに分割する必要がある場合 (たとえば、大規模なデータセットの分析を可能にするため、またはデータ分析コンピューターで使用可能なメモリが少ない場合など)、マクロを実行してローカリゼーション検出を自動化します。
6. 取得データを複数のイメージスタックに分割する必要がある場合は、ファイルを次々にインポートして、ThunderSTORMのローカライゼーションテーブルを連結します。「インポート」メニューの「現在の表に追加」オプションがアクティブになっていること、および表内のローカライズが上書きされないように正しい開始番号が使用されていることを確認します。
7. 完全なローカリゼーション テーブルが生成されたら、結果テーブル内の場所から画像を再構築して結果を確認します。ThunderSTORMの結果ウィンドウの[視覚化]ボタンを押して、再構成された画像(ローカリゼーションのヒストグラムなど)が表示されるのを待ちます。
8. 再構成された画像に、横方向のドリフトやその他のイメージングアーティファクトなどの問題がないか確認します。ド リフト サブメニューで、データスタックの合計されたサブセクション(ここで使用)の相互相関を決定するか、サンプルの基準マーカーを使用して、ドリフトを測定して修正します。 >> メニューを押した後、 5つのビン と 倍率 (このプロトコルでは6.5 )を入力します。X ドリフトと Y ドリフトを示すウィンドウが表示されるまで待ちます。
   注:記録後の最初の画像は、(蛍光色素を暗い状態にしている間)強い背景蛍光に悩まされる可能性があります。したがって、最初の数百枚の画像を解析から除外する必要がある場合があります(たとえば、ThunderSTORMメインウィンドウの[フィルター]フィールドに「フレーム>500」と入力します)。
9. 複数の連続したフレームで見える信号を過剰にカウントしないようにするには、平均ローカリゼーション精度(ここでは20 nm )、 1ダークフレーム、 および0最大フレーム (分子の最大オン時間に制限なし)を考慮した半径を使用して、ローカリゼーションデータにマージを適用します。
10. 薄い光の光学極薄切片のみを解析する必要がある場合は、焦点面の上下のすべての局在をデータセットから除外します。まず、結果テーブルを含むウィンドウで[ ヒストグラムのプロット ]を押して、最も局在化を含むz内の点を探し、次にフィルタリングコマンドを使用して、この点の上下 50nm の局在化を破棄します。
    z > "ヒストグラムピーク" - 50 & z < "ヒストグラムピーク" + 50
11. 記録されたセクションのDNAの割合を決定するには、ステップ4.7.1で記録された画像スタックの各平面(厚さ200 nm、各側100 nm)の局在を決定します。プラグイン |サンダーストーム |インポート/エクスポート |結果をインポートし、記録された各スライスを200 nmにフィルタリングします。このためには、フィルターフィールドに入力した後、[適用]をクリックします。
    Z > -100 &; Z < 100
12. [ 視覚化] をクリックし、[ ヒストグラム ] オプションを選択して、各スライスの画像を生成します。結果の画像を TIFF 形式のフォルダーに保存します。開いているすべての画像を閉じます。すべてのイメージ平面に対してこれを繰り返します。
13. すべてのスライスを開き、Image |スタック |積み重ねる画像。画像 |スタック |Z-Project を選択し、[合計] オプションを選択します。ImageJでROIマネージャーを開きます(Analyze |ツール |ROI-マネージャー);次に、ImageJメインウィンドウのImageJツールバーからポリゴン選択ツールを選択し、核の輪郭を描きます。ROI-Managerで[追加]をクリックします。
    1. [分析] |[測定]を設定し、[統合密度]を選択します。[分析] |測定。ThunderSTORMで、上記のように中心面の結果テーブルを開き、フィルターフィールドで次のコマンドを使用して、厚さ100nmにフィルター処理します。
       Z > -50 &; Z < 50
14. 上記のようにフィルタリングされたローカリゼーションのヒストグラムを生成し、ROI Managerで定義されたROIを選択してアクティブ化し、Analyze |測定。
15. 測定された積分密度(絶対DNA密度を計算するためのステップ8.2で必要な変換係数)を除算することにより、局在化の総数に対する厚さ100 nmの中間セクションの局在の割合を決定します。
    注:DNA含有量は局在化の数に比例します。したがって、画像化された超解像画像(中央セクション)のDNAの割合を推定するには、核全体の体積全体の局在の総数を決定し、関心のあるセクションの局在の総数を決定するだけで十分です。これは、ローカリゼーションの 2D ヒストグラムを生成することで実現できます。

7. SMLM顕微鏡のZキャリブレーション

1. フィジーのセクション5で記録された画像スタックを開きます。
2. ThunderSTORMプラグインメニューで、 3Dキャリブレーション サブメニュー |シリンドリカルレンズのキャリブレーション。
3. キャリブレーションデータの記録に使用する ステップサイズ (10 nm)を入力し、キャリブレーションに使用する 画像スタックの領域 を定義します。
4. キャリブレーション ファイルを保存する場所を指定します。
5. [分子のサブピクセル局在化]パネルで[PSF:楕円ガウス(3D乱視)]を選択し、セクション5で作成したキャリブレーションファイルへのファイルパスを調整して、[解析の実行]ダイアログウィンドウでキャリブレーションデータを使用します。

8. ボロノイテッセレーション

注:ローカリゼーションテーブルが生成され、グルーミングされたら、画像解析の最後のステップであるボロノイテッセレーションに進みます。このステップでは MATLAB 2021 を使用します。MATLAB スクリプトは、「Localization Analyzer for Nanoscale Distributions」(LAND) ソフトウェア パッケージの一部であり、 材料表のリンクからダウンロードできます。データの記録やローカリゼーションテーブルの生成と同様に、メモリと処理能力が十分に装備されたシステムを使用することが重要です。この出版物の画像を生成するために使用されたシステムには、128 GB の RAM と 9 コアの Intel i9 CPU が搭載されていました。

1. MATLAB スクリプト "TS2Orte.m" を実行して、ローカリゼーション テーブルを MATLAB 行列に変換し、".mat" 形式で保存することで、ThunderSTORM ローカライズ テーブルを .csv 形式から Orte 形式に変換します。
2. データが正しい形式になったら、ボロノイ テッセレーションと DNA 密度計算の準備を開始します。核内の塩基対の数を、体積に対する画像化されたセクションの局在化の相対数で割ることによって、変換係数を計算します(ステップ6.15を参照)。 LAND-Voronoi フォルダーに移動し、 /coreAlgorithm サブフォルダーで voronoiCluster.m ファイルを開き、13 行目の絶対密度計算の 変換係数 を調整します。
   注:G₁ HeLa核の例については、図5を参照してください。265 の変換係数が測定されました。
3. 解析を開始するスクリプト「VonoRoi.m」を編集します。 Orte ローカライズ データへのファイル パスと、結果ファイルの出力フォルダーを調整します。座標リストで、テッセレーションを行う領域を定義する座標を指定します。Voronoi テッセレーションは計算に時間がかかる場合があるため (使用するマシンの仕様によって異なります)、同じ入力データセット内で計算する複数の領域を定義します。
4. スクリプトを実行した後、絶対DNA密度を示す画像と、面積分布のヒストグラムを示すグラフを含む他のファイル、および出力フォルダー内の計算されたすべてのボロノイ細胞の密度を含む「densities.mat」ファイルを探します。

Results

図5に示すHeLa核は、セクション3のCellProfiler4.2.1によって生成された表から選択され、図5に示すヒストグラムの最初のピークに近い統合蛍光強度を持ち、G₁相の核を表します。その小さなサイズと顕著な内部構造を考えると、有糸分裂後にクロマチンを脱凝縮する過程にある初期のG₁核である可能性があります。G₁にあるということは、計算のために3N(~9 × 10⁹ bp)のDNA含有量を想定できることを意味します(補足図S1を参照)。50,000フレームで構成されるfBALM測定では、厚さ100 nmの光学中央部内で2.68×10⁶の局在が検出されました(図5A)。再構成された画像の定位精度は10nmです。このセクションの局在は、高さ2.8μmの...

Discussion

この記事では、SMLMを使用して哺乳類細胞核の絶対DNA密度を測定する方法を概説します。また、培養細胞の細胞周期段階を決定する方法と、この情報を使用して、光光学超薄切片に存在するDNAの量を推定する方法を実証しました。また、fBALM SMLM顕微鏡用の接着細胞の調製と、SMLMデータを処理して細胞核内のゲノムDNAの超分解能顕微鏡画像を生成する方法についても詳しく説明しています。最後に、このプロトコルは、SMLMデータのボロノイテッセレーションを、画像化された光光学セクションのDNA推定値と組み合わせて、細胞核内の絶対DNA密度を計算する方法を示しています。

局在化顕微鏡は、核構造を研究するための強力なツールとして最近人気を博しており、最近では興味深い質問に対処するために採用されています-ゲノムのアクセシビリティとクラスター化の傾向に対するコヒーシンとBRD2の影響²⁹ 、または軟骨を通って移動する細胞のゲノムの可塑性に関するヒストンアセチル化の影響

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<強さ>細胞培養<強さ>
µ-ディッシュ 35 mm、ハイグリッド500ガラス底	イビディ	81168
C3H 10T1/2	IMB(ニールズ・ラボ)
DMEM	サーモフィッシャー	12320032
dPBS	サーモフィッシャー	14190144
FBS	ライフ・テクノロジーズ	16000-044
ヘラ	顕微鏡コア施設(IMB)
HFB	IMB(Kubben Lab)
L-グルタミン	シグマ・オルドリッチ	G7513
HFBに対する非必須アミノ酸とビタミン
ピルビン酸ナトリウム	S8636
<ストロング>サンプル準備
カタラーゼ	メルク	2593710
グルコース	サーモフィッシャー	241922500
グルコース酸化酵素	メルク	49180
パラホルムアルデヒド	シグマ・オルドリッチ	158127
RNaseカクテル	サーモフィッシャー	AM2286
SYTOX オレンジ	サーモフィッシャー	S11368
テトラスペック蛍光微小球サンプラーキット	サーモフィッシャー	T7284
トライトン X-100	サーモフィッシャー	327372500
Software
バイオフォーマット	OpenMicroscopy.org		オープンソースソフトウェア https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/
CellProfiler v4.2.1	CellProfiler.org		オープンソースソフトウェア https://cellprofiler.org
フィジー	nih.gov		オープンソースソフトウェア https://imagej.net/software/fiji/?Downloads
陸	nih.gov		オープンソースソフトウェア https://github.com/Jan-NM/LAND
マットラボ 2021	数学作品		商用ソフトウェア - 「イメージ処理ツールボックス」が必要
R.4...0.3	r-project.org		オープンソースソフトウェア https://www.r-project.org
サンダーストーム v1.3			オープンソースソフトウェア https://zitmen.github.io/thunderstorm/
<ストロング>顕微鏡:
AF 7000	ライカ
ライカGSD	ライカ
SMLM顕微鏡	クレマー研究所		S-Y博士が特注製作した。陳