合成mRNAトランスフェクション後の腫瘍細胞の遊走および浸潤のリアルタイム定量測定(英語)

腫瘍細胞の運動性は転移に重要な役割を果たします^1,2。腫瘍細胞が近隣や遠隔地の健康な組織に広がると、がん治療が困難になり、再発の一因となります^3,4。したがって、腫瘍細胞の運動性のメカニズムを理解し、関連する治療戦略を開発することが不可欠です。多くの腫瘍細胞は遺伝子発現プロファイルを変化させているため、遺伝子発現プロファイルのどの変化が腫瘍細胞の運動性の変化につながるかを理解することは非常に重要です^5,6。

in vitroで細胞遊走を測定するために、いくつかのアッセイが開発されています。一部のアッセイでは、特定の時点でしか測定できないため、限られた情報しか提供されませんが、他のアッセイでは、腫瘍細胞の運動性に関する包括的な情報がリアルタイムで提供されます⁷。これらの細胞運動性アッセイの多くは、特定の時間またはエンドポイントで定量的な結果を得ることができますが、実験期間中の細胞遊走速度の動的変化に関する十分な詳細情報を提供することができません。また、細胞遊走速度の潜在的な変化は、実験計画、細胞の種類、細胞数によっては検討が困難な場合があります。さらに、単純な治療の効果は、従来の運動性アッセイの単純な定量化によって調査することができるが、様々な組み合わせ治療の複雑な効果を研究するには、より高度な定量化が必要になる^{かもしれない8。}

微小電極で覆われたマイクロタイタープレートウェル底の電流をモニターする装置が開発された⁹。ウェルの表面への細胞の接着は電子の流れを妨げ、インピーダンスは細胞の量的および定性的結合と相関します。坑井底に微小電極が存在することで、細胞の接着、拡散、増殖を測定できます。上部チャンバーの微多孔膜の下に微小電極が存在するため、下部チャンバーへの細胞移動と浸潤の測定が可能になり、上部チャンバーは細胞外マトリックス(ECM)タンパク質でコーティングされ、侵入が可能になります¹⁰。

以前、腫瘍細胞の移動と浸潤のインピーダンスベースのリアルタイム測定は、実験全体を通してリアルタイムデータを提供し、さまざまな実験条件下で即座に比較および定量化できることが実証されました¹¹。その方法の論文では、腫瘍細胞の遊走と浸潤における目的のタンパク質の役割をテストするために、遺伝子ノックダウンが誘導されました。試験された実験条件下での本格的な遺伝子ノックダウン効果は、低分子干渉RNA(siRNA)によるエレクトロポレーション後3〜4日を要したため⁸、エレクトロポレーション後に細胞を再プレーティングし、3日後に再採取して、腫瘍細胞の移動と浸潤のインピーダンスベースのリアルタイム測定を行いました。

キナーゼ(Crk)およびCrk様(CrkL)のCT10調節因子は、様々な成長因子受容体キナーゼ経路および非受容体チロシンキナーゼ経路の下流でタンパク質間相互作用を媒介するアダプタータンパク質である¹²。CrkおよびCrkLタンパク質のレベルの上昇は、神経膠芽腫を含むいくつかのヒト癌の予後不良に寄与する¹³。しかし、CrkおよびCrkLタンパク質の上昇がどのようにして予後不良につながるかは不明です。したがって、CrkおよびCrkLの過剰発現が腫瘍細胞機能に及ぼす影響を定義することが重要です。以前、遺伝子ノックダウン研究が実施され、膠芽腫細胞の遊走と浸潤には内因性のCrkおよびCrkLタンパク質が必要であることが実証されました⁸。ここでは、腫瘍細胞の遊走および浸潤に対するCrkおよびCrkLの過剰発現の影響に対処するために、修正されたアッセイシステムが開発されました。

近年、SARS-CoV-2に対するmRNAワクチンの開発により、mRNAのin vitro合成とその治療応用が改めて注目されています(Verbekeらによる^{レビュー14})。さらに、がんやその他の疾患における合成mRNAの使用において、目覚ましい進歩が見られました^15,16。細胞のエレクトロポレーションは、合成mRNAを送達し、一過性の遺伝子改変を誘導する効果的な方法であり(Campillo-Davoらによる^{レビュー17})、合成mRNAの使用により、不死化線維芽細胞における迅速かつ効率的な遺伝子発現が可能になります¹⁸。この方法論文では、合成mRNAを用いた遺伝子の過剰発現とリアルタイムの細胞解析を組み合わせて、腫瘍細胞の遊走と浸潤を研究しています。しかし、siRNAに用いられる実験スキームは、外因性タンパク質のレベルが合成mRNAトランスフェクションで急激に増加し、合成mRNAトランスフェクション時に徐々に減少するため、合成mRNAトランスフェクションでは機能しない¹⁸。そのため、トランスフェクション直後の細胞遊走や浸潤を、細胞を追加培養することなくリアルタイムに解析できるように改良しました。

この分析法論文は、インピーダンスベースのリアルタイム測定と、合成mRNAを用いた腫瘍細胞のトランスフェクションを組み合わせることで、遺伝子のアップレギュレーションが腫瘍細胞の遊走と浸潤に及ぼす影響を迅速かつ包括的に解析できることを実証しています。この方法の論文では、膠芽腫細胞の遊走と浸潤がCrkとCrkLの過剰発現によってどのように影響を受けるかを測定するための詳細な手順について説明します。この論文では、合成mRNAが腫瘍細胞の遊走に及ぼす影響を調べることで、タンパク質レベルの上昇が腫瘍細胞の遊走をどのように刺激するかを明確に説明しています。さらに、腫瘍細胞の浸潤に対する遺伝子発現の変化の影響を評価するために、ECMゲルの濃度を変化させるアプローチが提示されています。

1. mRNAの合成

注:mRNA合成では、使用前にすべての試薬と機器を特別に処理してRNaseを不活性化する必要があります。このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、および試薬の詳細については、 材料表 を参照してください。

1. DNAの直鎖化
   注:CrkIおよびCrkLのマウスcDNAをpFLAG-CMV-5a発現ベクターにクローニングしてC末端にFLAGエピトープタグを付加し、pcDNA3.1/myc-HisベクターにサブクローニングしてT7プロモーターを組み込んだ(前述の^18,19)。
   1. 10x反応バッファー10 μL、PmeI(10,000ユニット/mL)1.5 μL、プラスミドDNA10 μgを微量遠心チューブに加え、プラスミドDNAを制限酵素で直鎖化します。ヌクレアーゼフリーの水を加えて、反応量を100μLにします。
   2. タッピングして混合し、スピンダウンし、反応混合物を37°Cで一晩インキュベートします。
   3. スピンダウンし、10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)5 μLとプロテイナーゼK(20 mg/mL、RNAグレード)1 μLを反応混合物に加えます。タップして混合し、スピンダウンし、50°Cで30分間インキュベートします。
   4. ドラフトの下で、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールの底相100 μLをプラスミド反応混合物に添加して抽出します。ボルテックスし、18,800 × g で室温で5分間遠心分離します。上相を新しいチューブに移動します。
   5. クロロホルム:イソアミルアルコールでステップ1.1.4を24:1で繰り返します。
   6. 新しいチューブにヌクレアーゼフリー水200 μLを加えて反応量を300 μLにした後、3 M酢酸ナトリウム30 μLと100%エタノール600 μLを加えます。
   7. ボルテックスで混合し、-20°Cで30〜60分間置いてDNAをエタノール沈殿させます。
   8. 18,800 × g で4°Cで20分間遠心分離し、上清を廃棄し、1 mLの70%エタノールでペレットをすすぎます。遠心分離を10分間繰り返し、上清を完全に除去します。
   9. キャップを開けた状態で2分間乾燥させ、ヌクレアーゼフリー水30 μLを加え、DNAペレットを再懸濁します。
   10. 分光光度計を使用してDNA濃度を決定します。
   11. アガロースゲル電気泳動を用いて、直鎖状DNAのサイズと量を確認します。
2. T7 RNAポリメラーゼを用いたRNA合成
   1. 10x 転写バッファー、ATP、GTP、UTP、CTP、T7 をそれぞれ 2 μL と直鎖状 DNA 1 μg を微量遠心チューブに加えます。ヌクレアーゼフリーの水を加えて、反応量を20μLにします。
   2. 反応混合物をタッピングして混合し、スピンダウンし、37°Cで2時間インキュベートしてRNA合成を行います。
   3. スピンダウンし、1 μLのDNase(2 U/μL)を添加し、37°Cで15分間インキュベートしてテンプレートDNAを除去します。
3. RNAの塩化リチウム沈殿
   1. 反応混合物に10μLの塩化リチウム(7.5 M)を加えます。タッピングして混合し、スピンダウンし、反応混合物を-20°Cで30分間インキュベートします。
   2. 18,800 × g 、4°Cで20分間遠心分離し、上清を廃棄し、500μLの70%エタノールでペレットをすすぎます。遠心分離を10分間繰り返し、上清を完全に除去します。
   3. キャップを開けた状態で2分間乾燥させ、ヌクレアーゼフリー水30 μLを加え、RNAペレットを再懸濁します。
4. キャッピング
   1. RNAサンプルを65°Cで10分間加熱した後、氷上に置いて冷却します。
   2. 10x キャッピングバッファー、10 mM GTP、1 mM(10x) S-アデノシルメチオニン(SAM)各 5 μL、キャッピング酵素ミックスと O-メチルトランスフェラーゼ酵素ミックス 各 2 μL、RNase阻害剤 1.25 μL を加えます。タッピングして混合し、スピンダウンし、反応混合物を37°Cで1時間インキュベートします。
5. ポリ(A)テーリング
   1. サンプルをスピンダウンし、ヌクレアーゼフリー水 6 μL、5x E-PAP バッファー 20 μL、25 mM MnCl₂ 10 μL、10 mM ATP 10 μL、E-PAP ポリテーリング酵素 4 μL を加えます。タッピングして混合し、スピンダウンし、反応混合物を37°Cで2時間インキュベートします。
6. 塩化リチウムの沈殿と合成mRNAの定量
   1. 50μLの塩化リチウム(7.5 M)を加え、ステップ1.3.1-1.3.3の説明に従って塩化リチウム沈殿を行う。
   2. 分光光度計を用いてmRNAの濃度を測定します。
   3. ホルムアルデヒド(1%-2%)アガロース(1%)ゲル電気泳動を用いてmRNAのサイズと量を確認します。

2. 細胞浸潤・遊走(CIM)プレートの細胞外マトリックス(ECM)ゲルコーティング

注:細胞浸潤および遊走(CIM)プレートは、インピーダンスベースのリアルタイム細胞解析用に市販されている16ウェルプレートです。細胞浸潤アッセイでは、前述したように、CIMプレートをECMゲルでコーティングしますが、いくつかの修正を加えます¹¹。

1. ECMゲルストックのアリコートを冷凍庫から取り出し、氷上に保管します。
2. 990 μLのダルベッコ修飾イーグル培地(血清または抗生物質なし)と10 μLのECMゲルを微量遠心チューブで混合することにより、ECMゲル(10 mg/mL)を使用濃度(100 μg/mL)に希釈します。穏やかなピペッティングで混合します。
3. 60 μLの希釈ECMゲルを、CIMプレートの上部チャンバーの16ウェルのそれぞれに添加します。気泡を避けながらリバースピペッティング法を適用する^20,21。
   注:各細胞株のECMゲルの濃度を最適化します。神経膠芽腫細胞株では、0.1 μg/μL から 1 μg/μL の ECM ゲルを最適化に使用しました。
4. プレートカバーを外した状態でCIMプレートの上部チャンバーを、_CO2 インキュベーター内の保護用プラスチックシートの上に約4時間置き、ゲル層を形成します。
   注意:CIMプレートをECMゲルでコーティングしている間は、CIMプレートの上部チャンバーの電極が実験者の手や、バイオセーフティキャビネットや_CO2 インキュベーターなどの機器の表面に直接接触しないようにしてください。

3.腫瘍細胞の準備

注:すべての細胞培養材料は無菌に保つ必要があります。前述したように、適切な個人用保護具(PPE)を使用して生物学的安全キャビネットの下で腫瘍細胞を採取し、電気採取しますが、いくつかの変更を加えます¹¹。

1. 腫瘍細胞の培養
   1. U-118MG細胞を、100 mm × 20 mmのポリスチレン組織培養皿あたり5%ウシ胎児血清(FBS)と1%抗生物質を含む10 mLのDMEMで、5%_CO2 インキュベーター内で37°Cで培養します(培養条件)。
2. 腫瘍細胞の血清枯渇
   注:FBS中に存在する化学誘引物質への細胞の曝露は、高濃度のFBSを使用して細胞遊走および浸潤アッセイを行う前に最小限に抑える必要があります。
   1. 古い培地を取り除き、1皿あたり0.5%のFBSと1%の抗生物質を含む予熱したDMEMを10 mL加えます(低血清培地)。
   2. 手順3.2.1を繰り返します。
   3. 細胞を5%_CO2 インキュベーターで37°Cで4時間以上インキュベートします。
3. 腫瘍細胞の採取
   1. 古い培地を取り除き、予熱したダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を皿ごとに8 mL添加し、DPBSを除去し、予熱した0.05%トリプシン-EDTA(2 mL/皿)を加えて表面を覆い、_CO2 インキュベーターで30秒間インキュベートします。
   2. トリプシン-EDTAを注意深く吸引し、低血清培地(7 mL/皿)を添加し、細胞を50 mLまたは15 mLの遠心分離チューブに集めます。
   3. 少量の細胞を分注し、携帯型自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。
   4. 10,000細胞/μLの細胞の総数と必要な容量を計算します。
   5. 室温で100 × g で5分間遠心分離して細胞をスピンダウンし、上清を吸引し、0.5%FBS(抗生物質なし)を含む計算された量のDMEMを加え、細胞ペレットを静かに再懸濁します。
   6. 110万個の細胞を含む110μLの細胞懸濁液を、処理ごとに微量遠心チューブに移します。
   7. ステップ3.3.6を繰り返して、細胞を4本の微量遠心チューブに移し、4つの異なる処理を行います。
      注:CIMプレートには合計16個のウェルがあります。比較のために 4 つの異なる処理を設計し、各処理に CIM プレートの 4 つのウェルを割り当てることができるようにします。エレクトロポレーションした細胞は、ウェスタンブロット解析(35 mm組織培養皿あたり30万細胞)、リアルタイム細胞遊走アッセイ4ウェル(10万細胞/ウェル)、およびリアルタイム細胞浸潤アッセイ4ウェル(10万細胞/ウェル)の各実験に使用します。実験計画が変わった場合は、エレクトロポレーションが必要な細胞の数を調整します。

4. 腫瘍細胞のエレクトロポレーション

1. 培地を除去するには、各チューブ内の細胞懸濁液に1 mLのDPBSを加え、ミニ遠心分離機を使用してチューブを10秒ごとに180°回転させながら、細胞懸濁液を毎回10秒間3回スピンダウンし、マイクロピペットを使用して上清を除去します。
   注:コンパクトで再懸濁しやすい細胞ペレットを形成することが重要です。
2. 細胞ペレットに110 μLの再懸濁バッファーRを加え、10 μLで10万個の細胞を得ます。
3. 合成mRNAを細胞ペレットに添加し、目的の発現レベルに応じて0.2〜20 ng/μLの濃度を得ます。細胞ペレットを混合し、タッピングまたは穏やかなピペッティングにより穏やかに再懸濁します。
   注:タンパク質発現と生物学的効果の間の特異的な相関関係を調査するために、異なる濃度の合成mRNAを使用し、ウェスタンブロット分析を使用してタンパク質発現を調べ、目的の発現レベルにつながる合成mRNAの濃度を決定します。
4. 10 μL の細胞懸濁液を 1,350 V のエレクトロポレーションシステムで 10 ms 、毎回 3 パルスでエレクトロポレーションします。
5. エレクトロポレーションした細胞を、0.5% FBSを含む1.1 mLのDMEMが入った新しい微量遠心チューブに移します。
6. 残りの細胞懸濁液がエレクトロポレーションされるまで、エレクトロポレーションを繰り返します。エレクトロポレーションした細胞を微量遠心チューブで組み合わせて、1.1 mLで110万個の細胞を得ます。
   注:100 μL と 10 μL の両方のエレクトロポレーションチップを使用して大量の細胞をエレクトロポレーションできますが、10 μL と 100 μL のエレクトロポレーションチップは 2 つの別々のキットに含まれているため、別途購入する必要があります。再懸濁バッファーRは両方のキットに含まれています。
7. それぞれのエレクトロポレーションがすべて完了したら、プールした細胞を静かに再懸濁します。
8. 35 mm × 10 mmのポリスチレン組織培養皿に30万個の細胞を5% FBSを含むDMEM2 mLで播種し、全細胞ライセート調製およびウェスタンブロット解析のための培養条件下で1日間培養します。
9. 残りのエレクトロポレーションセルは、リアルタイム細胞解析システムの準備が整うまで室温で保管します。

5. リアルタイムセルアナライザー、プログラム、CIMプレートのセットアップ

メモ: 前述したように、リアルタイムセルアナライザーと 2 つの CIM プレートを準備します¹¹.

1. リアルタイムセルアナライザーの平衡化
   1. 使用の数時間前にリアルタイムセルアナライザーを_CO2 インキュベーターに移し、培養条件下でシステムを平衡化します。
2. 解析プログラムのセットアップ
   1. デスクトップの リアルタイム細胞解析ソフトウェアのアイコンをダブルクリックして、解析プログラムを開きます。
   2. [ 既定の実験パターンの設定 ] オプションが開いたら、3 つの実験を個別に実行するオプションを選択します。
      注意: 各クレードルには個別のウィンドウがあります。測定間隔と測定時間、データ解析、その他の実験条件を設定するためのさまざまなタブがあります。
   3. [ 番号 ]タブをクリックして、各クレードルを開きます。
   4. [ 実験ノート ] タブをクリックし、データの保存先のフォルダーを選択して、実験の名前を入力します。
   5. レイアウトタブをクリックし、一度に4つのウェルを選択してサンプル情報を入力することで、処理条件ごとに4つのウェルを設定し、適用をクリックします。
   6. [ スケジュール ]タブをクリックします | ステップを追加して 、セル インピーダンス測定の 2 ステップ モードを設定します。次に、「 適用 」をクリックして最初のステップを設定します。
   7. [ ステップの追加 ] をもう一度クリックし、間隔に 10 分、移行と侵入の期間に 48 時間を入力し、[ 適用 ] をクリックして 2 番目のステップを設定します。
      注意: 最初のステップでは、1回限りのベースライン測定(1分間隔で1回のスイープ)を行います。2番目のステップでは、クレードルで実験のセルインピーダンスを測定します(たとえば、10分間隔で48時間、289回のスイープ)。実験計画に応じて間隔と期間を調整します。
   8. 次のクレードルに移動し、手順5.2.3〜5.2.7を繰り返してセットアップします。
3. CIMプレートの準備
   1. 細胞インピーダンス測定開始の1時間前に、CIMプレート下部チャンバーのウェルに、10%血清またはその他の化学誘引物質を含む160 μLのDMEMを充填します。
   2. ECMゲルコーティングウェル(侵入用)またはコーティングされていないウェル(マイグレーション用)を含む上部チャンバーを下部チャンバーに組み立てます。
   3. 細胞遊走アッセイ用のCIMプレートの上部チャンバーのウェルに50 μLの低血清培地を加え、CIMプレートをシステムのクレードルに配置します。
   4. 「メッセージ」タブをクリックし、「接続OK」メッセージが表示されていることを確認します。これで、CIMプレートを実験する準備が整いました。
   5. 組み立てたCIMプレートを_CO2 インキュベーターで30〜60分間プレインキュベートしてから、リアルタイム細胞解析を行い、CIMプレートを培養条件に順応させます。

6. リアルタイムの細胞解析とデータエクスポート

注:前述のように、ベースラインの読み取り、セルのシード、セルインピーダンス測定、およびデータのエクスポートを実行します¹¹。

1. ベースラインの読み取り
   注意:ベースラインは、CIMプレートを順応させた後、細胞を上部チャンバーのウェルに追加する前に読み取る必要があります。
   1. 各クレードルの [スタート ]ボタンをクリックします。[ 名前を付けて 保存]ウィンドウが表示されたら、実験ファイルを保存してベースラインの読み取りを実行します。
2. 細胞播種
   1. クレードルからCIMプレートを取り外し、プレートホルダーのバイオセーフティキャビネットに置きます。
   2. コントロールユニットのプログラムに従って、100μL(100,000個の細胞を含む)のエレクトロポレーションセルをCIMプレートの上部チャンバーのウェルに追加します。気泡を避けながらリバースピペッティング法を適用してください。
   3. CIMプレートをバイオセーフティキャビネットの下に室温で30分間放置し、細胞がウェルの底に均等に広がることを確認します。
3. セルインピーダンス測定
   1. 完全に組み立てられた CIM プレートをそれぞれのクレードルに戻します。クレードルの [スタート ]ボタンをクリックして、2番目のステップのセルインピーダンス測定を開始します。
   2. 「 プロット 」タブをクリックし、「 すべて追加 」ボタンをクリックし、「 平均 」ボックスと 「標準偏差」 ボックスを選択して、データをリアルタイムで視覚化します。
      注: 既定のプロット オプションは、X 軸が [時間] で、Y 軸が [セル インデックス] です。 「プロット選択」セクションでは、Y軸の代替オプション(正規化されたセルインデックスまたはデルタセルインデックス)を選択できます。最後のスイープが行われると、実験は完了し、結果は自動的に保存されます。
4. 分析用データのエクスポート
   1. [ プロット ]タブをクリックし、[ 平均 ]ボックスと[ 標準偏差] ボックスを選択して、各ウェルのデータを個別にコピーします。
   2. プロット エリアを右クリックし、[ データをリスト形式でコピー] を選択します。
   3. 空のスプレッドシート ファイルを開き、データを貼り付けて、ファイルを保存します。
   4. 解析プログラムに戻り、各クレードルの [プレート ]タブをクリックし、[ リリース ]を選択してクレードルの実験を閉じます。
   5. スプレッドシート ファイルに戻り、2 番目のステップの開始時刻が測定の実際の開始時刻になるように生データの時刻を調整します。

CrkおよびCrkLタンパク質は、ニューロン22、T細胞23、線維芽細胞18,19、およびさまざまな腫瘍細胞13を含む多くの細胞タイプの運動性において重要な役割を果たします。膠芽腫ではCrkおよびCrkLタンパク質が上昇していることが報告されているため24,25,26、Crkのスプライス変異体であるCrkIの過剰発現が神経膠芽腫細胞遊走に及ぼす影響が本研究で研究された。U-118MG細胞を異なる濃度の合成CrkI mRNAでエレクトロポレーションし、タンパク質レベルと細胞遊走について分析しました。さまざまな濃度の合成CrkI mRNAを用いたU-118MG膠芽腫細胞のエレクトロポレーションにより、トランスフェクションの1日後にFLAGタグ付きCrkIタンパク質が濃度依存的に増加しました(図1A)。0.2 ng/μL および 2 ng/μL の mRNA では、外因性の CrkI タンパク質の発現が検出できないか、または控えめに抑えられましたが、20 ng/μL の mRNA では、内因性の CrkI タンパク質よりもはるかに高い発現レベルが得られました。

リアルタイム細胞解析システムを用いた細胞遊走アッセイの結果、0.2 ng/μLまたは2 ng/μLの CrkI mRNAによるエレクトロポレーションは、細胞遊走に大きな影響を与えないことが示されました。しかし、20 ng/μL の CrkI mRNA によるエレクトロポレーションでは、細胞遊走が明らかに刺激され、2 時間から 13 時間の間により多くの細胞が遊走しました(図 1B)。CrkI蛋白レベルと細胞遊走の比較により、膠芽腫細胞遊走はCrkI蛋白レベルの増加によって刺激されることが明らかになりました。CrkIタンパク質レベルは、細胞遊走の実質的な刺激を引き起こすために、特定の閾値よりも高くなければならないようです。特定の時点での遊走細胞をカウントまたは観察するために、細胞移動をさまざまな方法で測定していた場合、細胞移動におけるこの種の変化を特定するには、はるかに多くの労力が必要だった可能性があります。

CrkLの過剰発現が、ECMタンパク質の濃度の異なるECMゲル層を介した神経膠芽腫細胞の浸潤にどのように影響するかを研究するために、U-118MG細胞を合成CrkL mRNAでエレクトロポレーションし、タンパク質レベルとECMゲル層を介した細胞浸潤の観点から分析しました。合成CrkL mRNAを用いたU-118MG膠芽腫細胞のエレクトロポレーションにより、トランスフェクションの1日後にFLAGタグ付きCrkLタンパク質が強固に発現しました(図2A)。ECMタンパク質の濃度が上昇すると、コントロール細胞への浸潤が遅くなりました(図2B)。また、CrkLを過剰発現した細胞は、ECMゲル濃度に依存した細胞浸潤の減少を示しました(図2C)。異なるECMゲル濃度における対照細胞とCrkL過剰発現細胞の比較では、CrkLの過剰発現は一般にECMゲル層を介した細胞浸潤を刺激することが示されました(図2D-G)。しかし、2つの細胞集団の違いは、ECMゲルの濃度に応じて異なる時点で明らかになりました。

0.1 μg/μL の ECM ゲルでは、CrkL の過剰発現による細胞浸潤の刺激が 8 時間から 20 時間の間に明らかになりましたが(図 2D)、32 時間後には細胞浸潤の差は無視できるほどでした。0.2 μg/μL の ECM ゲルでは、CrkL の過剰発現がある場合とない場合の細胞浸潤の差は、常に最小限でした(図 2E)。0.5 μg/μL の ECM ゲルでは、24 時間と 36 時間の間に細胞浸潤の差が明らかになりました(図 2F)。1 μg/μL の ECM ゲルでは、細胞浸潤に対する CrkL の過剰発現効果が 48 時間でわずかに明らかになりました(図 2G)。この結果は、コントロール細胞とCrkL過剰発現細胞の違いを検出するためのウィンドウが、ECMゲルの濃度が増加するにつれて、より遅い時間にシフトすることを示唆しています。また、この結果は、2つの細胞集団が、異なる時点でのECMゲル濃度の上昇によって異なる影響を受けていることを示唆しています。例えば、12時間後には、CrkLを過剰発現した細胞は、0.1 μg/μLのECMゲルでのみ、かなり高い浸潤を示しました(図2H)。しかし、24時間後には、CrkLを過剰発現した細胞は、試験したECMゲル濃度でやや高い、または同様の浸潤を示しました(図2I)。したがって、CrkLの過剰発現がある場合とない場合の2つの細胞集団の違いを包括的に把握するには、細胞浸潤における時間依存性の違いとECMゲル濃度依存性の両方を調べることが重要です。これらの結果は、合成mRNAを用いた一過性の過剰発現とインピーダンスベースのリアルタイム細胞解析を組み合わせることで、遺伝子の過剰発現と腫瘍細胞の遊走および浸潤との潜在的な相関関係を解析するための強力なツールとなることを示しています。合成mRNAおよびECMゲルの濃度変動の影響を調べることで、より正確で詳細な情報が得られます。

図1:膠芽腫細胞遊走に対するCrkIの過剰発現の影響。 U-118MG細胞を、FLAGタグ付き CrkI mRNAの指示濃度(ng/μL)でエレクトロポレーションしました。(A)ウェスタンブロット解析では、エレクトロポレーションした細胞を1日間培養してから、全細胞ライセートを調製しました。合成 CrkI mRNAによるトランスフェクション時のタンパク質レベルを比較しました。抗Crk抗体および抗CrkL抗体を使用して、内因性タンパク質とFLAGタグ付きタンパク質の両方を検出し、内因性タンパク質とFLAGタグ付きタンパク質の比率を比較しました。ビンキュリンとα-チューブリンをローディングコントロールとして使用しました。(B)細胞遊走解析では、エレクトロポレーションした細胞をCIMプレート上にプレーティングし、それ以上の培養を行わなかった。各サンプルの 4 つのウェルからセル指数値を取得し、それらの平均 ± SD 値を示します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:膠芽腫細胞浸潤に対するCrkLの過剰発現の影響。U-118MG細胞をヌクレアーゼフリーのH2Oまたは20 ng/μL FLAGタグ付きCrkL mRNAでエレクトロポレーションしました。(A)ウェスタンブロット解析では、エレクトロポレーションした細胞を1日間培養してから、全細胞ライセートを調製しました。合成CrkL mRNAによるトランスフェクション時のタンパク質レベルを比較しました。抗Crk抗体および抗CrkL抗体を使用して、内因性タンパク質とFLAGタグ付きタンパク質の両方を検出し、内因性タンパク質とFLAGタグ付きタンパク質の比率を比較しました。ビンキュリンとα-チューブリンをローディングコントロールとして使用しました。(B-G)細胞浸潤解析では、エレクトロポレーションした細胞を、ECMゲルコーティングを施したCIMプレート上に、それ以上の培養を行わずにプレーティングしました。各サンプルの 4 つのウェルからセル指数値を取得し、それらの平均 ± SD 値を示します。(B)ECMゲル濃度の異なる対照細胞からの細胞浸潤データを比較した。(C)CrkL過剰発現細胞の細胞浸潤データを、さまざまなECMゲル濃度で比較しました。(D-G)コントロール細胞とCrkL過剰発現細胞の間の細胞浸潤データを、示されたECMゲル濃度について比較しました。(H)コントロール細胞とCrkL過剰発現細胞の12時間での細胞浸潤の比較。(I)対照細胞とCrkL過剰発現細胞の24時間での細胞浸潤の比較。略語:ECM =細胞外マトリックス;CIM = 細胞の浸潤と移動。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:遺伝子ノックダウンまたは遺伝子過剰発現後の実験手順の概略図。 (A)siRNAトランスフェクション後のリアルタイム細胞解析の実験手順。実験条件下でsiRNAトランスフェクション後、完全な遺伝子ノックダウンを誘導するには3〜4日かかるため、エレクトロポレーション後、細胞を再播種し、3日間培養してから、リアルタイムの細胞解析の準備が整いました。(B)合成mRNAトランスフェクション後のリアルタイム細胞解析の実験手順。合成mRNAトランスフェクションによるタンパク質発現は速いため、エレクトロポレーションした細胞を同日にリアルタイムの細胞解析に使用しました。2つの実験手順の違いに注意してください。siRNAを用いた遺伝子ノックダウンのエレクトロポレーションの3日後にリアルタイム細胞解析を行ったのに対し、合成mRNAによる遺伝子の過剰発現についてはエレクトロポレーションの直後にリアルタイム細胞解析を行いました。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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