子宮内膜脱落膜化研究のための卵巣摘出術を用いたマウス人工脱落膜モデルの生成

サマリー

ここでは、子宮内膜脱落膜化の研究分野における古典的な子宮内膜脱落膜化実験である卵巣摘出マウスを用いた人工脱落膜モデルの生成方法について述べる。

要約

子宮内膜脱落膜化は子宮内膜の独特の分化過程であり、月経および妊娠と密接に関連しています。脱落膜化の障害は、不妊症、流産の再発、早産などのさまざまな子宮内膜障害を引き起こします。生殖研究における子宮内膜脱落膜モデルの開発と使用は、長い間生殖研究者にとってハイライトでした。マウスは、生殖と脱落膜化の研究に広く使用されています。脱落膜化に関しては、自然妊娠脱落膜化(NPD)、人工脱落膜化(AD)、および in vitro 脱落膜化(IVD)の3つの確立されたマウスモデルがあります。その中で、ADはマウス脱落膜化の信頼できるモデルと考えられており、実装が容易でNPDに近い。本稿では,卵巣摘出術によるマウス人工脱落膜モデルの生成と適用過程を改変し,卵巣外の影響を回避し,群内分散の少ない再現性の高い結果を得る方法に着目した。この方法は、子宮内膜脱落膜化の研究のための良好で信頼性の高い動物モデルを提供する。

概要

ヒト補助生殖技術の開発により、体外受精胚移植(IVF-ET)の現在の臨床妊娠率は自然妊娠のそれに達するか、それを超えています。それにもかかわらず、生殖補助医療の多くの患者は依然として複数の胚移植を受けていますが、希望する妊娠を達成できません。しかし、その具体的な分子メカニズムはまだ不明であるため、臨床介入は効果がなく、生殖医療が直面している重要な課題の1つです^1,2。

子宮内膜因子は、体外受精不全の原因の約3分の2を占めています³。ヒト胚着床は、ポジショニング、接着、侵襲の3つの段階に分けられます^4,5,6。母体の子宮内膜は、胚の到着に合わせて一連の変化を受けます。着床「ウィンドウ期間」を形成することは、胚着床に好ましい条件を提供する^7,8。

ほとんどの哺乳類では、胚盤胞が子宮の管腔上皮に付着した後、胚盤胞を取り巻く間質細胞が急速に増殖および分化し始め、間葉の急速なリモデリングがその形状と機能を変化させ、胚着床につながります^5,9,10。部位の体積と重量の急速な増加により、胚盤胞が子宮間質に埋め込まれるようになり、脱落膜化¹¹として知られるプロセスが可能になります。子宮内膜間質は妊娠に備えて分化およびリモデリングしますが、間質細胞の移行は、脱落膜細胞がその機能を果たすためのスペースと新しいシグナル伝達接続を提供します^12,13。間質細胞は脱落膜細胞に変化し、プロラクチン(PRL)、インスリン様成長因子結合タンパク質1(Igfbp1)などの多くの象徴的な因子を分泌します。研究によると、異常な脱落膜化が胚着床失敗の主な理由の1つであることが示されていますが、異常な脱落膜化の原因はまだ不明であり、さらに解明する必要があります^1,14。

マウス人工脱落膜モデルは、脱落膜化の根底にある生理学的プロセスと分子メカニズムを研究するために不可欠です。人工脱落膜化(AD)は、主に妊娠または月経周期をシミュレートするための人工的な方法によって確立された子宮内膜脱落膜化のプロセスを指します。形態に関しては、妊娠脱落膜化と人工脱落膜化の間に全体的な違いはほとんどありません^15,16。子宮腺は脱落膜が形成される前に子宮内膜に存在し、脱落膜化後に消えます。遺伝子発現に関しては、自然妊娠脱落膜化(NPD)と^AD15の間にわずかな違いが確認されています。その結果、マウスの人工脱落膜化モデルは、妊娠脱落膜化をシミュレートして、未知の病因とヒト生殖疾患の新しい治療法を探索することができます。

NPD、AD、および in vitro 脱落膜化(IVD)は、マウス脱落膜化を達成するための3つの方法です。NPDモデルは自然妊娠に依存し、胚の影響を含む母体の生理学的状態に最も近い。移植部位と非移植部位の違いを比較することは、脱落膜化を研究するためのより生理学的で便利なアプローチです。ADモデルは、胚の影響を避けるために、精管切除された雄と交配した偽妊娠雌マウスに脱落膜を誘発するための刺激剤としてゴマ油の子宮内注射を使用することによって開発されました。NPDモデルとADモデルはどちらも異なる研究目的で重要な役割を果たしますが、母体ホルモン代謝の異なる活動によって引き起こされる交配の失敗やグループ内の違いを避けることはできません。IVDは、細胞レベルでのエストロゲンとプロゲステロンの併用治療に依存する方法であり、より厳しい実験条件と操作能力が必要です。しかし、 in vitro モデルは、生理学的条件下での脱落膜応答を完全にシミュレートすることはできません¹⁵。そこで我々は、脱落膜化に対する内因性ホルモンの影響を低減するために、従来のADから修正された簡便で改良された誘導法を提案する。脱落膜誘導の成功を確実にすることに基づいて、それは生理学的状態に近く、胚因子を排除する必要がある実験により適しています。

プロトコル

記載されているすべての動物実験は、南京大学医学部の動物の使用と世話に関する委員会(第20171202号)の附属ドラムタワー病院によって承認されました。すべての操作は、適切な動物の世話と使用の機関と国のガイドラインに従います。

注:マウスは、温度22°C±1°C、相対湿度50%±1%、明暗サイクル12時間/12時間、および食物と水への自由なアクセスを備えた、特定の病原体のない(SPF)環境で飼育されました。

1.マウス卵巣摘出術

1. 手術の1日前に高温高圧滅菌器で手術器具を滅菌してください。
2. 8週齢のC57BL / 6マウスの体重を量り、腹腔内(i.p)に応じて1%ペントバルビタールナトリウムを注射してマウスに麻酔をかけます。使用される用量は40 mg / kg¹⁷です。この用量は40〜60分の鎮静を提供し、これは卵巣摘出術の要件を満たす。術前鎮痛のために、マウスに5 mg / kgメロキシカム(s.c.)を注射します。.
   注:マウスの麻酔の成功は、深部筋反射の消失と安定した呼吸によって示されます。麻酔が成功した兆候には、内側の眼窩に触れてもまばたきがない、舌を引っ張るときに飲み込むこと、つま先の間に皮膚をつまむときに脚が曲がらないこと、尾を針で刺すときに跳ね返らないことが含まれます。
3. 麻酔中の乾燥を防ぐために、眼球に保護眼軟膏を塗布します。
4. マウスが完全に麻酔をかけられたら手術を開始します。マウスを手術面の腹臥位に置き、石鹸水で濡らした後、背中の毛を剃ります。剃毛後、70%エタノールで皮膚を消毒します。
5. 脊椎に平行な両後肢の大腿根の上端の0.5 cm(または肋骨下1.0 cm)に手術切開部位を見つけます(図1A)。
   注:卵巣をすばやく局在化するには、正しい切開位置が不可欠です。
6. 切開部位を中心にヨードフォア3倍で切開部を消毒し、切開部の周りに手術用ドレープを置きます。
7. ハサミを使用して約0.5〜1.0 cmの縦方向の切開を行います。筋膜を切り、ピンセットで筋肉を受動的に分離します。
8. 薄い筋肉層を通して腎臓の下極近くの切開野で白い脂肪パッドの一部を見つけます(図1B)。
   注:白い脂肪パッドは卵巣の位置の最も明白な指標です。
9. 脂肪塊を止血クリップで固定し、脂肪パッドで包まれた卵巣を切開部から引き出します。
10. 卵巣と卵管の接合部を湾曲したピンセットで固定し、ハサミで卵巣茎に沿って卵巣を取り除きます。電気凝固ペンまたはアルコールランプで加熱した1mLシリンジの針を使用して出血を止めます。
    注:その後の子宮角へのゴマ油の注射のための解剖学的ランドマークである卵管を必ず保存してください。
11. 外科的切開部を生理食塩水で洗い流して組織の癒着を防ぎ、4-0縫合糸を使用して筋肉と皮膚をそれぞれ縫い合わせ、手術切開部を再度ヨードフォアで消毒します。
12. マウスをケージ内の腹臥位に置き、光源と換気システムを備えた25°Cのインキュベーターで約2時間蘇生させます。
13. 手術後のマウスに注意を払い、完全に回復するまで元の給餌場所に一人で戻し、十分な水と餌を与えます。

2.術後の休息とエストロゲンとプロゲステロンの処方

1. 卵巣摘出術後、マウスが2週間休むことを確認してください。
2. 超クリーンなキャビネットで、エストロゲン(2 ng / μL)とプロゲステロン(0.2 ng / μL)をRNA酵素フリー遠沈管のゴマ油に加えます。
3. 遠沈管を37°Cの恒温槽に入れ、連続的に振って溶解を促進します。
4. 完全に溶解した後、ゴマ油溶液を100μLのアリクアウトに分けて使用に便利です。調製したエストロゲンとプロゲステロンの溶液を4°Cの冷蔵庫に保管します。

3. 人工脱落膜誘発モデル

1. 皮下(s.c)50μLのゴマ油中の100ngのエストロゲンを各マウスに3日間注射し、続いて2日間の休息¹⁵。
   注意: エストロゲンとプロゲステロンが処方され、異なる場所に配置されていることを確認してください。プロゲステロンによるエストロゲンの汚染は失敗につながる可能性があります。
2. 1 mgのプロゲステロンと10 ngのエストロゲンを50 μLのゴマ油に各マウスにさらに3日間注射します¹⁵。
3. マウスを操作して、3回目のエストロゲン・プロゲステロン併用注射の6時間後に人工脱落膜モデルを¹⁵ から誘導する。
4. 卵管の下端にある子宮角を見つけ、子宮角と一緒に20μLのゴマ油をゆっくりと注入し、組織を押し戻し、切開部を縫合し、マウスを回復させます。手術のアプローチは、マウス卵巣摘出^術15と同様である。
   注:卵巣摘出術が成功した場合にのみ、2回目の手術を進めてください(皮膚切開は十分に治癒し、卵巣は完全に切除され、卵管の残留端は周囲の組織に接着されません)。
   注:ADモデルを誘導するには、20μLのゴマ油が適切です。20μL以上のゴマ油が反対側に容易に浸透します。
5. 1 mgのプロゲステロンと10 ngのエストロゲン(H.)を含むゴマ油50 μLをさらに4日間注射します。図2^15,18の詳細を参照してください。

4. サンプル収集

1. 二酸化炭素窒息によりマウス(n=6)を安楽死させ、子宮を採取する。両側の子宮の形状を観察し、写真を撮り、子宮角の重さを量ります(図3A、B)。
2. 子宮組織の3〜5 mmを10%ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋して切片化します。切片をヘマトキシリンとエオジンで染色して、形態学的変化を観察します¹⁹ (図4A)。
3. 子宮組織のさらに3〜5 mmを最適な切断温度コンパウンド(OCT)に埋め込み、液体窒素で凍結し、-80°Cの冷蔵庫に保管します。この組織を10μmに凍結切片し、アゾカップリング法²⁰ により子宮組織中のアルカリホスファターゼ活性を検出した(図4B)。
   注:パラフィン切片ではなく、凍結切片を使用してALP含有量を検出すると、満足のいく結果が得られます。
4. Trizol試薬で子宮の全RNAを抽出し、qPCRマスターミックス(材料表)を使用したリアルタイムPCRシステム(材料表)で定量的リアルタイムPCR(qPCR)を実行して、プロラクチンファミリー8サブファミリーメンバー2(Prl8a2)、アルカリホスファターゼ肝臓/骨/腎臓(Alpl)、およびインスリン様成長因子結合タンパク質1(Igfbp1)¹⁵の相対mRNA発現を18S mRNAレベルに正規化して検出します(図4C-E).PCR条件に従ってください:ステージ1、95°Cで30秒間;ステージ2、95°Cで10秒、60°Cで30秒。サイクルを40回繰り返します。プライマー配列の完全なリストを表1に示します。
5. 適切なソフトウェアで統計解析を行うための^2-ΔΔCT 法およびt検定法を使用してqPCRデータを解析します。この研究では、p < 0.05が統計的に有意であると考えられた。

結果

マウス脱落膜モデルの指標には、子宮の一般的な形態、脱落膜化子宮と非脱落膜化子宮の質量比、子宮内膜の組織学的形態、および脱落膜化マーカー分子の発現レベルが含まれます。油によって誘発されたマウスの人工脱落膜子宮の一般的な形態は、妊娠中の子宮の形態に近い。子宮体は厚くなり、子宮腔は非誘発側よりも小さくなります。誘発された子宮角の体積と重量は、非誘発側のそれよりも有意に高い(図3A、B)。子宮組織のHE染色は、腺が消失し、誘導された角の子宮内膜間質細胞が、細胞境界が不明瞭な大きな丸い細胞質および多核の脱落膜細胞に分化することを示しました。非誘導側切片は、正常な生理学的状態下での子宮内膜組織形態を示す(図4A)。アゾカップリング法の結果は、油誘起側のアルカリホスファターゼ含量が非誘導側よりも有意に高いことを示した(図4B)。qPCRの結果、誘導された角におけるPrl8a2、Alpl、およびIg...

ディスカッション

マウスの脱落膜化は、胚の存在に応じた自発的なプロセスであり、ヒトとは異なります。しかし、ガラスビーズの子宮注入や子宮裂傷などの人工刺激は、胚の代わりに子宮内膜の脱落膜化を誘発できることがわかっています。さらに、研究者らは、ステロイドホルモン、プロスタグランジン、および子宮腔への成長阻害因子の注射など、多くの要因が脱落膜を誘発するか、脱落膜化に関与する可能性があることを発見しました²¹。上記のモデリング方法と比較して、ここで詳述した卵巣摘出術のマウスモデルは、ゴマ油を覚醒剤として使用して、内因的に産生されるエストロゲンおよびプロゲステロンの影響を排除することができる。したがって、経済的で操作が簡単です。

卵巣は、その後の脱落膜化の誘発に影響を与える卵巣組織の残留を防ぐためにきれいに除去する必要があります。このステップは、卵巣によって産生される内因性エストロゲンとプロゲステロンの影響を減らすことを目的としています。卵管の損傷は、ゴマ油を子宮腔に注入するときに子宮を探すための兆候として使用できるため、避ける必要があります。腹部癒着または卵管...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
エストロゲン	シグマ	E2758	ホルモンサプリメント
プロゲステロン	シグマ	P0130	ホルモンサプリメント
ごま油	Sigma	S3547	ホルモンサプリメント
ペントバルビタールナトリウム	大日本住友ファーマ(株)		麻酔
メロキシカム注射	Qilu Animal Health Products Co., Ltd		鎮痛剤アルカリ
性ホプハターゼ染色キット(カプラウ/アゾ結合法)	Solarbio	G1480	アルカリ性ホプハターゼ染色
エオシン	Servicebio	G1005-2	HE 染色
ヘマトキシリン	Servicebio	G1005-1	HE 染色
ChamQユニバーサルSYBR qPCRマスターミックス	Vazyme	Q711-02	qPCR
70%エタノール	ルコン	ZH1120090	消毒
ヨードフォア	Runzekang	RZK-DF	消毒
スロマイシン眼軟膏	州白雲山		マウス眼球保護
4-0縫合	Ethicon	W329	開縫合糸
10%ホルマリン	ユル	L25010118	ティッシュフィックス
最適な切断温度 コンパウンド	さくら	4583	切片
トリゾール試薬	アンビオン	15596018	qPCR