方法論記事

生物学的障壁の浸透促進のための環状細胞透過性ペプチドの構築

DOI：

10.3791/64293

⸱

2022年9月19日

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1Sichuan Engineering Research Center for Biomimetic Synthesis of Natural Drugs, School of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University

この記事について

サマリー

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このプロトコルでは、芳香族架橋を有する環状細胞透過性ペプチドの合成と、生物学的障壁を越えたそれらの透過性の評価について説明します。

要約

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がんは、グローバルヘルスにおける大きな課題となっています。しかし、複雑な腫瘍微小環境は一般に、より深い腫瘍細胞への治療薬のアクセスを制限し、腫瘍の再発につながります。生物学的障壁の限られた浸透を克服するために、優れた膜移行能力を有する細胞透過性ペプチド(CPP)が発見され、様々な貨物を細胞内に送達するための有用な分子輸送体として浮上している。ただし、従来の線形CPPは一般にタンパク質分解安定性の低下を示し、生物学的障壁を越えた透過性が制限されます。したがって、生物学的障壁を貫通し、タンパク質分解安定性を高めることができる新規分子トランスポーターの開発は、生物医学的用途における薬物送達効率を促進するために強く望まれています。我々は以前、芳香族架橋を有する短い環状CPPのパネルを合成し、それらの線状対応物と比較して癌細胞および組織において優れた透過性を示した。ここでは、蛍光標識された環状ポリアルギニンR8ペプチドおよびその直鎖状対応物の合成、ならびにそれらの細胞透過性を調べるための重要なステップについて、簡潔なプロトコルについて説明します。

概要

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過去数十年の間に、薬物送達用の細胞透過性ペプチド(CPP)の開発が急速に進歩してきました。CPPは、神経疾患1,2、心臓病3、糖尿病4、皮膚病5、および癌6,7を含む、生命を脅かすさまざまな疾患の治療のための分子輸送体として広く使用されています。がんは、広範な研究努力にもかかわらず、高い罹患率と死亡率を伴う世界的な健康上の負担であり続けています8。がん治療の深刻な障害は、コンパクトな細胞外マトリックス(ECM)、異常な腫瘍血管系、複数の膜バリア、高い間質液圧(IFP)などの生理学的障壁のために、より深い腫瘍細胞への治療薬のアクセスが制限されていることです9。したがって、生物学的障壁を越えて貨物を輸送する優れた能力を備えた新しいCPPを開発することは、癌治療に不可欠な戦略と考えられています10,11。

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プロトコル

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1.機器の準備

注意: 適切な個人用保護具を備えた操作ヒュームフードですべての手順を実行してください。

  1. 手動ペプチド合成装置をヒュームフードに組み立てます(図1)。三方活栓(材料表を参照)を真空マニホールド(材料表を参照)に置き、窒素(N2)に接続します。未使用の入口には必ずキャップをしてください。
  2. 10 mLポリプロピレンカラム( 材料の表を参照)を3方向活栓に取り付けます。反応混合物または溶媒をゴム製ピペットバルブまたはスクラップ を介して 真空を使用してポリプロピレンカラムから排出します。

2. FITC標識直鎖状R8ペプチド(FITC-R8)およびFITC標識ステープルR8ペプチド(FITC-sR8-4)の合成

注:ペプチドは、標準的なFmocベースの固相ペプチド合成(SPPS)プロトコル25に従って合成されました。4-(2',4'-ジメトキシフェニル-Fmoc-アミノメチル)-フェノキシアセトアミ....

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結果

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このプロトコルでは、直鎖状ポリアルギニンR8をその環状形態に拘束するための合成手順が提示された。SPPSは、簡単な装置を使用して手動で実施されました(図1)。SPPSの詳細な合成プロセスを図2に示します。簡単に説明すると、樹脂を十分に膨潤させ、続いてN α-Fmoc保護基を脱保護した。次いで、N個のα−Fmoc保護アミノ酸を、ペプチドアセンブリが完了するまで樹脂上に固着させた(図2のステップ1〜4)。次いで、切断カクテルによって粗ペプチドを樹脂から切断した(図2の工程5)。FITCを使用してペプチドを標識し、蛍光標識された環状CPPを合成し、生物学的障壁を越えた透過性を追跡しました。続いて、システインのトリチル保護基を樹脂上で選択的に脱保護し、続いて4,4'-ビス(ブロモメチル)ビフェニル架橋でペプチド環化を行いました(

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ディスカッション

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立体配座制約を組み込むことによるペプチドの化学的安定化は、ペプチド26の安定性および細胞透過性を改善するための有効な戦略であることが証明されている。このプロトコルでは、芳香族架橋を有する環状CPPの合成および生物学的障壁を越えたそれらの透過性の評価のための段階的な手順が説明されている。親水性ラクタムまたはトリアゾール架橋22,27と比較して、芳香族架橋(この研究で使用される)の組み込みは、CPPの全体的な疎水性を改善し、それによってそれらの細胞透過性を有意に増加させる。一方、ペプチド環化は、金属触媒を必要とせずにシステインとの置換反応によって容易に達成することができる。このプロトコルでは、CPPの環化は樹脂上で行われました。しかしながら、環化効率は、立体効果のためにペプチドの特定の配列および長さにも依存し、これは二量体副産物28の形成をもたらし得る。このような場合は、積載量の少ない樹脂を使用すると便利です。さらに、溶液相

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開示事項

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著者は開示するものは何もありません。

謝辞

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この研究は、中国自然科学基金会(21708031)、中国ポスドク科学基金会(BX20180264、2018M643519)、および中央大学の基礎研究基金(2682021ZTPY075)の支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1,2-エタンジチオールアラジンK1722093悪臭
2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HATU)HEOWNSA-0443697
4,4'-ビス(ブロモメチル)ビフェニルTCIB1921
4T1細胞ATCC4T1細胞を、10%FBS(Hyclone)を添加したDMEM培地で37°Cで培養しました。5%CO2を含むC加湿インキュベーター。
アセトニトリル アダマス1484971毒性
ジクロロメタンエネルギーW330229皮膚有害
ジエチルエーテルアルドリッチ673811可燃性
ジメチルスルホキシドBeyotimeST038有害
ダルベッコ's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco
Electrospray イオン化質量分析計WatersG2-S Tof
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)BioFroxx1340
ウシ胎児血清 (FBS)HyClone
フローサイトメーターベックマン・コールターCytoFLEX
フルオレセイン イソチオシアネート異性体 (FITC)エネルギーE0801812500
蛍光顕微鏡Carl ZeissAxio Observer 7
Fmoc-Arg(Pbf)-OHHEOWNSF-81070
Fmoc-Cys(Trt)-OHGL BiochemGLS201115-35202
Fmoc-βAla-OHAdamas51341C
HeLa細胞ATCCHeLa細胞を、10% FBS(Hyclone)を添加したDMEMで37°Cで培養しました。5%CO2を含むC加湿インキュベーター。
高速液体クロマトグラフィーAgilentAgilent 1260
高速液体クロマトグラフィーカラムAgilentPoroshell EC-C18 120, 4.6 × 150 mm (細孔径 120 Å, 粒度 4 μm)
凍結乾燥機SP ScientificVir Tis
メタノールAldrich9758毒性
マイクロタイタープレートThermo μドロッププレートN12391
モルホリンHEOWNSM99040刺激性
マルチテクノロジーマイクロプレートリーダーThermoVARIOSKAN LUX
N,N-ジイソプロピルエチルアミンHEOWNSE-81416刺激性
N,N-ジメチルホルムアミドエネルギーB020051皮膚に有害
ポリプレップカラムバイオ・ラッド7321010ポリプロピレンクロマトグラフィーカラム
リンクアミド MBHA樹脂 (0.572 mmol/g)GL BiochemGLS180301-49101
三方活栓バイオ・ラッド7328107
組織培養プレートインサートLABSELECT14211
トリフルオロ酢酸HEOWNST63278腐食性
トリイソプロピルシランHEOWNST-0284475
トリプシンBioFroxx1004
真空マニホールドPromegaA7231
皮膚

参考文献

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  1. Zhang, L., et al. Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(β-amino esters) delivery platform for nerve regeneration. Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).
  2. Park, T. E., et al.

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タグ

FITC HPLC Transwell

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