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書面によるインフォームドコンセントは、各患者から得られました。この研究プロトコルは、リヨンのがん研究センターの制度倫理委員会によって承認されました。
1. 抗体の選択
- IHCまたは免疫蛍光法(IF)でバリデーションされた一次抗体を使用してください。
注:この研究のために選択された一次抗体は、PLAの成功、特に固定組織の成功に不可欠です。IHCまたはIFによって検証された抗体を使用すると、実験の成功率が向上します。実験を行う前に、理想的には、目的のタンパク質の発現が無効化された細胞で制御実験を行い、関与するメチルトランスフェラーゼの酵素活性に特異的な阻害剤を使用することにより、抗体の最適化と特異性が必要です。ここでは、条件は以前に最適化されています10。
2. パラフィン包埋細胞株ペレットの調製
注:サンプルはゲルに包埋され、次にサンプルの脱水およびパラフィン包埋のために自動組織プロセッサに置かれます。
- トリプシン解離を使用して、1.5 mLの微量遠心チューブに細胞ペレットを調製します。
注:細胞を採取するためにこすり落とさないでください。
- 細胞ペレットを1.5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁します。
- 細胞を室温(RT)で200 x gで遠心分離します。PBS上清を吸引します。
- ペレットを1 mLの4%ホルマリンに再懸濁し、チューブを4°Cで3時間保存します。
- 細胞を1X Tris緩衝生理食塩水(TBS)で洗浄します。
注:リン酸塩ベースの溶液はゲルを解重合するため、使用しないでください。
- TBS1 mLを加え、ボルテックスにより30秒間均質化します。200 x g で5分間遠心分離し、上清を除去します。
- 手順2.5から2.7を2回繰り返します。
- 特定のプログラムに従って、自動組織プロセッサに組織を含めます。
ホルマリン 1 h 37 °C
蒸留水 2分 RT
EtOH 70% 40 分 45 °C
EtOH 80% 40 分 45 °C
EtOH 95% 40 分 45 °C
EtOH 100% 40 分 45 °C
EtOH 100% 40 分 45 °C
EtOH 100% 40 分 45 °C
キシレン 40分 45 °C
キシレン 40分 45 °C
キシレン 40分 45 °C
パラフィン 1時間60°C
パラフィン 1時間60°C
パラフィン 1時間30分 60°C
3. 組織固定とスライド調製
- 組織を4%ホルマリンで24時間固定してから、インクルージョンします。
- 組織を含むブロックの厚さ3μmのシリアル切片をミクロトームで切断します。
- スライドをキシレン(10分)2回、100%エタノール(5分)、95%エタノール(5分)、水(5分)で順次インキュベートすることにより、オートステイナーで脱パラフィン化を行います。
- 10 mMクエン酸緩衝液中で、98°Cの水浴を用いて適切なpH(通常は6-9)で40分間、熱誘起エピトープ賦活化を行います。
注:この分析法を成功させるには、2つの抗体が同じpHで作用する必要があります。本明細書で用いる最適pHを確定する前に、いくつかの試験を行った。この研究で使用した抗体は、SDMA抗体とGR抗体です。
- スライドを20分間冷ましてから、1x PBSで20分間洗浄します。
4. IHC実験
注:IHC実験は、自動化と再現性のためにDiscovery XT研究機器(Table of Materials)を使用して行われます。
- ペルオキシダーゼの消息を避けるために、ジアミノベンジジン(DAB)キットに含まれる阻害剤を使用してください。
- スライドを2つの一次抗体とインキュベートし、抗体希釈液で60分間希釈します。
- スライドを二次抗ウサギウマダイコンペルオキシダーゼ(HRP)抗体と16分間、または抗マウス抗体と30分間インキュベートします。
注:IHC検出には、市販のジアミノベンジジン(DAB)キット(材料表)を使用することをお勧めします。
- ヘマトキシリン(100 μL/スライドで8分間)とブルーイング(100 μL/スライドで4分間)をサンプルに塗布して、核を染色します。
- スライドを温かい石鹸水で洗い、オートステイナーで脱水し、封入剤を使用して自動カバースリッパにマウントします。
5. 近接ライゲーションアッセイ反応
注:使用されるすべての試薬は、PLAキット(材料表)に含まれています。1 cm2 の組織に対して40 μLの試薬を使用することをお勧めします。すべてのインキュベーションは、過度の蒸発を防ぐために湿度の高い環境で行う必要があります。サンプルを乾燥させないでください、これはバックグラウンドノイズにつながる可能性があるためです。ジャー内の洗浄には、1x buffer A(in situ wash buffer, Table of Materials)を使用することが推奨されます。攪拌下でサンプルをインキュベートする場合、瓶内には70 mL以上の容量が必要です。サンプルは使用前にRTに保管する必要があります。
- ペルオキシダーゼ焼入れ
- 疎水性ペンを使用して反応領域を区切って、実験中に溶液が過度に蒸発するのを防ぎます。各サンプルの1 cm2 あたり1滴の過酸化水素溶液を加えます。RTで5分間インキュベートします。
注:使用するサンプル/抗体に応じてインキュベーション時間を最適化することをお勧めします。
- ブロッキング
- 緩衝液Aをサンプルに穏やかに滴下し、室温で5分間撹拌しながら緩衝液Aを50rpmで洗浄します。
- 残りのバッファーAを軽くたたいて、ブロッキング溶液(PLAキットに含まれています)の1 cm2 ごとに1滴加えます。37°Cで30分間インキュベートします。
- 一次抗体のインキュベーション
- 2つの一次抗体を抗体希釈液中で適切な濃度で希釈します。
- スライドからブロッキング溶液を取り出し、すぐに一次抗体溶液(PLAキットに含まれています)を添加します。37°Cの湿度チャンバーで1時間インキュベートします。
- PLAプローブインキュベーション
- PLAプローブPLUS(1:5)を抗体希釈液中のPLAプローブマイナス(1:5)で希釈します。
注:40 μLの反応には、8 μLのPLAプローブマイナスストック(5倍)、8 μLのPLAプローブとストック(5倍)、および24 μLの抗体希釈液を使用することをお勧めします。
- バッファーAをサンプルに優しく滴下し、バッファーAを50rpmで室温で5分間洗浄します。
- 残りのバッファーAを取り出し、PLAプローブ溶液(PLAキットに含まれています)をサンプルに塗布します。37°Cで1時間インキュベートします。
- 結紮
- 次の手順の前に、ライゲーションバッファー(PLAキットに含まれています)を解凍します。
- バッファーAをサンプルに優しく滴下し、バッファーAを50rpmで室温で5分間洗浄します。
- 5xライゲーションバッファー(1:5)(PLAキットに含まれています)を高純度の水で希釈します。リガーゼ(1:40)(PLAキットに含まれています)をサンプルに加える直前に追加します。
注:40 μLの反応には、8 μLの5xライゲーションバッファーを31 μLの高純度水に加えることをお勧めします。次に、1 μLのリガーゼを加えます。
- 残りのバッファーAをタップオフし、リガーゼ溶液をサンプルに適用します。37°Cで30分間インキュベートします。
- 増幅
- 次の手順の前に、増幅バッファーを解凍します。
- 緩衝液Aをサンプルに静かに滴下し、緩衝液Aを50 rpmで室温で2分間洗浄します。
- 5倍増幅バッファー(1:5)(PLAキットに含まれています)を高純度水で希釈します。ポリメラーゼ(1:80)(PLAキットに含まれています)を直ちに加え、サンプルに静かに滴下します。
注:40 μLの反応には、8 μLの5xライゲーションバッファーを31.5 μLの高純度水に加えることをお勧めします。次に、0.5 μLのリガーゼを加えます。
- 残りのバッファーAをタップオフし、増幅溶液をサンプルに適用します。37°Cで2時間インキュベートします。
- 検出
- 緩衝液Aをサンプルに静かに滴下し、緩衝液Aを50 rpmで室温で2分間洗浄します。
- 5倍検出明視野バッファー(1:5)(PLAキットに含まれています)を高純度水で希釈します。
注:40 μLの反応には、8 μLの5倍検出バッファーを32 μLの高純度水に加えることをお勧めします。
- 残りのバッファーAをタップオフし、検出溶液をサンプルに適用します。RTで1時間インキュベートします。
- 基板開発
- 緩衝液Aをサンプルに静かに滴下し、緩衝液Aを50 rpmで室温で2分間洗浄します。
- 基質試薬A(1:70)、B(1:100)、C(1:100)、およびD(1:50)(PLAキットに含まれています)を高純度水で希釈することにより、基質溶液を希釈します。
注:40 μLの反応には、0.6 μLの基質A、0.4 μLの基質B、0.4 μLの基質C、および0.8 μLの基質Dを37.8 μLの高純度水に加えることをお勧めします。
- 残りのバッファーAをタップオフし、増幅溶液をサンプルに適用します。室温で10分間インキュベートします。
- 核染色
- 蒸留水をサンプルに静かに滴下し、蒸留水50rpmでRTで2分間洗浄します。
- 残りの蒸留水をタップします。各1 cm2 サンプルに1滴の核染色剤(PLAキットに含まれています)を加え、室温で2分間インキュベートします。
- 水道水でスライドを10分間すすぎ、汚れが成熟し、青色になります。立っている水道水は使用しないでください。
- 脱水
- スライドを96%エタノールを含む溶液で2分間2回インキュベートします。次に、スライドを99.7%エタノールを含む溶液で2分間2回インキュベートします。
- スライドをキシレンで10分間インキュベートします。次に、スライドを新鮮なキシレンに移します。
- スライドの取り付け
- 最小限の量の非水性封入剤を使用し、サンプルの上にカバースリップを塗布して、カバースリップの下に気泡が挟まらないようにします。
- スライドを乾かしてから、明視野顕微鏡で分析します。
6. ローカリゼーションのためのイメージング
- 正立顕微鏡を使用して画像を取得します。
注:この研究では、スライドのイメージングを直立明視野顕微鏡(Table of Materials)で行いました。画像は、同じ条件下で、40倍の倍率で、ランダムに選択された少なくとも10の視野について、自動化された方法で取得されました。条件ごとに最低500個の細胞を解析することをお勧めします。
7. 定量化のための分析
注:サンプルの定量は、ImageJソフトウェア8を使用して実行しました。FIJIは、ImageJと他のプリインストールされたプラグインを含むImageJディストリビューションであり、その後の解析に使用されました9,10。
- ドットの数を確認するには:
- 画像を開きます。
- カラーデコンボリューションを実行します。これを行うには、[Image > Colors]>[Color Deconvolution]をクリックします。
- ファイル名の画像-(color_1)を選択します。
- Find Maxima コマンドを使用して、ドットの数を決定します (Process > Find Maxima)。
- セルの数を確認するには:
- 画像を開きます。
- カラーデコンボリューションを実行します。これを行うには、[Image > Colors > Color Deconvolution]をクリックします。
- ファイル名の画像:-(color_1)を選択します。
- 原子核の最大数を示すしきい値を見つけます。これを行うには、[ Image > Brightness/Contrast > Threshold]をクリックします。
- 「Process (処理)」>「Binary (バイナリ) > Fill Holes」をクリックして穴を埋めます。
- watershedコマンドを使用して、接続されたコンポーネントを別々のコンポーネントに分割します。 [Process (処理)] > [Binary > Watershed (分水界の処理)] をクリックします。
- 粒子を分析して原子核の数を決定するには 、[分析]>[粒子の分析]をクリックします。
