方法論記事

近接ライゲーションアッセイにより、固定組織におけるタンパク質アルギニンメチル化の検出、局在化、定量が可能

DOI：

10.3791/64294

⸱

2022年7月20日

 ,  ,  ,  , 
1Université de Lyon, 2Inserm U1052, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, 3CNRS UMR5286, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, 4Pathology Department, Centre Leon Bérard, 5Plateforme Anatomopathologie Recherche

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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近接ライゲーションアッセイは、修飾アルギニン残基が未知である場合、および/または特異的抗体が利用できない場合に、特定のタンパク質のアルギニンメチル化を局在化および定量するための非常に有用な手法です。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

アルギニンメチル化は、広範囲の生物学的プロセスに関与する重要な翻訳後修飾として浮上しています。組織での研究は、標的のアルギニン残基を認識する特異的抗体がないために、しばしば制限されます。近接ライゲーションアッセイ(PLA)は、もともとタンパク質/タンパク質相互作用を研究するために開発されました。ここでは、グルココルチコイド受容体(GR)に適用したアルギニンメチル化の検出に特化したPLAプロトコルについて詳しく説明します。PRMT5が細胞内のGRをジメチル化することを以前に示したので、乳房腫瘍のGRメチル化を測定するために、PLAと汎対称ジメチル抗体および抗GR抗体を使用しました。私たちは、PLAが、メチル化部位が特定されていない場合でも、標的タンパク質のアルギニンメチル化を測定するための独自のアプローチを提供することを示しています。この技術は、効果的な汎抗体が利用可能な他の翻訳後修飾に拡張できます。そこで、GRを例に、固定組織のアルギニンメチル化を検出するために使用されるPLA技術について詳しく説明します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ(PRMT)によるアルギニンメチル化は、多数の生物学的プロセスに関与する豊富な翻訳後修飾(PTM)です。PRMTは、S-アデノシルメチオニンからアルギニン残基へのメチル基の移動を触媒します。PRMTファミリーは、メチル化の種類によって分類された9つのメンバーで構成されています。すべてのメンバーがモノメチル化(MMA)を行います。タイプ1(PRMT1、2、3、4、6、および8)のPRMTは非対称ジメチル化(ADMA)を触媒しますが、タイプ2(PRMT5および9)は対称ジメチル化(SDMA)を触媒し、タイプ3(PRMT7)はMMA1のみを生成します。多数の基質をメチル化することにより、さまざまなPRMTは、DNA修復、転写調節、免疫応答、RNAプロセシング、シグナル伝達など、さまざまな重要な細胞プロセスを調節します2,3。これは特にステロイドホルモンシグナル伝達に当てはまり、PRMTは受容体自体だけでなく、その調節因子またはヒストンもメチル化することによりステロイド受容体の活性を変化させます2。

アルギニンメチル化は、PRMTの大部分が正常組織と比較して癌で過剰発現することが示されており、その発現はしばしば予後不良と関連していることから、主に癌で研究されています4,5。in vivoでのアルギニンメチル化の検出は、この修飾に関連する細胞機能を理解するために不可欠です。これは従来、メチル化アルギニン残基を認識する特異的抗体を用いて免疫組織化学(IHC)を行うことで達成されていました。ただし、この方法は修飾アルギニン残基の同定に基づいており、使用する抗体の有効性に依存しているため、非常に制限されています。In situ近接ライゲーションアッセイ(PLA)は、固定細胞または組織におけるタンパク質/タンパク質相互作用を研究するために最初に開発されました6。興味深いことに、この技術は、目的の修飾に対するPAN抗体や、標的タンパク質を認識する抗体を使用してPTMを検出するためにも使用できます。私たちのチームは以前、抗ERα抗体とアルギニン260のメチル化部位を特異的に認識する抗体を使用して、この手法をエストロゲン受容体α(ERα)メチル化の研究に適応させました7。注目すべきは、この手法は、メチル化残基が不明な場合でも、特殊なタイプのメチル化を認識する抗体に拡張できることです。実際、いくつかの企業が、MMA、ADMA、またはSDMAを特異的に認識するpan抗体を提供しており、in vivoでのタンパク質メチル化の研究にうまく使用できます。

ここでは、概念実証として、ヒト乳房腫瘍におけるSDMA抗体を用いたGRメチル化の詳細な解析を、実験デザインからデータ解析まで紹介します。

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プロトコル

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書面によるインフォームドコンセントは、各患者から得られました。この研究プロトコルは、リヨンのがん研究センターの制度倫理委員会によって承認されました。

1. 抗体の選択

  1. IHCまたは免疫蛍光法(IF)でバリデーションされた一次抗体を使用してください。
    注:この研究のために選択された一次抗体は、PLAの成功、特に固定組織の成功に不可欠です。IHCまたはIFによって検証された抗体を使用すると、実験の成功率が向上します。実験を行う前に、理想的には、目的のタンパク質の発現が無効化された細胞で制御実験を行い、関与するメチルトランスフェラーゼの酵素活性に特異的な阻害剤を使用することにより、抗体の最適化と特異性が必要です。ここでは、条件は以前に最適化されています10。

2. パラフィン包埋細胞株ペレットの調製

注:サンプルはゲルに包埋され、次にサンプルの脱水およびパラフィン包埋のために自動組織プロセッサに置かれます。

  1. トリプシン解離を使用して、1.5 mLの微量遠心チューブに細胞ペレットを調製します。
    注:細胞を採取するためにこすり落とさないでください。
  2. 細胞ペレットを1.5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁します。
  3. 細胞を室温(RT)で200 x gで遠心分離します。PBS上清を吸引します。
  4. ペレットを1 mLの4%ホルマリンに再懸濁し、チューブを4°Cで3時間保存します。
  5. 細胞を1X Tris緩衝生理食塩水(TBS)で洗浄します。
    注:リン酸塩ベースの溶液はゲルを解重合するため、使用しないでください。
  6. TBS1 mLを加え、ボルテックスにより30秒間均質化します。200 x g で5分間遠心分離し、上清を除去します。
  7. 手順2.5から2.7を2回繰り返します。
  8. 特定のプログラムに従って、自動組織プロセッサに組織を含めます。
    ホルマリン 1 h 37 °C
    蒸留水 2分 RT
    EtOH 70% 40 分 45 °C
    EtOH 80% 40 分 45 °C
    EtOH 95% 40 分 45 °C
    EtOH 100% 40 分 45 °C
    EtOH 100% 40 分 45 °C
    EtOH 100% 40 分 45 °C
    キシレン 40分 45 °C
    キシレン 40分 45 °C
    キシレン 40分 45 °C
    パラフィン 1時間60°C
    パラフィン 1時間60°C
    パラフィン 1時間30分 60°C

3. 組織固定とスライド調製

  1. 組織を4%ホルマリンで24時間固定してから、インクルージョンします。
  2. 組織を含むブロックの厚さ3μmのシリアル切片をミクロトームで切断します。
  3. スライドをキシレン(10分)2回、100%エタノール(5分)、95%エタノール(5分)、水(5分)で順次インキュベートすることにより、オートステイナーで脱パラフィン化を行います。
  4. 10 mMクエン酸緩衝液中で、98°Cの水浴を用いて適切なpH(通常は6-9)で40分間、熱誘起エピトープ賦活化を行います。
    注:この分析法を成功させるには、2つの抗体が同じpHで作用する必要があります。本明細書で用いる最適pHを確定する前に、いくつかの試験を行った。この研究で使用した抗体は、SDMA抗体とGR抗体です。
  5. スライドを20分間冷ましてから、1x PBSで20分間洗浄します。

4. IHC実験

注:IHC実験は、自動化と再現性のためにDiscovery XT研究機器(Table of Materials)を使用して行われます。

  1. ペルオキシダーゼの消息を避けるために、ジアミノベンジジン(DAB)キットに含まれる阻害剤を使用してください。
  2. スライドを2つの一次抗体とインキュベートし、抗体希釈液で60分間希釈します。
  3. スライドを二次抗ウサギウマダイコンペルオキシダーゼ(HRP)抗体と16分間、または抗マウス抗体と30分間インキュベートします。
    注:IHC検出には、市販のジアミノベンジジン(DAB)キット(材料表)を使用することをお勧めします。
  4. ヘマトキシリン(100 μL/スライドで8分間)とブルーイング(100 μL/スライドで4分間)をサンプルに塗布して、核を染色します。
  5. スライドを温かい石鹸水で洗い、オートステイナーで脱水し、封入剤を使用して自動カバースリッパにマウントします。

5. 近接ライゲーションアッセイ反応

注:使用されるすべての試薬は、PLAキット(材料表)に含まれています。1 cm2 の組織に対して40 μLの試薬を使用することをお勧めします。すべてのインキュベーションは、過度の蒸発を防ぐために湿度の高い環境で行う必要があります。サンプルを乾燥させないでください、これはバックグラウンドノイズにつながる可能性があるためです。ジャー内の洗浄には、1x buffer A(in situ wash buffer, Table of Materials)を使用することが推奨されます。攪拌下でサンプルをインキュベートする場合、瓶内には70 mL以上の容量が必要です。サンプルは使用前にRTに保管する必要があります。

  1. ペルオキシダーゼ焼入れ
    1. 疎水性ペンを使用して反応領域を区切って、実験中に溶液が過度に蒸発するのを防ぎます。各サンプルの1 cm2 あたり1滴の過酸化水素溶液を加えます。RTで5分間インキュベートします。
      注:使用するサンプル/抗体に応じてインキュベーション時間を最適化することをお勧めします。
  2. ブロッキング
    1. 緩衝液Aをサンプルに穏やかに滴下し、室温で5分間撹拌しながら緩衝液Aを50rpmで洗浄します。
    2. 残りのバッファーAを軽くたたいて、ブロッキング溶液(PLAキットに含まれています)の1 cm2 ごとに1滴加えます。37°Cで30分間インキュベートします。
  3. 一次抗体のインキュベーション
    1. 2つの一次抗体を抗体希釈液中で適切な濃度で希釈します。
    2. スライドからブロッキング溶液を取り出し、すぐに一次抗体溶液(PLAキットに含まれています)を添加します。37°Cの湿度チャンバーで1時間インキュベートします。
  4. PLAプローブインキュベーション
    1. PLAプローブPLUS(1:5)を抗体希釈液中のPLAプローブマイナス(1:5)で希釈します。
      注:40 μLの反応には、8 μLのPLAプローブマイナスストック(5倍)、8 μLのPLAプローブとストック(5倍)、および24 μLの抗体希釈液を使用することをお勧めします。
    2. バッファーAをサンプルに優しく滴下し、バッファーAを50rpmで室温で5分間洗浄します。
    3. 残りのバッファーAを取り出し、PLAプローブ溶液(PLAキットに含まれています)をサンプルに塗布します。37°Cで1時間インキュベートします。
  5. 結紮
    1. 次の手順の前に、ライゲーションバッファー(PLAキットに含まれています)を解凍します。
    2. バッファーAをサンプルに優しく滴下し、バッファーAを50rpmで室温で5分間洗浄します。
    3. 5xライゲーションバッファー(1:5)(PLAキットに含まれています)を高純度の水で希釈します。リガーゼ(1:40)(PLAキットに含まれています)をサンプルに加える直前に追加します。
      注:40 μLの反応には、8 μLの5xライゲーションバッファーを31 μLの高純度水に加えることをお勧めします。次に、1 μLのリガーゼを加えます。
    4. 残りのバッファーAをタップオフし、リガーゼ溶液をサンプルに適用します。37°Cで30分間インキュベートします。
  6. 増幅
    1. 次の手順の前に、増幅バッファーを解凍します。
    2. 緩衝液Aをサンプルに静かに滴下し、緩衝液Aを50 rpmで室温で2分間洗浄します。
    3. 5倍増幅バッファー(1:5)(PLAキットに含まれています)を高純度水で希釈します。ポリメラーゼ(1:80)(PLAキットに含まれています)を直ちに加え、サンプルに静かに滴下します。
      注:40 μLの反応には、8 μLの5xライゲーションバッファーを31.5 μLの高純度水に加えることをお勧めします。次に、0.5 μLのリガーゼを加えます。
    4. 残りのバッファーAをタップオフし、増幅溶液をサンプルに適用します。37°Cで2時間インキュベートします。
  7. 検出
    1. 緩衝液Aをサンプルに静かに滴下し、緩衝液Aを50 rpmで室温で2分間洗浄します。
    2. 5倍検出明視野バッファー(1:5)(PLAキットに含まれています)を高純度水で希釈します。
      注:40 μLの反応には、8 μLの5倍検出バッファーを32 μLの高純度水に加えることをお勧めします。
    3. 残りのバッファーAをタップオフし、検出溶液をサンプルに適用します。RTで1時間インキュベートします。
  8. 基板開発
    1. 緩衝液Aをサンプルに静かに滴下し、緩衝液Aを50 rpmで室温で2分間洗浄します。
    2. 基質試薬A(1:70)、B(1:100)、C(1:100)、およびD(1:50)(PLAキットに含まれています)を高純度水で希釈することにより、基質溶液を希釈します。
      注:40 μLの反応には、0.6 μLの基質A、0.4 μLの基質B、0.4 μLの基質C、および0.8 μLの基質Dを37.8 μLの高純度水に加えることをお勧めします。
    3. 残りのバッファーAをタップオフし、増幅溶液をサンプルに適用します。室温で10分間インキュベートします。
  9. 核染色
    1. 蒸留水をサンプルに静かに滴下し、蒸留水50rpmでRTで2分間洗浄します。
    2. 残りの蒸留水をタップします。各1 cm2 サンプルに1滴の核染色剤(PLAキットに含まれています)を加え、室温で2分間インキュベートします。
    3. 水道水でスライドを10分間すすぎ、汚れが成熟し、青色になります。立っている水道水は使用しないでください。
  10. 脱水
    1. スライドを96%エタノールを含む溶液で2分間2回インキュベートします。次に、スライドを99.7%エタノールを含む溶液で2分間2回インキュベートします。
    2. スライドをキシレンで10分間インキュベートします。次に、スライドを新鮮なキシレンに移します。
  11. スライドの取り付け
    1. 最小限の量の非水性封入剤を使用し、サンプルの上にカバースリップを塗布して、カバースリップの下に気泡が挟まらないようにします。
    2. スライドを乾かしてから、明視野顕微鏡で分析します。

6. ローカリゼーションのためのイメージング

  1. 正立顕微鏡を使用して画像を取得します。
    注:この研究では、スライドのイメージングを直立明視野顕微鏡(Table of Materials)で行いました。画像は、同じ条件下で、40倍の倍率で、ランダムに選択された少なくとも10の視野について、自動化された方法で取得されました。条件ごとに最低500個の細胞を解析することをお勧めします。

7. 定量化のための分析

注:サンプルの定量は、ImageJソフトウェア8を使用して実行しました。FIJIは、ImageJと他のプリインストールされたプラグインを含むImageJディストリビューションであり、その後の解析に使用されました9,10。

  1. ドットの数を確認するには:
    1. 画像を開きます。
    2. カラーデコンボリューションを実行します。これを行うには、[Image > Colors]>[Color Deconvolution]をクリックします。
    3. ファイル名の画像-(color_1)を選択します。
    4. Find Maxima コマンドを使用して、ドットの数を決定します (Process > Find Maxima)。
  2. セルの数を確認するには:
    1. 画像を開きます。
    2. カラーデコンボリューションを実行します。これを行うには、[Image > Colors > Color Deconvolution]をクリックします。
    3. ファイル名の画像:-(color_1)を選択します。
    4. 原子核の最大数を示すしきい値を見つけます。これを行うには、[ Image > Brightness/Contrast > Threshold]をクリックします。
    5. 「Process (処理)」>「Binary (バイナリ) > Fill Holes」をクリックして穴を埋めます。
    6. watershedコマンドを使用して、接続されたコンポーネントを別々のコンポーネントに分割します。 [Process (処理)] > [Binary > Watershed (分水界の処理)] をクリックします。
    7. 粒子を分析して原子核の数を決定するには 、[分析]>[粒子の分析]をクリックします。

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結果

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上記の手順を用いて、目的のタンパク質のメチル化を検出し、定量することが可能です。ここでは、PRMT5によるGRのメチル化の例を示します。PLAの抗体および実験条件は、以前に細胞10に適用されていた。簡単に説明すると、GRおよびSDMAを標的とする一次抗体は、相補的オリゴヌクレオチドと結合した近接プローブによって認識されます。次に、環状DNAプローブのハイブリダイゼーションは、タンパク質が近接しているときに発生します。このDNAのその後の増幅は、明視野顕微鏡下でHRPによって視覚化されます(図1)。IHCによるGRおよびPRMT5の検出に理想的な条件は、最初にいくつかの乳房腫瘍で分析されました(図2)。GRメチル化を検出するために、GR(マウス)とpan SDMA(ウサギ)を認識する異なる動物種で産生された一次抗体を使用しました。その後のPLA実験を前述のように実施し、画像を取得しました(図3A)。定量化を行い、I...

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ディスカッション

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アルギニンメチル化は、他のPTMと同様に、タンパク質機能の微細な調節に寄与します。ただし、主にツールが不足しているため、これらの変更を評価するのが難しいため、その影響は過小評価されています。これは、アルギニンのメチル化を測定する唯一の方法が、目的のタンパク質のメチル化残基を認識する特異的抗体を保有することである in vivoでのメチル化研究に特に当てはまります。メチル化アルギニン残基が既知である必要があり、修飾のための特異的な有効な抗体がIHCアプリケーションで利用可能でなければならないため、これは明らかに制限を構成しますが、これはまれなケースです。

ここでは、さまざまなタイプのメチル化(MMA、SDMA、ADMA)に対して産生されたパンメチル抗体を使用して、これらの障害を回避する方法を紹介します。我々は以前、パンメチル抗体を目的のタンパク質を認識する抗体にカップリングさせることが、固定細胞10 だけでなく固定組織におけるメチル化の測定にも有効であ...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、利益相反がないことを宣言します

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

原稿の校正をしてくださったB.マンシップに感謝いたします。Laura Francols氏、Clémentine Le Nevé、Research pathology platform(CRCL)の技術的な支援に感謝します。図1はセルヴィエ・メディカル・アートを使用して作成しました。この研究は、Ligue Inter-régionale contre le CancerとAssociation:「Le Cancer du sein, parlons-en」の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
接着スライド TOMO 90°, x100VWR631-1239
抗 GR 抗体 (マウス)サンタクルスsc393232
抗 GR 抗体 (マウス)サンタクルスsc393232
抗 PRMT5 抗体 (ウサギ)メルク07-405
抗 SDMA 抗体 (ウサギ)CST13222
自動化 d'インクルージョンライカASP 6025パラフィン浸潤とブロック調製
オートステイナーXLライカST5010オートステイナー
カセット Q パス マクロスター III  x1500VWR720-2233
CC1ロシュ5279801001
クエン酸バッファー pH 6 10x, 100 mLMMFF/T0050
Dako 抗体希釈剤Dako AgilentS202230-2抗体希釈剤
Discovery ChromoMap Diaminobenzidine (DAB) kitRoche760-159Diaminobenzidine (DAB) kit
Discovery WashRoche7311079001
Duolink insitu PLAプローブ抗マウスマイナスSigma-AldrichDUO92004PLA キット(プローブ抗ウサギマイナス)
Duolink insitu 検出試薬明視野Sigma-AldrichDUO92012PLA キット(in situ検出試薬)
Duolink insitu PLAプローブ抗ウサギプラスSigma-AldrichDUO92002PLA キット(プローブ抗ウサギプラス)
Duolink insitu 洗浄バッファー明視野Sigma-AldrichDUO82047PLA  キット (in situ 洗浄バッファー)
エタノール 96% VOL TECHNISOLV, 5 LVWR83804.360
エタノール絶対 ≥99.8%、AnalaR NORMAPUR ACS、 5 LVWR20821.365
EZ Prep 10xRoche5279771001
Formol、すぐに使用、5 LMMFF/40877-36ホルマリン
全自動ガラス カバースリッパーライカCV5030自動ガラス カバースリッパー
ガラス カバースリップ 24 x 40ダッチャー100037
ヘマトキシリンベンタナ760-2021
IHC機器ロシュディスカバリー XTIHC
LCSロシュ5264839001
ミクロトームサーモサイエンティフィックマイクロム HM340Eブロックを含む組織の切断
封入媒体 PertexHistolab00801-FR
免疫染色用PAPペンシグマ-アルドリッチZ672548-1EA
パラフィンワックス TEK III、4 x 2、5 kgSakura4511
パスツール使い捨てピペットフィッシャーサイエンティフィック12583237
PBS バッファー 10x、100 mLMMFF/T0020
反応バッファー 10xロシュ5353955001
リボウォッシュ 10xロシュ5266262001
リボCC1ロシュ
二次抗体 抗マウスアブカムab133469
二次抗体 OmniMap 抗ウサギ HRPロシュ760-4311
組織包埋センターMMFEC 350
キシレン (異性体の混合物) ≥98.5%、AnalaR NORMAPUR ACS、5 LVWR28975.360
Zeiss Axio Imager M2顕微鏡直立明視野顕微鏡
の自動化 5266297001

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: The coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  2. Malbeteau, L., et al. How protein methylation regulates steroid receptor function. Endocrine Reviews. 43 (1), 160-197 (2021).
  3. Guccione, E., Richard, S. The regulation, functions and clinical relevance of arginine methylation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).
  4. Poulard, C., Corbo, L., Le Romancer, M. Protein arginine methylation/demethylation and cancer. Oncotarget. 7 (41), 67532-67550 (2016).
  5. Hwang, J. W., et al. Protein arginine methyltransferases: promising targets for cancer therapy. Experimental & Molecular Medicine. 53 (5), 788-808 (2021).
  6. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  7. Poulard, C., et al. Activation of rapid oestrogen signalling in aggressive human breast cancers. EMBO Molecular Medicine. 4 (11), 1200-1213 (2012).
  8. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  9. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  10. Poulard, C., Jacquemetton, J., Pham, T. H., Le Romancer, M. Using proximity ligation assay to detect protein arginine methylation. Methods. 175, 66-71 (2020).

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