方法論記事

神経炎症と神経毒性を評価するためのリポ多糖の仔魚への脳室マイクロインジェクション

DOI：

10.3791/64313

⸱

2022年8月23日

 , 
1State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine and Institute of Chinese Medical Sciences, University of Macau, Avenida da Universidade, 2Department of Pharmaceutical Sciences, Faculty of Health Sciences, University of Macau, Avenida da Universidade

この記事について

サマリー

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このプロトコルは、ゼブラフィッシュ幼虫モデルの脳室領域へのリポ多糖のマイクロインジェクションを実証し、結果として生じる神経炎症反応と神経毒性を研究します。

要約

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神経炎症は、神経変性疾患を含むさまざまな神経障害の重要なプレーヤーです。したがって、神経変性における神経炎症の役割を理解するために、代替の in vivo 神経炎症モデルを研究開発することは非常に興味深いことです。この研究では、リポ多糖(LPS)の心室マイクロインジェクションによって免疫応答と神経毒性を誘導する神経炎症の幼生ゼブラフィッシュモデルが開発され、検証されました。トランスジェニックゼブラフィッシュ系統elavl3:mCherry、ETvmat2:GFP、およびmpo:EGFPは、蛍光強度分析と統合された蛍光ライブイメージングによる脳ニューロン生存率のリアルタイム定量に使用されました。ゼブラフィッシュ幼虫の自発運動行動は、ビデオ追跡レコーダーを使用して自動的に記録されました。一酸化窒素(NO)の含有量、およびインターロイキン-6(IL-6)、インターロイキン-1β(IL-1β)、およびヒト腫瘍壊死因子α(TNF-α)を含む炎症性サイトカインのmRNA発現量を調べ、ゼブラフィッシュ幼生の頭部におけるLPS誘発免疫応答を評価しました。LPSの脳室注射後24時間で、ゼブラフィッシュの幼虫でニューロンの喪失と移動障害が観察されました。さらに、LPS誘発性神経炎症は、受精後6日目(dpf)ゼブラフィッシュ幼虫の頭部におけるNO放出およびIL-6、IL-1β、およびTNF-αのmRNA発現を増加させ、ゼブラフィッシュ脳における好中球の動員をもたらした。この研究では、ゼブラフィッシュにLPSを5 dpfで2.5〜5 mg / mLの濃度で注射することが、この薬理学的神経炎症アッセイの最適条件として決定されました。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの幼虫にLPSを介した神経炎症と神経毒性を誘導するためのLPSの脳室マイクロインジェクションのための新しい、迅速で効率的な方法論を提示し、神経炎症の研究に有用であり、ハイスループット のin vivo 薬物スクリーニングアッセイとしても使用できる可能性があります。

概要

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神経炎症は、中枢神経系(CNS)のいくつかの神経変性疾患の病因に関与する重要な抗神経原性因子として説明されています1。病理学的侮辱に続いて、神経炎症は、神経新生の阻害および神経細胞死の誘導を含む様々な有害な結果をもたらす可能性がある2,3。炎症誘導に対する応答の根底にあるプロセスでは、複数の炎症性サイトカイン(TNF-α、IL-1β、IL-6など)が細胞外空間に分泌され、ニューロン死と神経新生の抑制に重要なコンポーネントとして機能します4,5,6。

炎症メディエーター(IL-1β、L-アルギニン、エンドトキシンなど)を脳にマイクロインジェクションすると、神経細胞の減少と神経炎症を引き起こす可能性があります7,8,9。グラム陰性菌の細胞壁に存在する病原性エンドトキシンであるリポ多糖(LPS、図1

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プロトコル

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AB野生型ゼブラフィッシュおよびトランスジェニックゼブラフィッシュ系統elavl3:mCherry、ETvmat2:GFP、およびmpo:EGFPは、中国医学研究所(ICMS)から入手しました。動物実験の倫理的承認(UMARE-030-2017)は、マカオ大学の動物研究倫理委員会によって付与され、プロトコルは施設の動物管理ガイドラインに従います。

1.ゼブラフィッシュの胚と幼虫の飼育

  1. ゼブラフィッシュ胚(交配あたり200〜300胚)を、以前に報告されたように自然ペアワイズ交配によって生成します28。
  2. 34.8 gのNaCl、1.6 gのKCl、5.8 gのCaCl2·2H 2 O、および9.78 gのMgCl 2·6H 2 OをddH 2 Oに溶解して、卵水(E3)培地ストック(60×)を最終容量2 Lに調製し、NaOHおよびHClを使用してpHを7.2に調整します。E3培地(1×)の使用濃度を調製するには、ストックをddH2Oで60倍に希釈し、使用しないときは28.5°Cで保管します。
  3. プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、ゼブラフィッシュの胚をE3培地を含む皿に移します。インキュベーター内で....

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結果

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ここで説明するワークフローは、ゼブラフィッシュ幼虫にLPSを介した神経炎症と神経毒性を誘導するための新しい、迅速で効率的な方法論を提示します。この記載されたプロトコルでは、5 dpfゼブラフィッシュをマイクロインジェクター(図2A-C)を使用して脳室にLPS(図1)を注射しました。脳室部位への注射の成功は、1%エバンスブルー染色を用いて検証された(図2D)。ゼブラフィッシュの頭部を注射器(図2E)を用いて眼と体から分離し、ゼブラフィッシュの体内での炎症性サイトカイン発現と一酸化窒素放出が脳内の神経炎症と神経毒性の決定に及ぼす影響を排除しました。

同じ量のPBS(LPSとして)を、偽操作コントロールとしてゼブラフィッシュ脳室領域に注入した。特に縫線核の前群(Ra)(図3A-C)、脳.......

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ディスカッション

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ますます多くの疫学的および実験的データが、神経変性疾患の可能性のある危険因子として慢性細菌およびウイルス感染に関係しています36。感染は炎症過程の活性化と宿主免疫応答を引き起こします37。応答が防御機構として作用したとしても、過剰活性化された炎症は神経新生に有害であり、炎症環境は新生児ニューロンの生存を可能にしない38。その結果、宿主の神経機能と生存能力に損傷を与えます。研究は、炎症が神経変性の病態生理学において重要な役割を果たすことを示しています39。

頻繁に研究される病原性エンドトキシンとして、LPSは神経新生と神経変性の阻害に関与しています。炎症過程のLPS活性化は、部分的にはNO、TNF-α、IL-6、およびIL-1β40の産生を通じて、神経新生を著しく損ないます。LPSが行動障害とニューロンの喪失を引き起こし、神経変性げっ歯類モデルに中.......

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開示事項

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著者らは、競合する金銭的利益を宣言していない。

謝辞

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この研究は、マカオ特別行政区の科学技術開発基金(FDCT)からの助成金によって支援されました(文献番号。FDCT0058/2019/A1および0016/2019/AKP)、マカオ大学研究委員会(MYRG2020-00183-ICMSおよびCPG2022-00023-ICMS)、および中国国家自然科学基金会(第81803398号)。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アガローSigma-AldrichA6361
アガロース、低ゲル化温度Sigma-AldrichA9414
Drummond Nanoject III プログラマブルナノリットルインジェクターDrummond Scientific3-000-207
蛍光実体顕微鏡ライカM205 FA
GraphPad プリズムソフトウェアGraphPad SoftwareVer.7.04
大腸菌由来のリポ多糖類 O111:B4Sigma-AldrichL3024
手動マイクロマニピュレーターWorld Precision InstrumentsM3301
鉱物油Sigma-AldrichM5904
Mx3005P qPCRシステムAgilent TechnologiesMx3005P
Nanovue plus分光光度計Biochrom80-2140-46
亜硝酸塩濃度アッセイキットBeyotime BiotechnologyS0021M
リン酸緩衝生理食塩水Sigma-AldrichP4417
プログラマブル水平ピペットプーラーワールド精密機器PMP-102
PTU (N-フェニルチオ尿素)Sigma-AldrichP7629
ランダムプライマーTakara3802
SuperScript II Reverse TranscriptaseInvitrogen18064014
SYBR Premix Ex Taq II kitAccurate BiologyAG11701
第 3 世代Tgrinder TiangenOSE-Y30
薄肉ガラス毛細血管 (4") フィラメント付き、外径 1.5 mmWorld Precision InstrumentsTW150F-4
トリカイン(3-アミノ安息香酸エチルエステル)Sigma-AldrichA-5040
TRNzol Universal reagentTiangenDP424
ブラフィッシュ追跡ボックスViewPoint 行動技術
ス ゼ

参考文献

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  1. Xanthos, D. N., Sandkuhler, J. Neurogenic neuroinflammation: inflammatory CNS reactions in response to neuronal activity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (1), 43-53 (2014).
  2. Fan, L. W., Pang, Y.

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