方法論記事

上腸間膜動脈閉塞による腸虚血再灌流傷害のげっ歯類モデル

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DOI:

10.3791/64314

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2023年10月20日

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1Animal Surgery and Resources Core, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2College of Veterinary Medicine, Mississippi State University, 3Division of Veterinary Resources, Office of Research Services, National Institutes of Health

この記事について

サマリー

げっ歯類の腸虚血再灌流障害(IRI)の広く使用されている外科モデルを生成する方法について説明します。この手順では、上腸間膜動脈の閉塞とそれに続く血流の回復が含まれます。このモデルは、獣医学とヒト医学の両方において、腸管IRIの閉塞性の原因を調査する研究に有用です。

要約

腸虚血再灌流障害(IRI)は、獣医学と人間医学の両方において無数の状態に関連しています。胃拡張軸捻転(GDV)、腸間膜捻転、疝痛などの腸内IRI状態は、犬や馬などの動物で観察されます。血流が最初に中断されると、組織が虚血状態になります。生組織を回収するために必要ですが、その後の再灌流はさらなる損傷を引き起こす可能性があります。IRIの主なメカニズムは、再灌流および損傷組織への酸素の再導入時のフリーラジカル形成ですが、他にも多くの成分が関与しています。結果として生じる局所的および全身的影響は、しばしば予後不良をもたらす。

腸管IRIは、過去50年以上にわたって広範な研究の対象となってきました。上腸間膜動脈(SMA)の基部を一時的に結紮する in vivo げっ歯類モデルは、現在、腸内IRIの研究に使用される最も一般的な方法です。ここでは、小腸の一貫した組織病理学によって実証されているように、再現性のある損傷をもたらす21%O2 医療用空気中のイソフルラン麻酔を利用した腸IRIのモデルについて説明します。結腸、肝臓、腎臓の組織損傷も評価されました。

概要

虚血再灌流障害(IRI)は、どの臓器でも発生する可能性があり、2つの連続した構成要素が関与します。血流が最初に停止すると、罹患した組織が虚血性になり、その後の再灌流がさらなる細胞損傷を誘発します。再灌流による損傷は、虚血によって引き起こされる損傷をしばしば上回ります1。IRIの病態生理学には複雑な事象のカスケードが関与しており、その中でも最も注目すべきは、再灌流中に発生する酸素の再導入時のフリーラジカル形成である2。炎症細胞とサイトカインの活性化も役割を果たします2。腸管IRIの場合、内皮損傷後の細菌の血流への移行は、全身性炎症反応症候群につながる可能性があります2。IRIによる損傷が十分に深刻な場合、結果として生じる全身への影響は多臓器不全につながる可能性があります3。

腸内IRIの症例は、高い罹患率と死亡率に関連しています4,5,6。腸IRIは、獣医学と人間医学の両方において、多くの病理学的状態および外科的処置に関連しています。獣医学では、動物は胃拡張軸捻転(GDV)、腸間膜捻転、疝痛7,8などの腸IRI状態に特にかかりやすいです。ヒトでは、腹部大動脈瘤手術、絞扼ヘルニア、急性腸間膜虚血、軸捻転、外傷、ショック、新生児壊死性腸炎、小腸切除または移植において、IRIは主要かつ頻繁に発生する問題です9。

腸内IRIのほとんどのin vivoげっ歯類研究には、小腸の大部分と大腸の近位部に血液を供給する腹部大動脈の枝である上腸間膜動脈(SMA)の基部の閉塞が含まれます10,11,12。このモデルが広く使用されており、比較的単純であるにもかかわらず、21% O2 医療用空気中の吸入麻酔を使用する詳細なプロトコルは公開されていません。標準的なプロトコルがないため、手順に不慣れな研究者にとっては困難であり、研究間の一貫性が妨げられます。8〜14週齢の雌雄のスイスウェブスターマウスで腸内IRIの外科的モデルを実施するために必要な手順を示します。腸IRIのこのモデルは、一貫した組織病理学によって実証されているように、再現性のある損傷をもたらします。

プロトコル

ここに記載されている手順は、米国国立衛生研究所の国立心肺血液研究所の動物ケアおよび使用委員会によって承認されており、実験動物の人道的なケアと使用に関する公衆衛生サービスポリシー、動物福祉法、および実験動物のケアと使用に関するガイドに概説されているポリシーに準拠しています。

1.手術のセットアップ

  1. 無菌手順に従います。マスク、ヘアカバー、清潔なジャンプスーツ/白衣/手術用スクラブを着用してください。
  2. 手術器具( 材料表を参照)、温かい生理食塩水、綿棒、ガーゼ、手術用ステープル、手術用ドレープ、手袋などの滅菌材料を準備します。また、滅菌する必要のないサージカルテープを入手してください。オートクレーブまたはエチレンオキシド滅菌技術のいずれかで材料を滅菌します。
  3. 手術部位に温熱した循環水ブランケットを置き、滅菌タオルまたはドレープで覆います。
  4. 精密なイソフルラン気化器、加圧医療用空気(21%O2)、およびマウスが外科的麻酔を行うために設計されたノーズコーンを備えたベイン非再呼吸回路を使用します。

2.動物の調製

  1. 2%〜4%のイソフルランと21%O2 の医療用空気をチャンバー容積1リットルあたり0.5 L / minの速度で送達することにより、誘導チャンバー内でマウスを麻酔します。
    注:この特定のモデルでは、血液をO2で飽和させるとIRIに干渉する可能性があるため、100%O2を超える21%O2の医療用空気を使用することが好ましい。
  2. マウスをチャンバーから取り出し、手術部位から離れた清潔な面に移動します。1.5%イソフルランと21%O2の 医療用空気を供給するノーズコーンを取り付けます。
  3. 1 mg / kgのブプレノルフィンを背頸胸部に皮下注射します。.
  4. 閉塞期間中の血栓形成を防ぐために、200〜600 IU / kgのヘパリンを腹腔内に注射します。.
  5. 角膜の損傷を防ぐために眼科用軟膏を目に塗ります。
  6. バリカンを使用して腹側腹部から毛を取り除きます。
  7. 手術エリアの温水ブランケットにマウスを移動します。ここでも、1.5%のイソフルランと21%のO2 の医療用空気を供給するノーズコーンを取り付けて、麻酔の外科的平面を実現します。
  8. マウスを背臥位に置き、手足をサージカルテープでテーブルに固定します。
  9. げっ歯類専用の体温計を使用して、動物の体温を直腸で監視します。手術中は、体温を36.5°C±0.5°Cに保ちます。
  10. クロルヘキシジンスクラブまたはポビドンヨードスクラブのいずれかに浸した滅菌ガーゼを使用して腹腹部を消毒し、続いて70%アルコールを消毒します。このシーケンスを3回繰り返し、スクラブとアルコールを交互に繰り返します。毎回新しいスクラブとアルコールガーゼのセットを使用する必要があります。
    1. スクラブとアルコールを円を描くように塗布し、手術部位の中央にある小さな円から始めて、円のサイズを大きくして端に向かって徐々に作業します。手術部位の端に達したら、ガーゼを捨てます。端から中心に向かって後ろ向きにこすらないでください。
  11. つま先をつまむテスト(足の反射)を実行して、動物が完全に麻酔されていることを確認します。
  12. 滅菌手袋を着用してください。手術部位を無菌的にドレープします。

3.手術と虚血

  1. #15メスの刃を使用して皮膚に3〜5cmの腹側正中線腹部切開を行い、下にある筋膜から切り離して解剖し、横方向に反射させます。マイクロ解剖ハサミまたはバネ仕掛けのマイクロハサミを使用して、アルバ線に沿って腹壁を切開し続け、リトラクターを所定の位置に配置します。
  2. 温かい滅菌生理食塩水で湿らせた滅菌ガーゼパッドを手術部位に置きます。
  3. 小腸を腹腔から取り出し、頭蓋と動物の左側にひっくり返し、湿らせたパッドの上に置きます。乾燥を防ぐために、別の湿らせたガーゼパッドを組織の上に置きます。定期的にガーゼに温かい滅菌生理食塩水を滴下して、組織を湿らせます。
  4. 下大静脈の腹側、腹側腹側、腹側動脈、頭蓋側にあるSMAを腎動脈に分離します。
    注: 図1 は、手術中にSMAが分離される場所を示しています。SMAは通常、下大静脈の腹側にあり、右に向かって伸びています。手術中に腸が外在化して左に反転すると、SMAは下大静脈の左側にあります。
  5. 腹部大動脈から分岐するSMAの基部に非外傷性微小血管クリップを配置し、クリップが上腸間膜静脈を閉塞しないようにします。
  6. ピンクから淡白への色の変化と腸間膜脈動の喪失に注意して、小腸の虚血を確認します。
  7. 虚血期間中、内臓を腹腔内の元の位置に戻します。リトラクターを取り外し、切開部を湿らせたガーゼで覆います。乾燥を防ぎ、体温を維持するために、ガーゼに定期的に温かい滅菌生理食塩水を追加します。
  8. 虚血が45分間続いた後(その始まりはクリップの最初の適用によってマークされます)、閉塞クリップを取り外します。腸間膜の脈動と紅潮した色を観察することにより、血流の回復を確認します。
  9. 適切な水分補給を維持するために、最終的な閉鎖の直前に温かい滅菌生理食塩水を腹腔内に塗布します。.
  10. 6-0ポリグラクチン910縫合糸で腹筋を閉じます。痛みを和らげるために、筋肉切開線に沿ってブピバカイン(最大2 mg / kg)を投与します。.外科用ステープルまたは創傷クリップで皮膚を閉じます。

4.回復と再灌流

  1. マウスを、循環水ブランケット、ハンドウォーマー、またはその他の適切な熱源の保温室またはケージに戻します。チャンバー容積1リットルあたり0.5 L/minの流量で21%O2 を供給します。ここでマウスを90分間回復させます。5〜10分ごとにマウスを監視して、猫背の姿勢、目を細める、動きを嫌がるなどの痛みや苦痛の兆候がないか確認します。

5.安楽死と採血

  1. 90分間の回復期間の終わりに、マウスを誘導チャンバーに戻し、チャンバー容積の0.5 L / minの速度で21%O2 を含む2%〜4%イソフルランを送達して、完全な麻酔を再誘発します。.
  2. 動物を手術部位に戻し、21%O2 で2%〜4%のイソフルランを投与するノーズコーンを取り付けて、深い麻酔を実現します。
    注:CO2 は、虚血性損傷または組織分析物13を妨害する可能性のある生理学的変化を誘発するため、この手順の安楽死の適切な方法ではありません。
  3. 腹側正中線切開を再開し、23Gの針と注射器を使用して腹部大静脈からできるだけ多くの血液を採取することにより、終末出血を行います。0.3〜0.5 mLの血液を採取することを期待してください(IRIを受けたマウスでは少なく、偽開腹術を受けたマウスではより多くなります)。
    注:終末出血の目的は、人道的な安楽死を支援し、将来の検査(血清化学、PCR、ELISAなど)のために血液を採取して保存することです。
  4. 採血後、腹部大動脈を切断して完全な放血を可能にします。
  5. 安楽死を成功させるための二次的な手段として、子宮頸部脱臼または開胸術のいずれかを実行します。

6. 組織学のためのティッシュ処理

  1. 安楽死後、目的の組織を採取します。自己消化は死の直後に始まるため、組織処理が迅速に行われることを確認してください14,15。
    1. 腸:小腸と大腸の全長を収集します。盲腸を捨てます。
    2. 肝臓:左外側葉、左中央葉、右中央葉を採取します。
    3. 腎臓:両方の腎臓を収集します。慣例により、左の腎臓は縦方向に切断され、右側の腎臓は剖検時に断面として切断されます。
      注:結腸、肝臓、腎臓は、多臓器不全またはIRIの他の全身性影響を評価するために使用できます。小腸は、一次損傷を評価するために使用されます。肝葉と腎臓の個々のセクションを追跡する必要はなく、各臓器は1つのユニットとして分析され、スコアリングされます。ただし、腸セグメントは別々に保管し、個別にラベル付けしてスコアリングする必要があります。
  2. 腸を十二指腸、空腸、回腸、結腸の4つのセクションに分けます。3つの小腸セグメントの長さが等しいことを確認してください。これを行うには、小腸を「Z」字型に折りたたんで、上の線が十二指腸、真ん中の線が空腸、下の線が回腸です。近位端と遠位端を追跡することが重要です。
  3. 20 Gの血管カテーテルを装着した10 mLのシリンジを使用して、腸セグメントの内腔を生理食塩水で洗い流します。
  4. 切片を作成する前に、管腔側を上にして各腸セグメントを平らに置きます。27 Gの針を装着した3 mLのシリンジを使用し、10%緩衝ホルマリンを滴下して粘膜の全長をコーティングします。次に、各腸セグメントを個別に転がし、ラベル付けされた別々の組織カセットに入れます。
    1. 転がすには、内腔側を上にして各セグメントを平らに置き、つまようじの周りを円周に沿って転がします。近位部は、ロールの内側部分を形成する必要があります。ルーメンは内側/中央を向いている必要があります。絨毛を圧迫しないように、できるだけ穏やかに転がすようにしてください。
    2. 巻くと、腸はスイスロールのように見えるはずです。スイスロールスパイラルを上向きにしてカセット内に置きます。
  5. 10%緩衝ホルマリンで満たされたラベル付きバイアルに組織を入れ、室温で固定します。過度な固定は、過小な固定よりも優れています。バイアルは大きく、ホルマリンが豊富で、組織の少なくとも20倍の固定剤が必要です。
    1. 腸:4つのカセットを一緒に標本カップに入れます。24〜48時間固定します。
    2. 肝臓:肝臓葉を50mLのコニカルチューブに入れます。24〜48時間固定します。
    3. 腎臓:腎臓を50mLのコニカルチューブに入れます。48〜72時間固定します。
      注意: トリミングされていない腎臓は、トリミングされた腎臓よりも固定に時間がかかります。固定時間を24〜48時間に短縮するために、腎臓を正中面に沿って縦方向(左腎臓)および横方向(右腎臓)に切断し、ホルマリンに沈着する前にカセットに入れることができます。
  6. 組織をホルマリンで所定の時間固定した後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)または蒸留水ですすぎ、70%EtOHで満たされた標識バイアルに移します。組織は、組織型を待っている間、室温でEtOHに無期限に保存することができます。
    1. 腸:4つのカセットを一緒に標本カップに入れます。
    2. 肝臓:肝臓葉を50mLのコニカルチューブに入れます。
    3. 腎臓:腎臓を50mLのコニカルチューブに入れます。
  7. 準備ができたら、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を用いて組織をスライドガラス上に処理します。ホルマリン固定組織をトリミングし、パラフィンに埋め込みます。スライドに5ミクロンの切片をマウントし、H&Eで染色します。

7.ティッシュのスコアリング

  1. 組織スコアリングは、サンプルグループを盲検化した経験豊富な担当者が行うことが望ましいです。
  2. 腸虚血は、Chiu/Park スコアリング システム17 を使用してスコアリングされます。
  3. 腎臓の損傷は、ヤブロンスキースコアリングシステム18,19を使用してスコアリングされます。
  4. 肝障害は、鈴木スコアリングシステム20,21を使用してスコアリングされます。
    注:腸IRIのげっ歯類モデルにおける組織損傷を評価するために現在使用されている多くのスコアリングシステムがあります。本研究で用いた採点システムは、恣意的な推定を最小化し、意図的な定性評価を最大化するために選択された(表1)。

結果

マウスの腸内IRIモデルを実証し、一貫性のある再現性のある結果が得られました。小腸、近位結腸、腎臓、肝臓を切片化し、H&Eで染色した。獣医病理学者は、前述のスコアリングシステムを使用して組織損傷を等級付けしました(表1)。統計分析は、単一因子分散分析(ANOVA)を使用して行われ、その後、ペアワイズ比較を伴うテューキーの事後比較が行われ、グループ内およびグループ間のデータに有意差があるかどうかが判断されました。0.05以下の p値は、統計的有意性を確立するためのカットオフと見なされました。すべての統計的検定とグラフ作成は、表計算ソフト(Microsoft Excelなど)でReal Statistics Resource Packアドオンを使用して実行されました。データは、平均±平均の標準誤差(SEM)として表されます。

腸虚血再灌流傷害(IRI;N = 7)と偽開腹術を受けた患者(Sham;N = 6)(図2 および 図3)。これらのデータの標準誤差は狭く、グループ内およびグループ間で結果の一貫性が実証された。Shamグループの各腸セグメントは、まったく同じ平均Park/Chiuスコア0.83をもたらしました。Sham群の十二指腸、空腸、回腸のSEMは、それぞれ0.31、0.40、0.31であった。IRI群の十二指腸、空腸、回腸の平均Park/Chiuスコアは、それぞれ4.07±0.44、4.14±0.46、5.14±0.40であった。

この研究では、60分間の虚血と120分間の再灌流を受けた最初のマウスの50%(3/6)が死亡しました(60/120群)。3匹のマウスのうち2匹は剖検のために提出された。どちらのマウスも上皮壊死、うっ血、小腸の出血を呈した。さらに、マウスはリンパ球溶解、生理学的ストレスに関連する非特異的変化を示しました。どちらのマウスも、心臓、肺、肝臓、腎臓に病変を認めなかった。45分の虚血と90分の再灌流に時間を短縮し、400IU/kgのヘパリン(45/90/H群)を添加すると、腸損傷スコアを変えることなく死亡率が20%(1/5)に低下しました(図4)。60/120群の平均Park/Chiuスコアは4.56±0.38(N = 3)であり、45/90/H群の平均スコアは4.375±0.38(N = 4)であった。

近位結腸、肝臓、腎臓の損傷を示す顕微鏡所見は、60/120マウスまたは45/90/Hマウスのいずれにも見られませんでした。

表1:腸、腎臓、肝臓のスコアリングシステム。 腸の損傷は、Chiu/Park システム17 を使用して等級付けしました。腎臓の損傷は、ヤブロンスキースコアリングシステム18,19を使用して等級付けされました。肝障害は、鈴木スコアリングシステム20,21を使用して等級付けされました。この表は、Quaedackers et al.17、Du et al.19、Behrends et al.21 に示されているスコアリングシステムの許可を得て採用されています。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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図1:上腸間膜動脈(SMA)の位置と分離。 (A)通常、SMAは下大静脈の腹側にあり、動物の右側に向かって伸びています。腹腔動脈と腎動脈の間に位置しています。この図は、Margaret Cook (1965)22 の The Anatomy of the Laboratory Mouse からの許可を得て改作したものです。(B)この手術では、腸を外在化して左にひっくり返す(この写真では湿らせたガーゼで覆われている)ため、SMA(黄色の矢印)は下大静脈(青い矢印)の左側にあります。略語:RK =右腎臓;D =十二指腸。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図2:ヘマトキシリンとエオシンで染色された小腸セグメント。 シャム群のマウスの空腸(A)と回腸(B)の切片は、歪みのない細長い絨毛を特徴としていた。IRI群のマウスの空腸(C)と回腸(D)の切片は、壊死(アスタリスク)と出血の領域を特徴とし、残りの絨毛(矢印)の鈍化と歪みを伴いました。写真は、45分間の虚血と90分間の再灌流を行い、400IU/kgのヘパリンを投与されたマウスのものです。写真は20倍倍、10%ズームで撮影しました。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図3:小腸セグメントのPark/Chiuスコア。 腸虚血再灌流傷害(IRI)を受けた動物の3つの腸セグメント(十二指腸、空腸、回腸)すべてに対する顕微鏡的損傷は、偽開腹術(偽)を受けた動物と比較して有意に増加しました。* IRI対Shamのp < 0.05。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図4:60分間の虚血と120回の再灌流を受けた小腸と、400 IU/kgのヘパリンによる45分間の虚血と90分間の再灌流を受けた小腸のPark/Chiuスコア。 60分の虚血と120分の再灌流(60/120)から45分の虚血と400IU/kgのヘパリン(45/90/H)による90分の再灌流に時間を短縮しても、IRI群のマウスの小腸のPark/Chiu傷害スコアに統計的に有意な差は生じなかった。しかし、死亡率は50%から20%に低下しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この腸内IRIモデルが広く使用されているにもかかわらず、限界がないわけではありません。例えば、SMAの基部だけを閉塞しても、腸への血流が完全に遮断されるわけではありません。これは、腸間膜の側副循環が広範囲にあり、腹部大動脈の隣接する枝から血液を採取できるためと考えられます。猫を用いた1件の研究では、SMA閉塞により、血流が近位十二指腸で35%、遠位十二指腸で61%、空腸と回腸で71%、近位結腸で63%減少しました。血流は、下腸間膜動脈23から循環の多くを受け取る中部および遠位結腸では減少しなかった。げっ歯類では、空腸と回腸は、SMA閉塞後に最も重大な組織損傷を負う腸セグメントとして最もよく引用されます9。

SMA閉塞後の虚血時間は、1分から90分以上まで、文献に引用されています。虚血時間が異なれば、再灌流損傷のレベルも異なります。Parkらは、虚血間隔が40分から60分の間であれば再灌流傷害を観察したが、虚血間隔が短かったり長かったりするとは観察しなかった24。このような結果は、時間が短いほど再灌流障害を誘発するのに十分な虚血を生じさせないが、時間を長くすると組織にひどく損傷を与え、その後の再灌流損傷を実証することが不可能であることを示唆している。さらに、虚血時間が長いほど、死亡率が上昇するリスクがあります。私たちの研究で見られるように、60分間の虚血を受けた最初のマウスの50%(3/6)は、わずか90分間の再灌流後に死亡しました。虚血時間を45分に短縮すると、組織損傷スコアを変更することなく死亡率が20%(1/5)に低下しました。私たちの研究に基づくと、虚血性損傷の理想的なウィンドウは、約45分間のSMA閉塞によって達成できるようです。

別の変数は、組織採取前の再灌流時間です。虚血時間と同様に、再灌流時間は60分から24時間以上まで、研究によって大きく異なります。いくつかの論文は、腸粘膜が2〜3時間の再灌流で最大の形態学的損傷を負い、24時間25,26,27で完全な修復が達成されることを報告しています。この2〜3時間前に組織を採取すると、再灌流損傷の全容を捉えられないリスクがありますが、24時間近くで採取された組織はすでに修復プロセスを開始しています。当初は120分の再灌流時間を選択したが、死亡率を下げるために90分に変更した。この変化は組織損傷の結果に変化を及ぼさず、2〜3時間のウィンドウから30分の偏差が許容可能であることを示唆しています。

酸素濃度もIRIの開発における重要な変数です。Wildingらは、21%O2を投与されたマウスと比較して、100%O2を投与されたイソフルランで麻酔されたマウスは、無気肺による換気-灌流の不一致を経験したことを発見しました。同じ研究で、100%O2を投与されたラットは急性呼吸アシドーシスを発症し、平均動脈圧が上昇した28。このような生理学的変化は、多くの全身的要因が関与するIRIなどの傷害を誘発する場合に最もよく避けられます。したがって、イソフルラン送達のキャリアガスとしては、100%O2よりも21%O2の方が適切であるように思われる。

このプロトコルでのヘパリンの使用については議論の余地があります。ヘパリンは抗凝固作用と抗炎症作用があることが知られている29。60分の虚血と120分の再灌流から、45分の虚血と400IU/kgのヘパリンによる90分の再灌流に変更しても、顕微鏡的腸損傷は変わらなかったが、死亡率は低下した。考えられる説明の1つは、ヘパリンが肺や脳などの遠隔臓器への致命的な血栓塞栓症を予防したというものですが、死亡した最初の2匹のマウスの肉眼的または顕微鏡的検査による剖検では、この証拠は見つかりませんでした。ヘパリンを含まない虚血および再灌流時間を短くすることは、死亡率の低下に同様に効果的である可能性があります。その場合は、IRIへの干渉を最小限に抑えるためにヘパリンの使用を控えるのが賢明です。ただし、プロトコルにヘパリンを含めることは、外科患者が周術期にヘパリンを受け取ることが多いため、IRIの外科的原因をモデル化したい人に適している可能性があります。

イソフルランは、腸の炎症や虚血の場合に組織保護効果があることが示されており、その使用は臨床的に関連するIRIモデル30,31,32を妨げる可能性があります。.しかし、有機フッ素吸入剤(すなわち、イソフルラン、セボフルラン)は、獣医学と人間医学の両方で一般的に使用されている麻酔薬です。さらに、このプロトコルに必要な麻酔の長さは120分を超え、吸入剤は再投与する必要がある短時間作用型注射剤よりも適切です。

近位結腸、肝臓、または腎臓に顕微鏡的病変は存在しなかった。微視的変化がなかったのは、おそらく90〜120分の再灌流時間が比較的短かったためです。.さらに、近位結腸には下腸間膜動脈からの血液供給があります。ただし、目に見える損傷がないからといって、全身の損傷を除外するものではありません。逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)は、TNF-αなどの炎症性サイトカインを測定することにより、全身損傷を実証するためのより良い方法論である可能性があります。

この腸内IRIモデルのいくつかのバリエーションが長年にわたって開発されてきました。1990年、Megisonらは、SMAに加えて側副血管を閉塞すると、腸間膜血流がより一貫して減少するが、死亡率が増加することを実証した33。より最近の研究では、SMAをその基部で閉塞させる代わりに、末梢枝と側副枝を結紮して回腸遠位部に虚血を誘発すると、死亡率なしで再現可能な損傷が得られることが示されました34。局所動脈枝の閉塞は、最大の虚血を保証し、SMAをその基部で結紮することで見られる血流の多発性、セグメント的な減少の問題に対処する可能性があります。腸内IRIをモデル化するこの代替法は、腸内IRIの局所組織への影響に関する研究に応用できますが、腸の損傷に関連する可能性のある全身性炎症と多臓器不全を正確にモデル化できるかどうかは不明です。

SMA閉塞は、すべてのタイプの腸管IRIに適したモデルではありません。例えば、非閉塞性腸間膜虚血は、心拍出量の低下に起因する内臓低灌流を特徴としています。したがって、この手法は、心筋梗塞、うっ血性心不全、大動脈弁機能不全、または腎疾患または肝疾患によって引き起こされる腸内IRIの研究には最適ではありません35。しかし、Kozarらは、SMA閉塞はショックによって誘発される腸内IRIの臨床的に関連するモデルであると報告した36。経済的ではありませんが、ブタなどの他の種の使用は、特定の腸の損傷状態をモデル化するためにげっ歯類よりも利点がある可能性があります。2014年のGonzalezらによる包括的なレビューでは、腸内IRIの調査に現在使用されている動物モデルが記述されています9。

その限界にもかかわらず、SMAをその基部で閉塞する技術は、腸虚血の最も一般的に利用されているげっ歯類モデルの1つであり続けています9。1つの血管クランプと基本的なセットアップのみで済むため、手術自体は非常に簡単です。また、ここに示したデータで証明されているように、再現性のある損傷も生じます。げっ歯類におけるSMA閉塞は、腸内IRIの閉塞原因を確実にモデル化することができ、獣医学とヒト医学の両方で実用化することができます。そのため、ここで概説した手順を一貫性を持って実行することが重要です。

開示事項

この論文の著者は、開示すべき利益相反を持っていません。

謝辞

このプロジェクトの資金は、米国国立衛生研究所(NIH)の国立心肺血液研究所の学内研究部門から提供されました。

ジェームズ・ホーキンス博士の指導とサポートに感謝します。また、上腸間膜動脈の特定に協力してくれたMihai Oltean博士とRobert Linford博士にも感謝します。このプロトコルの開発中に専門知識を提供してくれたPatricia Carvalho Obeid Ellrich博士、Claudio Correa Natalini博士、George Howell III博士に感謝の意を表します。最後に、この論文で紹介した美しい顕微鏡写真の入手に協力してくれたStephen Wincovitch氏と、最終的な図のラベル付けとレンダリングを手伝ってくれたAlicia Olivier博士に感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アドソン鉗子RobozRS-5236手術器具
Alm retractorRobozRS-6510手術器具
麻酔器Datex-OhmedaAestiva 5
麻酔:イソフルランBaxter Healthcare CorporationNDC 10019-360-40用量:1-4%、INH
血管カテーテル 20 g  x 2Smiths Medical5057食塩水とホルマリンによる腸の洗い流
非外傷性微小血管クリップテレフレックス065100手術器具
緩衝ホルマリン 10%フィッシャーサイエンティフィック23-245684組織固定
ブピビカイン 0.25%ホスピーラ株式会社NDC 0409-1160-18用量:最大2 mg / kgドロップワイズ
ブプレノルフィンパー医薬品NDC 42023-179-05用量:1 mg / kg、SQ
クロルヘキシジンスクラブ 2%Vet One510083手術部位の準備
循環水ブランケットシンシナティ サブゼロブランケット 2体温維持
クリッパー - Wahl BravMini、パープル バリカンランバート獣医供給008WA-41590-0438手術部位の準備
円錐管 50 mlフィッシャーサイエンティフィック14-432-22組織の固定と保存
ドライアイスN/AN/APCR 組織サンプル
EtOH 200 プルーフワーナー・グラハム・カンパニー64-17-5組織保存
ヘパリン (オプション)Meitheal PharmaceuticalsNDC 71288-402-11投与量: 200-600 IU/kg
誘導室VetEquip941456
Indus Instruments THM100 げっ歯類モニターIndus InstrumentsN/A手術中のげっ歯類の体温監視用
イソプロピルアルコール 70%HumcoNDC 0395-4202-28手術部位のスクラビング用
マイクロ遠心チューブ:0.6mLフィッシャーサイエンティフィック05-408-121PCR組織サンプル。マウスあたり8、ターミナルブリードコレクション、血清保存
Microsoft ExcelマイクロソフトN/A
ノーズコーンN/AN/A シリンジチューブまたはバブルチューブで自家製にすることができます
O2 medical空気 21%ロバーツ 酸素N/Aレート:各Lチャンバー容量あたり0.5 L/分
眼科用軟膏Akorn, Inc.NDC 17478-062-35外科用準備
PBS pH 7.4 (1x)ThermoFisher Scientific10010-031組織のすすぎと 70% EtOH
検体カップCardinal HealthcareC13005ホルマリンで組織カセットを保持するため
滅菌 Castroviejo ニードルホルダーRobozRS-6412手術器具
滅菌綿棒Medline
滅菌ガーゼMedlinePRM21423Z
滅菌マイクロ解剖ハサミRobozRS-5980手術器具
滅菌マイクロ解剖スプリングハサミRobozRS-5693手術器具
滅菌マイクロ鉗子RobozRS-5264手術器具
滅菌生理食塩水 (0.9%)ブラウンR5201-01温める必要があります
滅菌メス刃 #15Cardinal Health (Allegiance)32295-015手術器具
滅菌メスハンドルRobozRS-9843手術器具
滅菌手術用ドレープMedlineDYNJSD1092
滅菌手術用手袋MedlineMSG2270
滅菌外科用ステープラーRobozRS-9260手術器具
滅菌外科用ステープルRobozRS-9262腹部皮膚閉鎖
滅菌縫合糸 Vicryl (ポリグラクチン910) 6-0, 27インチ テーパー RB-1 ニードルEthiconJ212G腹部の筋肉を閉じる
サージカルテープMedlineMMM15271Zを背側臥位に固定
シリンジ 10ml x 2MedlineSYR110010生理食塩水とホルマリンによる腸の洗浄
組織カセットフィッシャーサイエンティフィック22-038-665ロールした腸セグメント。 マウスあたり4個。
タオルまたはドレープMedlineGEM2140ウォーターブランケットカバー
生理し の作成用 BXTA50002Z マウス

参考文献

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