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方法論記事

覚醒した頭部固定ラットのニューロイメージングのための頭部インプラント

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DOI:

10.3791/64324

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2022年9月7日

 ,  ,  , 
1Department of Neurobiology and Behavior, School of Biological Sciences, University of California Irvine, 2Department of Biomedical Engineering, School of Engineering, University of California, Irvine, 33Center for Neurobiology of Learning and Memory, University of California, Irvine

この記事について

サマリー

覚醒した頭部固定ラットの機能的イメージングのための詳細な新しい手順が記載されている。

要約

前臨床および基礎科学研究で一般的に使用される麻酔薬は、脳の代謝、ニューロン、および血管機能に抑うつ影響を及ぼし、神経生理学的結果に悪影響を与える可能性があります。研究研究のために覚醒している動物を使用することは有利ですが、データ収集中のモーションアーチファクトを最小限に抑えるために動物を落ち着かせて静止させるという大きな課題をもたらします。より小さなサイズのげっ歯類(マウスなど)での覚醒イメージングは非常に一般的ですが、ラットはより大きく、より強く、イメージングに必要な長時間にわたって運動拘束と頭の固定に反対する傾向があるため、ラットでは乏しいままです。カスタマイズされた手縫いのスリング、3Dプリントされたヘッドインプラント、ヘッドキャップ、およびヘッドフレームを使用した、覚醒した頭部固定ラットのニューロイメージングの新しいモデルについて説明します。シングルウィスカー刺激の単一の試行の後に得られた結果は、誘発された機能的反応の強度の増加を示唆しています。覚醒した頭部固定ラットからの誘発機能応答の獲得は、麻酔をかけたラットからのそれよりも速く、信頼性が高く、再現性があり、繰り返しの縦断的研究に使用できます。

概要

基礎的、前臨床的、およびトランスレーショナルな科学的ニューロイメージング調査のほとんどは、麻酔をかけられた動物から取得されます1,2。麻酔薬は実験を容易にしますが、脳と体の代謝、血圧、心拍数に継続的に影響を与えます3。麻酔薬の種類と投与期間と投与経路は、再現性と翻訳障害に寄与する可能性のある交絡変数をデータ解釈に追加します4。覚醒、頭部固定ラットの神経画像研究の主なボトルネックは、準備およびデータ収集プロセス全体を通してラットを静止させ、落ち着かせ続ける必要があることです。小さな動きは不当なモーションアーティファクトを生成し、データの分析と解釈に悪影響を与える可能性があります。

カスタマイズされたスリング、3次元(3D)プリントされたヘッドインプラント、ヘッドキャップ、およびヘッドフレームを使用した、覚醒した頭部固定ラットからのニューロイメージングの新しいモデルが考案され、実験が容易になるいくつかの利点があります。3Dヘッドインプラントは軽量で、トランスフィックスに必要な頭蓋骨のごく一部をカバーしています。3Dプリントされたヘッドインプラントとキャップは、コンピューター支援設計(CAD)ソフトウェアを使用して設計されています。ウィスカ刺激、データ取得、データ分析、および麻酔をかけたラットからの結果のプロトコルは、以前の研究5、6、7で詳細に説明されています。

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プロトコル

すべての手順は国立衛生研究所のガイドラインに準拠しており、カリフォルニア大学アーバイン校の動物管理および使用委員会によって承認されています。この研究では、7匹の雄と1匹の雌ラット(Sprague-Dawley、体重:185-350g)を使用しました。研究終了後、ラットを二酸化炭素の過剰摂取を用いて屠殺した。

1.さまざまなコンポーネントの設計

  1. ヘッドインプラントの設計:
    1. CADソフトウェア(図1C)を使用して頭部インプラントを作成し、体性感覚皮質を中心としたブレグマの後方および正中線に隣接する領域を画像化するように設計します。ヘッドインプラントが、イメージング領域から離れた頭蓋骨の0.9mmから1.9mmの領域をカバーしていることを確認してください。
    2. 3本のネジだけで、ヘッドインプラントをラットの頭蓋骨に固定します。画像化された半球の反対側の正中線の反対側に残るように、すべてのネジ穴を設計します。
    3. 図1Dに示すように、ヘッドインプラントの上部に内側からくり抜かれたバーを配置して、ワイヤーがヘッドキャップをヘッドインプラントに固定できるようにします。
  2. ヘッドキャップのデザイン:
    1. ヘッドキャップがイメージング領域を完全に覆い、 図1A、Bに示すように、あらゆる種類の外傷から保護していることを確認してください。ヘッドキャップに曲率を追加して、標準の濃縮ケージでの動物の日常の活動を妨げることなく、頭の形に合わせます。
    2. 図1Eに示すように、ヘッドインプラントの上部が収まるように、ヘッドキャップの内側をより広い長方形にカットします。この長方形に垂直に、他の2つの長方形領域を切り取り、ヘッドキャップをヘッドインプラントに固定します。
    3. 図1E-Gに示すように、ヘッドキャップをラットヘッドに固定するために、ヘッドインプラントの上部くぼんだバーに1本のワイヤーを通します。同じ方法で2番目のワイヤーを通過させます。
      注意: これらのワイヤーは、ペンチまたは鉗子を使用して簡単に取り外すことができます。3D印刷ファイルは、補足 ファイル1 および 補足ファイル2として提供されます(ファイル形式:STL)。
  3. ヘッドフレームのデザイン:
    1. 1つのカット部分がヘッドインプラントの上部バーを通って移動できるようにヘッドフレームを設計し、クランプを使用して固定します。
    2. もう一方のカット部分を角度を付けて、ラットの頭を固定したままにして、反対側にイメージングに完全にアクセスできるようにするための追加の強度を提供します。この研究の目的のために、鋼板を錫の切り取りで切断してヘッドフレームを製造します(図1H、I)。
      注:この部品は3Dプリントすることもできます。

2.最初のラットトレーニング

  1. ラットがケージ内のビバリウム環境に2〜3日間順応できるようにします。
  2. 静かな部屋でネズミの取り扱いを開始します。ケージを開き、実験者にラットの近くのケージの中に15〜20分間手を入れてもらい、ラットを慣れさせます。
  3. ラットが驚いたり、実験者の手から逃げたりして落ち着きを示したら、ラットをそっと持ち上げて取り扱います。スリングトレーニングの前に、毎日30〜45分間ラットを処理します。

3.スリングトレーニング

  1. ヘッドインプラントとヘッドキャップの外科的移植の前に、スリングで少なくとも2〜3日間ラットを訓練します。
  2. 図2Aに示すようにスリングセットアップを配置します。エタノールワイプを使用してスリングセットアップを清掃します。
    注意: すべてのスリングは手縫いで、 図2A、Bに示すように、底面または両側にネット素材で作られています。
  3. スリングトレーニングでは、後足のピンチ反射がなくなるまで、誘導に4%、維持に1%のイソフルランを使用してラットに麻酔をかけます。
  4. イソフルラン麻酔下で、ラットを20 cm x 8 cm(長さx幅)の柔軟なプラスチックシートの上に置き、10 cm x 8 cmのプラスチックシートがベルクロの柔らかい部分で完全に覆われています。.
    注:スリングトレーニングのためにラットを麻酔することはオプションのステップであり、主にストレスや不安を軽減するために使用されます。
  5. トレーニングの最初の2日間は、ラットをベビーソックス(サイズ0〜3か月)にぴったりと入れ、靴下の端に切開された小さな穴から頭を出します。
  6. 吸収パッドの小片を下半身に巻き付けて、ラットを乾いた状態に保ち、排泄物を収集します。
  7. ラットを通気性のある綿布(サイズ:25 cm x 25 cm)で包みます。ベルクロストリップが接着されているプラスチックシートの上にラットを置きます。
  8. さらに、幅0.5 cmのベルクロストリップを互いに3〜6 mmの距離で使用してラットをプラスチックシートに固定します。
  9. ラットをスリングに固定します。ガス麻酔を外します。ラットがスリングのガス麻酔から回復するのを待ちます。
  10. ラットが泡立て始めたら、10〜15分ごとに報酬として数滴の10%スクロース溶液を提供します。
  11. ラットをイメージング中に使用される感覚刺激(ここではウィスカー刺激、15〜25分ごと)をランダムに提示して、感覚刺激に慣れさせます。ランダムな間隔でひげを手動で刺激します。
  12. 図2Cに示すように、スリングでラットを1日目に1時間、2日目に2時間、3日目に3時間訓練します。

4.手術前の準備

  1. 3Dプリンタを使用してヘッドインプラントとヘッドキャップを印刷します(図1)。
  2. すべての手術器具とヘッドピース(インプラントとキャップ)をMetricide28殺菌剤に10時間浸して滅菌します。手術直前に滅菌水で道具をよくすすいでください。
  3. ラットを4%イソフルランにさらし、後足のピンチ反射がなくなるまで1%〜2%イソフルランに維持します。.この手術は、イソフルラン、ペントバルビタールナトリウム、ケタミン-キシラジンなど、さまざまな種類の麻酔下で行うことができます。
  4. アトロピン(0.05 mg / kg)を筋肉内に注射して粘液分泌を減らし、呼吸を助けます。
  5. ラットの頭を目の間から耳の後ろにかけて毛トリマーを使用して正中線を中心に5 mm剃ります。
  6. ラットの後肢に固定されたパルスオキシメータと心拍数モニタープローブを介して部分酸素飽和度と心拍数を監視します。
  7. ラットの頭とその周辺をベタジンと70%アルコールワイプを交互に3回拭きます。
  8. ラットを定位固定装置に固定する。
  9. ワセリンで潤滑された直腸プローブを挿入してラットの体温を測定し、麻酔薬投与後の低体温を避けるために加熱ブランケットのフィードバックシステムを通してそれを維持します。
  10. 局所麻酔薬塩酸リドカインを20 mg / ml、0.07 mg / kg +/-0.2体重の濃度で手術部位に皮下投与します。.
  11. 眼科用軟膏を両目に塗り、乾燥を防ぎます。
  12. 手術部位に2%局所麻酔薬を皮下投与します。.
  13. 室温で3mLの乳酸リンゲル溶液を皮下注射して、脱水を防ぎ、手術中に栄養を与えます。

5.手術

  1. 鋭利な手術用ハサミを使用して、手術部位(正中線と頭の中心を中心とした直径4mm)の上の皮膚の部分を取り除きます。頭の側頭部の耳と目の間の皮膚の一部(直径~2mm、左体性感覚皮質上)を解剖して除去します。
  2. メスを使用して、下にある皮膚(頭蓋周囲)組織を取り除き、頭蓋骨を露出させます。滅菌綿ガーゼを使用して頭蓋骨を清掃します。
  3. 側頭筋を収縮/切除して、イメージング領域の希望のサイズを露出させます[この研究では7.5 mm x 7.5 mm]。
  4. ヘッドインプラントの反対側の半球に頭蓋骨を露出させます。ヘッドインプラントを頭蓋骨に配置して、図2D-Fに示すように、インプラントの固定ネジの位置を確認します。
  5. ドリルビット1を備えたインディアインクを使用してネジをドリルするための頭蓋骨に印を付けます。歯科用ドリルビット3を使用してネジのバリ穴を開けます。ヘッドインプラントを所定の位置にねじ込みます。
  6. 滅菌ガーゼを使用して頭蓋骨を乾かします。ヘッドインプラントの周囲と下に組織接着剤の薄層を塗布して、頭蓋骨に接着します。歯科用セメントの層を適用してヘッドインプラントをさらに所定の位置に支え、セメントを2〜3分間乾燥させます。
    注:歯科用セメントに加えてティッシュ接着剤を使用すると、強力なホールドが保証されます8。
  7. 歯科用ドリルビット3を使用して、頭蓋骨の左側にある7.5 mm x 7.5 mmの領域をブレグマのすぐ後方、正中線の外側に薄くします。 図3Aに示すように、頭蓋骨を~50μmに薄くします。
  8. 図3Bに示すように、手術部位に局所抗生物質軟膏を塗布し、シリコーンゴムの薄層で覆って、薄くなった頭蓋骨を保護します。図3Cに示すように、ヘッドキャップを使用して手術部位を覆います。図3D、Eに示すように、ヘッドインプラントとヘッドキャップの両方を通過する2本の小さなワイヤで所定の位置に固定します。図3Fに示すように、ヘッドキャップと頭蓋骨を覆うためにシリコーンゴムを塗布し、ヘッドキャップをさらにラットの頭の上で安定させます。
    注意: シリコンゴムは、薄くなった頭蓋骨をさらに保護します。
  9. 痛みと炎症の管理のために、フルニキシンメグルミン(2.5 mg / kg)をラットに皮下注射します。.感染を防ぐために、エンロサイト系抗生物質エンロフロキサシン(22.7mg / ml、10mg / kg +/-.01)を腹腔内に注射します。.
  10. ラットを回復室に移動して、保温ブランケットとヒートランプで体温を維持します。ラットが意識を取り戻し、胸骨横臥を維持できるようになるまで、ラットを継続的に監視します。
  11. ラットが完全に回復したら、ラットを別のケージに戻します。
  12. 次の3日間は、フルニキシンとブプレノルフィンを投与して炎症と痛みを和らげ、感染を防ぐために1日2回投与します。

6.覚醒イメージング

  1. 後足のピンチ反射がない場合、誘導用に4%、維持用に1%のイソフルランでラットを麻酔します。.アセプロマジン(0.3-0.5 mg / kg)を皮下注射します。.
    注:この濃度のアセプロマジンは軽度の鎮静レベルを下回っており、イメージングプロセス全体を通してラットを落ち着かせるのに役立ちます。
  2. カスタマイズされたベルクロのストリップを使用して、トレーニング手順中に使用されたプラスチックシートにラットを固定します。吸収パッドを使用して下半身を包み、ラットをスリングにぴったりと置きます。
  3. シリコンゴムを取り外します。固定ワイヤーを外してヘッドキャップを取り外します。 図2Gに示すように、ヘッドフレームをヘッドインプラントに固定します。
  4. ヘッドフレームをクランプでロックします( 図2H、Iを参照)。
  5. ガス麻酔を外します。イメージング領域を生理食塩水で3回洗い流し、湿ったガーゼできれいにします。イメージングエリアを乾燥させ、ワセリンを使用してイメージングエリアの周りに井戸を作ります。ウェルを滅菌生理食塩水で満たし、スライドガラスで覆います(図2E)。
  6. 以前に詳細に議論された固有信号光イメージングの取得手順、ウィスカ刺激プロトコル、およびデータ分析と提示を参照してください6,7。
  7. 実験を通して、ラットの目を柔らかい布またはガーゼ(オプション)で覆うことによってさらに減らすことができる興奮および落ち着きのなさの兆候についてラットを監視する。

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結果

麻酔をかけたラットの1回の試行からの代表的な光学画像信号と、覚醒したラットの(収集された40回の試行のうち)合計応答を示します(図4)。覚醒ラットのシングルウィスカー刺激の信号強度は、麻酔をかけたラットよりも高い閾値で視覚化することができ、覚醒動物からのより強い信号を示す。ラットのC2ウィスカーを5Hzで1秒間刺激し、機能応答をベースラインと比較した分数変化として表示します。暗い領域(負の閾値より下)はニューロン活動の主要な領域であり、明るい白い領域(正の閾値より上)は刺激9に対する酸素化された血液応答を示す。画像は、矢印で示されているように、左から右が吻側から尾側(C)方向、上から下が内側から外側(L)方向になるように配置されています。

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ディスカッション

覚醒、頭部固定ラットイメージングの使用は、容易さとカスタマイズの点で多くの利点を提供します。カスタム設計されたスリングにより、ラットを通気性のあるネット素材で包むことができ、動物を閉じたプラスチック製の拘束室に長時間囲む必要がなくなります10,11。ラットは、ラットの軽度の鎮静レベル(1.0-2.5 mg / kg)未満の非常に低用量のアセプロマジンを使用して、連続したイメージングセッションの長期間にわたって落ち着いてストレスのない状態に保たれます12。ラットを安定させ、イメージングセッション中のモーションアーチファクトをさらに排除するために、ベルクロストリップが使用されます。ベルクロストリップは、長時間の不必要な体のくびれを避けるために、互いに3〜6mmの位置に配置されます。ラットは、準備およびデータ取得中にスリングで落ち着いて快適に休むことができるように、若い年齢でスリングで訓練され、慣れています。予備的な結果に基づいて、体重が約150〜175 gの若いラットは、年配の...

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開示事項

著者は開示する利益相反を持っていません。

謝辞

クララ・ジョーンズ、ジェームズ・スターウォルト、リン・ホアン、ヨン・ジュンハ、アミルソヘイル・ザレがラットの訓練とスリングの準備に協力してくれたことに感謝します。資金提供は、国立衛生研究所(NIH、助成金番号:NS119852)およびLeducq財団(助成金番号:15CVD02)から提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ラットチャールズ リバースプレイグ ドーリー
イソフルランピベタール21295098全身麻酔薬
リドカイン HCl 2% 注射フェニックスL-2000-04局所麻酔薬
アトロピン硫酸塩注射Vedco5098907512 呼吸を助ける
乳酸リンガー注射液Vedco
フルニキシン注射Vedco6064408670疼痛管理
エンロサイト注射 (エンロフロキサシン 2.27%)VetOne501084感染を避ける
PromAce 注射 (マレイン酸アセプロマジン)Beohringer Ingelheim136059
Animax 軟膏Dechra 獣医製品122-75ナイスタチン1000グラムあたり1000単位、ネオマイシン硫酸塩2.5mg/グラム、チオストレプトン2500グラム/グラム、トリアムシノロンアセトニド1mg/グラムの有効成分
Puralube眼科用軟膏Dechra Veterinary Products211-38
ビドンヨードPVP準備パッドメドラインMDS093917ベタジンジェネリック
イソプロピルアルコールスワブBD326895
Vetbond組織接着剤3M1469SB
バー (ドリルビット)、標準オペテラリー カーバイドSS ホワイト バー14829#3 バー
ネジ、00-90 x 1/8 フラットヘッド ステンレス鋼J.I. モリスF0090CE125アンカー ネジ
定位固定システムKopf Instruments1430
ホメオサーミック ヒーティング ブランケットハーバード Apparatus50-7220-F
パルスオキシメータ&心拍数モニターKent ScientificMouseStat Jr.
ワセリンフィッシャーサイエンティフィP66-1LBワセリン汎用
ワイヤー、裸銅フィッシャーサイエンティフィック15-545-2C20ゲージ
ティーツコールドキュアパウダーピアソンデンタルC73-0054 有効成分:メタクリル酸メチル
ティーツ コールドキュア リキッドピアソンデンタルC73-0078 有効成分:メタクリル酸メチル
シリコーンモールドゴムスムースオンボディダブルファストシリコン
ポリマーMetricide 28(殺菌剤)MetrexOct-05
インク、黒ペリカン301051
歯科用ドリルNSKデンタルアルティメットXL-F
3DプリンターPrusaResearchi3 MK3S +
クロに縫う90030
ペットスクリーニングユーティリティファブリックジョアン10173334ネット材料
バー(ドリルビット)、標準オペレーターカーバイドSSホワイトバーズ14829#1バー
50989088317ポックインドファスナーベル

参考文献

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