方法論記事

in vitroでの膜曲率感知タンパク質の研究のためのナノバー支持脂質二重層システム

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DOI：

10.3791/64340

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2022年11月30日

 ,  , 
1School of Chemistry, Chemical Engineering, and Biotechnology, Nanyang Technological University, 2State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry Synthesis Technology, College of Chemical Engineering, Zhejiang University of Technology, 3Institute for Digital Molecular Analytics and Science, Nanyang Technological University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、ナノバー支持脂質二重層システムが開発され、 in vitroで曲率感知能力を有するタンパク質の特性評価を可能にする、定義された曲率を有する合成膜を提供する。

要約

膜湾曲は、細胞移動、細胞分裂、小胞輸送など、細胞のさまざまな重要なプロセスにおいて重要な役割を果たします。それは細胞活動によって受動的に生成されるだけでなく、タンパク質相互作用を積極的に調節し、そして多くの細胞内シグナル伝達に関与している。したがって、タンパク質と脂質の分布とダイナミクスの調節における膜湾曲の役割を調べることは非常に価値があります。最近、 in vitroで湾曲膜とタンパク質との関係を研究するために多くの技術が開発されている。従来の技術と比較して、新しく開発されたナノバー支持脂質二重層(SLB)は、事前に定義された膜曲率と局所的なフラットコントロールを備えたナノバーのパターン化されたアレイ上に連続的な脂質二重層を形成することにより、膜湾曲生成におけるハイスループットとより良い精度の両方を提供します。脂質の流動性と湾曲した膜に対するタンパク質の感受性の両方を、蛍光顕微鏡イメージングを使用して定量的に特徴付けることができます。ここでは、ナノバーアレイを含む作製したガラス表面にSLBを形成する方法と、そのようなSLB上の曲率感受性タンパク質の特性評価に関する詳細な手順を紹介します。さらに、ナノチップの再利用と画像処理のためのプロトコルについても説明します。nanobar-SLB以外にも、このプロトコルは曲率センシング研究用のあらゆるタイプのナノ構造ガラスチップに容易に適用できます。

概要

膜湾曲は、形態形成、細胞分裂、細胞移動などのさまざまな細胞プロセスで発生する細胞の重要な物理的パラメータです1。膜の湾曲は細胞イベントの単純な結果を超えていることが現在広く認識されています。代わりに、タンパク質相互作用と細胞内シグナル伝達の効果的な調節因子として浮上しています。例えば、クラスリン媒介性エンドサイトーシスに関与するいくつかのタンパク質は、湾曲した膜に優先的に結合し、エンドサイトーシスのホットスポットを形成することが見出された2。膜変形の原因は、細胞骨格力による膜の引っ張り、異なるサイズの頭部基を持つ脂質非対称性の存在、円錐形の膜貫通タンパク質の存在、BARドメインタンパク質(Bin、アンフィフィシン、Rvsタンパク質にちなんで名付けられた)などの膜形成タンパク質の蓄積、および両親媒性ヘリックスドメインの膜への挿入など、さまざまな原因があります1.興味深いことに、これらのタンパク質と脂質は膜を変形させるだけでなく、膜の湾曲を感知し、優先的な蓄積を示すことができます1。したがって、曲率の異なる膜が、それらに付着したタンパク質や脂質の分布や動態、および関連する細胞内プロセスへの潜在的な影響を変化させるかどうか、またどのように変化するかを研究することが重要です。

生細胞系とin vitro系の両方における湾曲膜とタンパク質の相互作用を分析するために、多くの技術が開発されてきました。生細胞システムは、豊富な脂質多様性と動的なタンパク質シグナル伝達調節を備えた実際の細胞環境を提供します2,3,4,5,6,7。しかし、このような洗練されたシステムは、細胞内環境の不確実性と変動のために研究が困難です。したがって、既知の脂質種と精製タンパク質で構成される人工膜を使用したin vitroアッセイは、タンパク質と湾曲した膜との関係を特徴付けるための強力な再構成システムになっています。伝統的に、異なる直径のリポソームは、遠心力を用いた共沈降アッセイまたはタンパク質凝集を回避するための密度勾配を有する共浮遊アッセイのいずれかを介して曲率感受性タンパク質を検出するために押出成形によって生成される8,9。しかしながら、押出リポソームの曲率は、押出機10で使用されるメンブレンフィルターの利用可能な孔径によって制限される。単一リポソーム曲率(SLiC)アッセイは、異なる直径を有するリポソームが蛍光標識され、表面に固定化され、曲率を蛍光強度によってマークすることができるというこの制限を克服することが証明されている11。しかしながら、脂質組成の強い変動は、小さな小胞において観察されており、これは曲率測定の精度に影響を及ぼす12。テザー引っ張り実験は、光ピンセットを使用して巨大な単層小胞(GUV)から引き出された過渡テザーの曲率のより正確な測定を提供し、曲率は生成された膜張力によって十分に制御することができる13,14。この方法は、正または負の曲率感知タンパク質の研究に適していますが、チューブジェネレーション10のスループットによって制約されます。サポートされているメンブレンチューブ(SMrT)アッセイは、マイクロ流体の流れによって同じ脂質リザーバーから押し出される複数のメンブレンチューブの同時生成を可能にします。それにもかかわらず、膜の曲率はナノチューブに沿って本質的に変化し、蛍光強度に基づく曲率測定の精度を損なう15,16。比較すると、小さな単層小胞(SUV、直径<100nm17)を使用して、設計されたトポグラフィーを含む表面に支持された脂質二重層(SLB)を形成し、ナノ加工またはナノ材料によって所定の曲率を有する単一の二層膜を高精度で生成した18、19、20。

ここでは、ナノバーアレイを用いて作製したナノチップ表面上にSLBを形成するためのプロトコルと、それを使用してin vitroでタンパク質の曲率感度を調べる方法を紹介します。 図1に示すように、アッセイには6つの必須コンポーネントがあります:A)マイクロ流体チャンバーによるチップの洗浄と組み立て。B)定義された脂質組成を有するSUVの調製;C)ナノチップ上でのSLBの形成および湾曲感受性タンパク質との結合;D)蛍光顕微鏡下でのSLBおよび曲率感受性タンパク質のイメージングおよび特性評価。E)再利用のためにチップをクリーニングする。F)タンパク質曲率感知能の定量的解析のための画像処理。詳細なプロトコルについては、以下で段階的に説明します。

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プロトコル

1. ナノチップの洗浄

  1. パターン化された面を上に向けて、ナノチップを10 mLビーカーに入れます。
    注:この石英ナノチップは、21の前に説明したように電子ビームリソグラフィーによって製造されています。チップ上のナノ構造の形状と配置は、カスタム設計することができます。ここで使用されるグラジエントナノバーのサイズは、長さ2000nm、高さ600nm、幅100〜1000nm(100nmステップセット)です。
  2. ビーカーに1mLの98%硫酸を慎重に加え、酸がチップの前面と背面を完全に覆っていることを確認します。
    注意: 98%硫酸は非常に腐食性があり、皮膚や目に触れると急速な組織破壊や重度の化学火傷を引き起こす可能性があります。適切な保護を施したヒュームフードで使用してください。
  3. ビーカーをゆっくりと回転させ、ビーカー全体が熱くなるまで200μLの30%過酸化水素を一滴ずつ加えます。硫酸と過酸化水素がよく混合されて、ナノチップ17から有機分子を除去するためのピラニア溶液を形成することを確認する。前述のように、UV光やオゾン曝露など、清浄な親水性表面上にSLBを生成するための代替技術があります23。
    注意: 反応は非常に発熱性があり、溶液が沸騰する可能性があるため、硫酸に過酸化水素を一滴ずつ加え、回転させ続けます。
  4. ビーカーを二次ガラス容器に入れ、ナノチップをピラニア溶液に一晩浸して不純物を完全に洗浄します。
    注意: 反応によってガスが発生する可能性がある場合に備えて、ビーカーをカバーなしでドラフトに入れます。
  5. ビーカーを取り出し、ピラニア溶液を酸性廃棄物容器に慎重にピペットで入れます。
  6. 5mLの脱イオン水をビーカーに入れて残留酸を希釈し、酸廃棄物に捨てます。この手順を5回繰り返し、5 M NaOHを使用して酸廃棄物を中和します。
  7. ピンセットでチップをつかみ、脱イオン水の連続流で洗浄して、残留酸を完全に取り除きます。SLB形成22のために、チップを99.9%窒素ガスでブロードライします。

2. 小型単層小胞(SUV)の生成

  1. 100 μLのクロロホルムを琥珀色のバイアルに加えます。
    注意: クロロホルムは非常に揮発性の高い無色の液体であり、吸入または飲み込むと有毒になる可能性があります。マスクと手袋を着用した状態でドラフトで使用してください。
  2. 脂質混合物500μgをクロロホルムに溶解する。ここで使用される脂質混合物の組成は、89.5モル%の卵ホスファチジルコリン(PC)、10モル%の脳ホスファチジルセリン(PS)、および0.5モル%のテキサスレッド1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩(テキサスレッドDHPE)である。
  3. クロロホルムが揮発し、脂質混合物が乾燥するまで、バイアル内の脂質混合物を99.9%窒素ガスでブロードライします。
    注意: この手順は、ドラフトで実行する必要があります。ブロードライの際は液体の飛散を避けてください。
  4. 蓋なしで琥珀色のバイアルに存在する脂質混合物をアルミホイルで覆われた真空デシケーターに入れます。次に、サンプルをポンプで3時間真空乾燥して、クロロホルムを完全に揮発させます。
  5. 250 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)バッファーをバイアルに加えます。それが均質になるまで溶液を渦巻きます。
    注:PBSバッファーは、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドを含まない150 mM NaClで構成されています。pHは、PCおよびPS脂質二重層を作るために7.2に調整される。
  6. バス超音波処理器で50kHzの周波数で30分間脂質混合物を超音波処理する。次に、脂質混合物を1.5 mLの遠沈管に移し、パラフィルムで密封します。
  7. 脂質混合物を液体窒素中で20秒間凍結した後、水浴中で42°Cで2分間解凍します。凍結融解サイクルを30回繰り返します。その後、脂質混合物は透明な液体のように見えます。
    注意:液体窒素の沸点は約-195.8°Cです。凍傷や極低温火傷を引き起こす可能性があります。断熱手袋をはめたまま、狭いスペースでご使用ください。
  8. 2つのガラス気密シリンジとミニ押出機のコネクターをそれぞれエタノール、クロロホルム、メタノールですすいでください。すすぎシーケンスを5回繰り返して、装置を事前に洗浄します。有機溶剤が完全に揮発するまで、それらをドラフトに入れておきます。
  9. ミニエクストルーダー装置を組み立て、500 μLのPBSバッファーをコネクターに通して装置をプリウェットしてから、別のシリンジからバッファーを廃棄します。このステップは不純物を除去し、押し出しを容易にします。
  10. ミニ押出機装置を100nmの細孔サイズのポリカーボネートフィルター膜で組み立てます。
    注:フィルター膜の孔径によって、リポソームの直径が決まります。
  11. シリンジの1つで500 μLのPBSバッファーを取り、フィルターにそっと押し込み、もう一方の端にある2番目の空のシリンジを満たします。押し出しを前後に3回繰り返して装置の漏れを確認し、2番目のシリンジからバッファーを廃棄します。
  12. 脂質混合物をミニ押出機に通して、PBSバッファーを交換します。次に、前後に20回押し出してSUVを形成します。小胞の多重層特性は、不十分な押し出し回数で保持される可能性があり、これはSLB形成23に影響を与えるであろう。
  13. 2番目のシリンジからSUVを収集して、より大きな粒子による汚染を減らし、1.5mLの遠沈管に移します。
    注意: シリンジが壊れた場合に備えて、シリンジをコネクタからまっすぐ取り外してください。
  14. 蛍光標識脂質の漂白を防ぐため、チューブをアルミホイルで包み、4°Cで保存してください。通常、SUVは最大7日間保管できます。

3. ナノチップ上でのSLBの形成

  1. 洗浄したナノチップを脱イオン水からピンセットで丁寧に取り出し、99.9%窒素ガスでブロードライします。
  2. ナノチップの表面洗浄をエアプラズマ処理で1時間行う。
  3. 中央のPDMSと上部のPDMSの2つのPDMSで構成されるポリジメチルシロキサン(PDMS)チャンバーでナノチップを組み立てます(図1A)。中央のPDMSは薄く(~0.5 mm)、中央に大きな楕円形の開口部があり、ナノバーパターンへの十分な露出を確保します。上部のPDMSは厚く(~4.0 mm)、大きな楕円形の開口部内に2つの小さな穴があり、液体処理用の入口と出口があります。
    1. パターンを上に向けて、チップをきれいな面に置きます。
    2. 中央のPDMSをチップでそっと覆い、パターン全体が中央のPDMSの大きな楕円形の開口部の中央領域に露出していることを確認します。
    3. 上部のPDMSを中央のPDMSで覆い、中央のPDMSの大きな楕円形の穴の領域内に2つの小さな穴を保ちます。次に、PDMSチャンバーを組み立てます。
      注:PDMSは、最も広く使用されているシリコンベースの有機ポリマーです。生体適合性があり、透明で、変形可能で、チップアセンブリや顕微鏡下でのイメージング用にカスタマイズされた形状として設計できます。さらに重要なことに、プラズマ処理後に別のPDMS層またはガラスにしっかりと共有結合することができ、SLBを調製するためのチャンバーとして適しています。このステップにより、PDMSの各層がしっかりとフィットし、ギャップや漏れが回避されます。
  4. 上部PDMSの2つの小さな穴の1つからSUVをピペットでPDMSチャンバーにロードし、室温で15分間インキュベートしてSLBを形成します。
  5. 小さな穴の片側からPBSバッファーをPDMSチャンバーにそっとピペットで入れ、もう一方の穴から綿棒で廃棄物を取り除き、バインドされていないSUVを洗い流します。次に、ナノチップ上に形成されたSLBを取得します(SLBの品質は、ステップ4.4で示され、代表的な結果のセクションで説明されているように、光退色後の蛍光回復(FRAP)によってテストされます)。
    注意: PBSバッファーをチャンバーにピペッティングするときは、気泡が注入されないように、ピペットチップがバッファーで満たされ、液面に接触している必要があります。

4. ナノチップ上に結合するSLBと曲率感知タンパク質のイメージング

注:このセクションは、実験に利用できる顕微鏡システムによって異なります。ここで、撮像を行う方法に関する全体的な指針について説明する。詳細な設定は、異なる顕微鏡セットアップ間で変更できます。

  1. 100倍(N.A.1.4)のオイル対物レンズを使用してレーザー走査型共焦点顕微鏡をセットアップします。ZENソフトウェアを開いて、脂質とタンパク質の蛍光を励起できる励起レーザーパワーを選択します。 取得モード>スマートセットアップ>テキサスレッドDHPE / EGFPを選択します。
  2. フォーカスノブでフォーカスを調整し、ナノバーのエッジが脂質チャネルの下で鋭くなるまでチップ上のナノバーを見つけます。
  3. スキャンパラメータを以下のように設定して、タンパク質を添加する前に脂質チャネルの制御画像を取得します:フレームサイズ= 512 px x 512 px(512ピクセルx 512 ピクセル、ピクセルサイズ124 nm)、 ピクセルあたりのビット = 16(16ビット深度)、 スキャン速度= 5、および 平均= 4(4回/ラインの平均モード)。
  4. FRAPアッセイは、蛍光標識された脂質二重層をランダムな単一ナノバー領域で漂白することにより実施します。
    1. 「 実験領域 」チェックボックスと 「漂白」 チェックボックスを選択します。ナノバー全体を中心に含めることができる直径5μmの円形領域を描画し(ナノバーサイズは2μm)、 実験領域に追加します。タイムラプスイメージングパラメータを次の例のように入力します: スキャン速度 = 9 および 平均化 = 1 を選択します。時系列 >期間 = 100 サイクル と 間隔 = 2 秒を選択します。次の例のように漂白パラメータを入力します:「 #画像の後に開始 」チェックボックスをオンにして、 3つの 画像を選択します。
    2. FRAPを実行するレーザーのチェックボックスを選択し、出力を 100.0%に変更します。FRAP 実験の [実験の開始] をクリックします。
      注:FRAPは、細胞分子の運動性を特徴付ける一般的な方法です。SLBの流動性が良好な場合、漂白された蛍光色素が拡散し、他の領域からの未漂白蛍光色素が拡散するにつれて、漂白領域の蛍光は徐々に回復します。
  5. タンパク質溶液をPDMSチャンバーにロードし、室温で5分間インキュベートして、SLB上のタンパク質の結合を可能にします。
    注:ナノバー湾曲SLB上でのタンパク質結合を促進する脂質組成を示すために図2G,Hで使用されているタンパク質は、74 μM GFPおよび79 μM GFP-Hisです。これら2つのタンパク質は、Hisタグの有無にかかわらず緑色蛍光タンパク質である。図4および図5の曲率センシング研究に使用したタンパク質は、16 μM Fバール、16 μM IDR FBP17、および16 μM FBAR+IDRFBP17です。これらの3つのタンパク質はFBP17のドメインであり、曲率発生器とセンサーの両方として直感的に想定される典型的なBARタンパク質です。各タンパク質容量は20μLです。
  6. ナノバーに再び焦点を合わせ、ステップ4.3を繰り返して、タンパク質曲率検出用の脂質チャネルとタンパク質チャネルの両方の画像を撮影します。
  7. ステップ4.4を繰り返して、脂質チャネルとタンパク質チャネルの両方でFRAPアッセイを実施し、タイムラプスイメージングを実行して、曲率感知タンパク質の移動度を特徴付けます。

5. ナノチップの再利用

  1. ピンセットでナノチップをつかみ、脱イオン水で満たされた50 mLビーカーでPDMSチャンバーから慎重に取り外します。
    注 : これは重要な手順です。ピンセットがナノ構造に触れないようにし、亀裂を避けるためにチップを無理に分離しないでください。
  2. ナノチップを無水エタノールで十分に洗浄し、表面に付着した有機残留物を除去します。
    注意: 無水エタノールで洗う前に、きれいなティッシュペーパーを使用して表面の水分を除去してください。
    注意: 無水エタノールは揮発性が高く、わずかに危険な化学物質です。皮膚や目との接触を避けてください。マスクと手袋を着用した状態でドラフトで使用してください。
  3. チップを多量の脱イオン水で十分に洗浄して、残留エタノールを除去します。その後、チップを99.9%窒素ガスでブロードライします。
    注:ピラニア酸は有機溶剤と激しく反応し、爆発を引き起こす可能性があるため、次のステップに進む前にチップ上のエタノールの痕跡をすべて除去することが重要です。
  4. パターン側を上に向けてチップを清潔な10mLビーカーに入れ、「ナノチップの洗浄」と同じ手順に従って再利用するためにピラニア溶液でチップを洗浄します。

6. 画像の定量化

  1. 顕微鏡で取得した画像を回転させて、ナノバーアレイがフィジーソフトウェアでのその後の分析のために垂直位置になるようにします。
  2. カスタム記述のMATLABコード「c_pillarmask_averaging」を使用して、脂質チャネルとタンパク質チャネルの両方で正方形のマスク(51ピクセルx 51ピクセル)で個々のナノバーを見つけます。
    注:このMATLABコードは、ナノチップ用に特別に設計されています。それはリンクを介してGitHubで得ることができます:https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX。
  3. MATLABコード「BarGra_avg」のmeshgrid関数によって、画像の隅にある3つのROI(5ピクセルx5ピクセル)で各画像の背景信号を減算します。この操作は、顕微鏡のセットアップまたは顕微鏡ステージ上のチップレベリングによって引き起こされる潜在的な不均一なバックグラウンドノイズを修正することを目的としています。
  4. MATLABコード「BarGra_avg」を使用して同じサイズのナノバーの平均画像を生成し、各ポイントはすべての個々のナノバースクエアマスクのそのポイントの値の平均です。フィジーのソフトウェアで平均画像の3D表面プロットを生成し、ナノバー周辺の平均信号分布を直感的に示します。ポリゴン乗数>曲面プロット>入力100を解析を選択し、シェーディング、描画軸、およびスムーズチェックボックスを選択します。
  5. 各ナノバーを2つのナノバー末端領域と1つのナノバー中心領域を含む3つの領域に分割し、MATLABコード「avg_nanobar_quantification」によってそれぞれ蛍光強度を抽出します。ナノバーROIのサイズは、「位置」ファイルを使用してナノバーの寸法に応じて調整されます。
  6. タンパク質強度をバー末端領域でMATLABコード「avg_nanobar_quantification」から抽出された脂質強度で割ると、表面積効果を除外したナノバー末端密度が得られます。
  7. GraphPad Prismで異なる濃度のナノバー末端密度をプロットして、結合曲線を取得します。 [分析] メニューを開きます。非 線形回帰 (曲線フィット) > 結合 - 飽和 > ヒル勾配関数による特定の結合 を選択して、曲線をヒル方程式に適合させ、KD 係数とヒル係数の値を計算します。
  8. 脂質とタンパク質の強度は、MATLABコード「avg_nanobar_quantification」を使用して同じ画像で取得した600 nmのナノバー中心での対応する強度に正規化されます。
  9. ナノバー末端領域で最も明るい9ピクセルの正規化されたタンパク質強度をバー中心領域で割ったものを使用して、同じサイズのナノバーでタンパク質曲率センシングを定量化し、この値は「末端対中心比」と名付けられます。正規化されたタンパク質強度の比率を使用して脂質強度を正規化し、異なるサイズのナノバーでタンパク質の曲率検出範囲を定量化し、この値は「正規化ナノバー末端密度」と呼ばれます。これらの値は、MATLAB コード 'avg_nanobar_quantification' によって計算されます。
  10. FRAP スタック イメージをフィジー ソフトウェアにロードします。FRAP 領域を選択し、ROI を生成します。 [詳細>マルチメジャー ]機能を選択して、各時間のFRAP領域の強度を測定します。グラフパッドプリズムで強度をプロットして、FRAP回復曲線を生成します。

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結果

ナノバー設計は、ナノバー幅によって定義された曲率を持つ両端に半円を含み、中心に局所的に1つのフラット/ゼロ曲率コントロールを含む正の曲率感知タンパク質のプロービングに推奨されます(図2A、B)。ナノバー上でのSLBの形成に成功すると、図2Cに示すように、ナノバー表面全体に脂質マーカーシグナルが均等に分布します。複数のナノバーからの信号は、個々のナノバー画像を平均することによって組み合わせることができるため(図2D)、異なるナノバー間のランダムな変動を最小限に抑えることができます。以前の電子顕微鏡研究は、細胞原形質膜がナノ構造全体の周りにコンフォーマルコーティングを形成していることを示した24。したがって、合成脂質二重層は、同様にナノ構造表面にも強固に付着すると考えられ、図4Eで観察される...

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ディスカッション

ここで説明するnanobar-SLBシステムは、いくつかの既存のin vitroアッセイにおける利点のユニークな組み合わせを提供します。リポソーム浮遊または沈降アッセイとして、高度に湾曲した膜へのタンパク質の優先的な結合を効率的に明らかにしますが、必要なサンプルははるかに少なく、個々のナノバーでより正確に定義された曲率を提供します8,29。また、SLiCアッセイと同時に比較するための正確な曲率を幅広く提供し、SLBは可動性であり、すべてのサイズのナノバーを連続的にしっかりとカバーするため、異なる曲率での脂質組成の変化や、光の回折限界を下回るサイズで検出できない形態学的または曲率の変化についての懸念が少ない30.Nanobar-SLBはまた、テザープリングアッセイとして湾曲した膜上のタンパク質の動的挙動を観察することを可能にするが、チューブ生成のスループットおよび光学的トラッピング操作の経験によって制限されない13

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開示事項

著者は、この研究に競合する金銭的利益がないことを宣言しています。

謝辞

ナノ構造製造とSEMイメージングをサポートしてくれた南洋ナノファブリケーションセンター(N2FC)と南洋理工大学(NTU)の破壊的フォトニックテクノロジーセンター(CDPT)、タンパク質精製のための生物科学院NTUのタンパク質生産プラットフォーム(PPP)、共焦点顕微鏡の化学生物医学工学部NTUに感謝します。この研究は、シンガポール教育省(MOE)(W. Zhao、RG112/20、RG95/21、およびMOE-T2EP30220-0009)、デジタル分子分析科学研究所(IDMxS)によって資金提供されており、研究センターオブエクセレンススキーム(W. Zhao)、ヒューマンフロンティアサイエンスプログラム財団(W. Zhao、RGY0088/2021)、NTUスタートアップグラント(W. Zhao)、 研究奨学金のための化学および生物医学工学NTUの学校(X.Miao)、および研究奨学金のための中国奨学金評議会(J.Wu)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
無水エタノールSigma-Aldrich100983
アルミ箔ダイヤモンドRN0879999FU
琥珀バイアルSigma-Aldrich27115-U
脳 PS:L-&α;-ホスファチジルセリン(脳、ブタ)(ナトリウム塩)Avanti Polar Lipids, Inc.
10 mL ビーカーショット・デュランSCOT211060804
50 mL ビーカーショット・デュランSCOT211061706
1000 mLシーカー ショット・デュランSCOT2110654082 番目の容器 
クロロホルムSigma-AldrichV800117
Cotton budsWatsons
18:1 DGS-NTA(Ni):1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[(N-(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸)サクシニル](ニッケル塩)Avanti Polar Lipids, Inc.
卵PC:L-&α;-ホスファチジルコリン(卵・鶏肉)Avanti Polar Lipids, Inc.
F-BARタンパク質生産プラットフォーム、南洋理工大学生物科学部、シンガポールタンパク質およびペプチド
F-BAR+IDRタンパク質生産プラットフォーム、南洋理工大学生物科学部、シンガポールタンパク質およびペプチド
GFPProtein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, SingaporeProteins and peptide
GFP-HisProtein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, SingaporeProteins and peptide
GraphPad PrismGraphPadV9.0.0
Hydrogen Peroxide, 30%, (Certified ACS)Thermo ScientificH325-500
IDR ヒトFBP17Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJ国立衛生研究所1.50d
レーザー走査型共焦点顕微鏡Zeiss LSM 800とAiryscan100x(N.A.1.4)オイル対物レンズ。
メタノールフィッシャー科学10010240
ミニエクスツーダー Avanti Polar Lipids, Inc. (アバンティ ポーラー リピッズ インク)610000-1EA
1.5 mL マイクロチューブGreiner616201
MATLABMathworksR2018b
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μmWhatman800309
リン酸緩衝剤 生理食塩水 (PBS)Life Technologies Holdings Pte Ltd.70013
ポリジメチルシロキサン(PDMS)ベースダウコーニングコーポレーションシルガード184
ポリジメチルシロキサン(PDMS)架橋剤ダウコーニングコーポレーションシルガード184
プラズマクリーナーハリックプラズマPDC-002-HP
クォーツナノチップ東海県アルファクォーツプロダクツ株式会社
水酸化ナトリウム シグマ・アルドリッチ795429
硫酸シグマ・アルドリッチ258105
テキサスレッド DHPE: テキサスレッド 1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン, トリエチルアンモニウム ソルトライフテクノロジーズ Pte Ltd.
T1395MPピンセットGooiPDC-002-HP
超音波クリーナーElmaD-78224
VoterxScientificIndustriesG560E
真空乾燥器NUCERITE5312
ウォーターバスJulaboTW8
840032790404840051

参考文献

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