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方法論記事

3段階G四重鎖等温指数増幅反応によるアプタマーベースのターゲット検出(英語)

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DOI:

10.3791/64342

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2022年10月6日

 ,  , 
1Aptagen LLC

この記事について

サマリー

本プロトコルは、標的を検出するための高速3段階のアプタマーベースの指数増幅アッセイの使用を実証する。サンプル調製、シグナル増幅、および発色をカバーして、カフェインよりもテオフィリンの存在を認識するこのシステムを実装します。

要約

アプタマーは、高い親和性と特異性で結合する標的認識分子です。これらの特性を利用して、シグナル生成能力を持つ他の分子を制御することができます。本明細書に記載のシステムの場合、アプタメアドメインを介した標的認識は、修飾ハンマーヘッドリボザイムのステムIIが、最初は非構造化構築物を安定化させることによって自己切断リボザイムを活性化する。シス切断RNAは、ステムIIIとステムIの接合部で作用し、2つの切断産物を生成します。より長い切断生成物は、2つの類似した触媒活性G四重鎖の等温指数増幅反応(EXPAR)をプライミングします。得られた増幅産物は、ペルオキシダーゼ還元を触媒し、これは肉眼で検出できる出力を有する比色基質の還元に共役される。本研究で説明した3部構成のシステムは、わずか15分で0.5μMのテオフィリンの存在を示す視覚的に検出可能なシグナルを生成することにより、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)などの検出モダリティを改善します。

概要

アプタマーは、典型的には、所望の標的に対する高い結合親和性および特異性を有する進化過程を通じて選択された一本鎖DNAまたはRNAである1。結合能に加えて、アプタマーは、シグナル出力機能2,3を有するモチーフに連結および制御することができ、該シグナルを増幅し、システムの感度を向上させることができる。G-quadruplex等温指数増幅反応(GQ-EXPAR)システムは、連続する成分が1つの反応容器に追加されて視覚出力を生成するときに視覚信号を現像する3つの部分からなるシステム(図1)です4。このシステムは、合理化されたワークフローを使用して、所与のサンプル中の特定の標的、ここではテオフィリンを15分以内に検出することを可能にし、目的の標的の迅速で特異的な検出を可能にする。この方法は、標的濃度の特異的定量が短時間での応答の高い特異性よりも低い懸念事項であるサンプルに対して考慮する必要があります。

自己切断を受ける構造切り替えRNA分子(リボザイム)であるアロステリックリボスイッチが初期シグナルを生成します。この構築物はハンマーヘッドリボザイムに基づいており、切断活性の調節因子としてStem IIに導入されたアプタメアドメインがあります。その自己切断機能は、そのアプタメアドメインがその標的への結合で安定化されると活性化される5。それ以外の場合、スイッチはネイティブ状態で非アクティブです。

後続の指数増幅反応(EXPAR)は、第1段階からの自己切断されたRNA鎖の放出を使用して、等温増幅反応6をプライミングします。EXPARの増幅産物はペルオキシダーゼ活性7を有し、システムの最終段階の基礎として作用する。一部の基質が過酸化物分解と連動して酸化されると、さまざまな機器で測定できる蛍光出力が生成されます。他の一般的な基質を代用して、視覚的検出用の着色生成物を製造することができる。EXPARとその増幅産物のペルオキシダーゼ活性は、2段階のシグナルエンハンサーとして作用し、従来の戦略と比較してより高いレベルへの感度を高めます7,8。

テオフィリンとカフェインの検出は、メチル基が1つしかないため、この検出プラットフォームの特異性の例として使用されています(図2)。このシステムのデモンストレーションは、少なくとも500nMのテオフィリンを視覚的に検出するための比色出力を生成します。

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プロトコル

反応成分の比容積および濃度を含むチューブ調製については、 補足表1 (反応セットアップ表)を参照してください。ここで示すプロトコルは、 材料の表で説明されているように、組み立て済みの検出プラットフォームキットを使用します。特に明記されていない限り、すべてのコンポーネントは氷上に保管する必要があります。

1.リボザイムの調製

注:主要な検出成分は、テオフィリンを認識するアロステリック(アプタマー調節)リボザイムです( 補足表2を参照)。

  1. 5 UのT4ポリヌクレオチドキナーゼ(0.5 μL、 材料の表を参照)をPCRチューブに集め、リボザイム切断産物を活性化するために使用されます。
    注:この成分は、ユーザーが酵素の正しい分注を確認できるように、最初に追加されます。
  2. 事前に調製した5xリボザイムバッファー( 材料の表を参照)1 μLを各サンプルチューブ(PCRチューブ)に追加します。
  3. 特異性を視覚的に示すために、1.5 μLの2 mMテオフィリン(ターゲット)または2 mMカフェイン(コントロール)( 材料の表を参照)を試験サンプルとして各サンプルチューブに追加します。
    注:検量線を確立するには、3.125 mMの分析対象物から始めて、0.001 mMまで5倍希釈をテストすることをお勧めします。
  4. 各サンプルチューブを5〜10回ピペッティングして完全に混合します。
  5. ターゲットに特異的なアプタメアドメインを含む600 nM RNAを2 μL加え( 材料の表を参照)、各サンプルチューブに2 μLを加えて、5 μLの試験溶液中に240 nMの最終濃度を作り、ピペッティングですばやく混合し、バックグラウンドシグナルを最小限に抑えるためにコールドブロックに置きます。
    注:リボザイムがリボザイムバッファーと結合するとすぐに自己切断反応が始まり、重要なバックグラウンドを生成する可能性があるため、リボザイムなしですべての反応を最初に準備することが重要です。.
  6. すべての反応チューブを準備したら、各サンプル(5 μL)を室温(23°C)でタイマーを使用して正確に3分間インキュベートします。インキュベーション後すぐにサンプルチューブを氷(4°C)に戻します。

2. GQ-EXPAR

  1. 3.5 μLのニッカーゼ-ポリメラーゼ酵素混合物( 材料の表を参照)を各サンプルチューブに加え、よく混合します。
    注:必要な酵素濃度は、認識配列、酵素の種類、および反応温度に依存し、それらの組み合わせは経験的に決定されました。
  2. 鋳型、ヌクレオチド、および反応バッファーを含む31.5 μLのEXPAR反応混合物( 材料表を参照)を各サンプルチューブとピペットに加えて混合します。
    注:成分濃度は、ポリメラーゼ生成物の酵素と配列に基づいて最適化されています。
  3. すべてのサンプルを調製したら、準備した各サンプル(40 μL)をタイマーを使用して55°Cで正確に5分間インキュベートします。可能であれば、サーモサイクラーでインキュベートしますが、加熱された蓋は不要です。
  4. インキュベーションステップ後直ちにサンプルチューブを氷(4°C)に戻します。

3.発色

  1. 2 μLのHemin溶液(25 uM、 材料表を参照)を各サンプルチューブに加え、よく混合します。
  2. 市販のTMB溶液58 μL( 材料表を参照)を各サンプルチューブに加え、よく混合します。
  3. 発色反応(100 μL)を室温で少なくとも3分間から最大30分間インキュベートします。
    注:(オプション)20 μLの2 M硫酸を加えることで発色を停止できます。
  4. 目でサンプルを定性的に読み取るか、硫酸を使用して発色反応を停止した場合は、450 nmの吸光プレートリーダーを使用して結果を定量します。

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結果

図 1 に示す検出プラットフォームは、アプタメアターゲット認識をサンプル調製物間の視覚的に明確な違い(ターゲットと非ターゲット、 図2)に短時間で変換します。Soukupら5 によって同定されたアロステリックリボザイムは、対照および陰性サンプルに対する標的への応答を伴うノイズの少ない配列を作成するための出発点として役立った。最適化されたコンストラクトは、30分でわずか500 nMのテオフィリンを認識することができました(図3)-ターゲットに曝露されたサンプル調製物はステップ3で青色を生成しますが、ターゲットを含まないサンプルは無色のままです。必要に応じて、これらの結果は、最初にステップ3.4に記載されているように発色反応を停止し、次に450nmで得られた生成物の吸光度を読み取って、存在するターゲットの初期濃度を測定することによって定量化できます。このプロセスの典型的な結果を 表1...

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ディスカッション

ここで提示する方法は、アロステリックリボザイムにおける最初に無秩序な二次構造との間の遷移と、シス切断ハンマーヘッドリボザイムを活性化するためにアプタメアドメインへの標的の結合によって与えられる追加の安定性を利用する。リボザイムの安定性は、標的の非存在下での触媒活性を最小化しながら、標的結合が活性構造を回復できるように調整した。さらに、EXPARと発色を促進するために必要な複数の酵素のバッファーのバランスをとるように注意する必要があります。最後に、これが3段階システムであることを考えると、インキュベーション時間と温度、および反応成分の濃度の組み合わせは、ノイズを最小限に抑えながらシグナルを最大化することは小さな課題ではないことを意味しました。

リボザイムの調製中(工程1)、アプタメアドメインへの標的結合は、自己切断リボザイムの構造を安定化させる。それにもかかわらず、リボザイムは、標的が存在しない場合でも、リボザイム緩衝液に導入されると切断することができるであろう。したがって、バックグラウンドシグナルを最小限に抑えるには、定義されたインキュベーションの準備が整うまで反応を氷上に保つこと...

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開示事項

Aptagen, LLCは、アプタマーベースの検出システムを直接体験したい人のために、GQ-EXPARデモンストレーションキットを製造および販売しています。

謝辞

この研究は、Aptagen LLCの研究開発資金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン二塩酸塩(TMB)溶液とH2O2、「MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution」PerkinElmerFOOD-1806-1000カラー現像試薬。光や大気への曝露を最小限に抑えます。以前は、BIOO Scientificカタログ番号1806.
は、Apta-beaconデモンストレーションキットでチューブ3-2として提供されていました。
5'- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3'Integrated DNA Technologies (IDT)G-quadruplex by G-quadruplex を作製するための EXPAR 用のカスタム最適化 QtQ47 DNA テンプレートです。これは、EXPARの「指数関数的」部分に使用され、ステップ3のカラーデベロップメントに使用されるDNAzymeの量を急速に増やします。テンプレートには、Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2 の EXPAR.
Part で Bst 2.0 DNA ポリメラーゼによる意図しない伸長を防ぐための 3'-ビオチンが含まれています。
5'-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3'Integrated DNA Technologies (IDT)カスタムテオフィリン認識アロステリックリボザイム配列(自己切断リボザイムは、テオフィリンのRNAアプタマードメインによって制御される)から変更されました Soukup et al.
Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632.
Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3.
5'-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-BIOTIN-3'Integrated DNA Technologies (IDT)P3切断産物によってプライミングされたG-四重鎖を生成するためのEXPAR用のカスタム最適化P3tQ49 DNAテンプレート。これは、ステップ2で、劈開製品をステップ3の発色に使用されるDNAzymeに変換するために使用されます。テンプレートには、Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2 の EXPAR.
Part で Bst 2.0 DNA ポリメラーゼによる意図しない伸長を防ぐための 3'-ビオチンが含まれています。
5x リボザイムバッファーAptagen, LLCN/A5x 組成:600 mM Tris-HCl (pH 7.5)、150 mM MgCl2、25 mM DTT。ステップ1.
で使用され、Apta-beaconデモンストレーションキットにチューブ1-4として付属しています。
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) デモキットAptagen, LLCGQ-EXPAR-TMBデモキットは、テオフィリンとカフェインという困難な低分子ターゲットを検出することにより、比色アッセイの特異性を示しています。これは、メチル基が1つだけ異なるだけです。 
Bst 2.0 DNAポリメラーゼNew England BiolabsM0537Sストランド置換活性を持つ等温増幅ポリメラーゼ。9.375 U/uL.
で調製されたニッカーゼ-ポリメラーゼミックスの一部 Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1の一部。
バッファー 3.1New England BiolabsB6003SVIAL2 uL の 10X 等温増幅バッファーと 27.5 uL のヌクレアーゼフリー水と組み合わせることで、EXPAR ミックス中の 1.11X EXPAR バッファーを生成できます。本製品は、初期のシステム開発の一部であった以前に使用されていたB7203SVIAL(非組換えBSAを除く同じ組成).
Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2の一部
カフェインSigma-AldrichC0750-100GAptamerカウンターターゲット(コントロール)、ヌクレアーゼフリー水で調製.
Apta-beaconデモンストレーションキットにチューブ1-1として含まれています。
dNTPsNew England BiolabsN0447SEXPAR反応混合物の一部.
Apta-beaconデモンストレーションキットチューブ2-2の一部。
EXPAR 反応混合物Aptagen, LLCN/A0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47、44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4)、63.5 mM NaCl、31.5 mM KCl、6.35 mM MgCl2、1.27 mM MgSO4、6.35 mM (NH4)2SO4、63.5 μg/ml BSA、0.0635 % Tween 20.
Apta-beacon デモンストレーション キット チューブ 2-2 の一部。
HeminSigma-AldrichH9039DMFに再懸濁され、最終濃度が25 uM.
Apta-beaconデモンストレーションキットにチューブ3-1として含まれています。
等温増幅バッファーNew England BiolabsB0537SVIALuL の 10x バッファー 3.1 および 27.5 µL のヌクレアーゼフリー水で EXPAR Mix.
の Apta-beacon デモンストレーションキットチューブ 2-2 部分で 1.11x EXPAR バッファーを生成します。
MgCl2Amresco (VWR)E525-500MLハンマーヘッドリボザイム補因子、自己切断に必要
Apta-beaconデモンストレーションキットチューブ1-3の一部。
MJ PTC-100 サーモサイクラーMJリサーチ(株)PTC-100インキュベーション温度を制御するサーモサイクラー。任意のサーモサイクラーまたはホットブロックを使用できます。
N、N-ジメチルホルムアミド(DMF)シグマアルドリッチ227056-100MLミンを再懸濁し、冷凍庫での保存寿命を最大化するために使用されます.
Apta-beaconデモンストレーションキットチューブ3-1の一部。
ニッカーゼ-ポリメラーゼミックスAptagen, LLCN/ANt.BstNBI (9.375 units/μL)およびBst 2.0 DNAポリメラーゼ(0.5単位/&μ;L).
Apta-beacon デモンストレーション キットにチューブ 2-1 として付属しています。
Nt.BstNBINew England BiolabsR0607SNicking酵素により、継続的な等温増幅が可能になります。0.5 U/uL.
で調製したニッカーゼ-ポリメラーゼミックスの一部 Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1の一部。
T4キナーゼバッファーニューイングランドバイオラボB0201SVIAL環状リン酸を除去するために必要な酵素のバッファー
Apta-beaconデモンストレーションキットチューブ1-4の一部。
T4ポリヌクレオチドキナーゼニューイングランドバイオラボM0201Sは、切断生成物が等温増幅反応をプライミングするために、切断後の環状リン酸を除去します.
PCRチューブとしてApta-beaconデモンストレーションキットで提供されます。
Tecan GENios FLTecanGenios-FL TWTプレートリーダーは、ステップ3の結果から吸光度信号を測定します。
TheophyllineSigma-AldrichT1633-50GAptamerターゲット、ヌクレアーゼフリー水で調製.
Apta-beaconデモンストレーションキットにチューブ1-2として入っています。
Tris-HClAmerican BioanalyticalAB14043-01000Aptamer binding buffer.
Apta-beacon デモンストレーションキットチューブ 1-4 の一部。
に代わるものです。 2 ヘ

参考文献

  1. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
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  6. Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
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  8. Nie, J., et al. Reporter-triggered isothermal exponential amplification strategy in ultrasensitive homogeneous label-free electrochemical nucleic acid biosensing. Chemical Communications. 50 (47), 6211-6213 (2014).
  9. Tabuchi, T., Yokobayashi, Y. Cell-free riboswitches. RSC Chemical Biology. 2 (5), 1430-1440 (2021).
  10. Ao, Y., et al. Integration of an expression platform in the SELEX cycle to select DNA aptamer binding to a disease biomarker. ACS Omega. 7 (12), 10804-10811 (2022).

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