方法論記事

フローサイトメトリーによる心筋B細胞の定量および分析(英語)

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DOI：

10.3791/64344

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2022年8月17日

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1Division of Cardiology, Department of Medicine, The Johns Hopkins University School of Medicine

この記事について

サマリー

ここでは、フローサイトメトリーを用いた血管内または内皮腔内の位置に基づく心筋Bリンパ球の定量と分化のためのプロトコルを報告します。

要約

Bリンパ球が心筋生理学および傷害への心筋適応の文脈において重要な役割を果たすことを示す証拠が増えています。しかし、文献は心筋B細胞の有病率に関する対照的なデータを報告しています。B細胞は、げっ歯類の心臓で最も一般的な免疫細胞の中にあるか、存在すると報告されていますが、骨髄系細胞よりも有病率が著しく低いか、非常にまれです。同様に、いくつかのグループは、急性虚血性心筋損傷後に心筋B細胞の数が増加すると記載しているが、1つのグループは、損傷心筋のB細胞数に変化がないことを報告した。心筋B細胞の有病率を評価するための共有された再現可能な方法の実装は、さまざまな研究グループからの観察を調和させ、B細胞心筋相互作用の研究の進歩を促進するために重要です。私たちの経験に基づくと、文献で報告されている一見対照的な観察結果は、マウス心筋B細胞がほとんど血管内であり、微小血管内皮に接続されているという事実に由来する可能性があります。したがって、マウス心臓から回収されるB細胞の数は、臓器をきれいにするために使用される灌流条件と使用される消化方法に非常に敏感です。ここでは、これら2つの重要な変数を特定の方法で説明する最適化されたプロトコルを報告します。このプロトコルは、マウス心筋B細胞の数の再現性のあるフローサイトメトリーベースの分析を可能にし、研究者が血管外心筋B細胞と血管内心筋B細胞を区別することを可能にします。

概要

Bリンパ球は高度に特殊化された免疫細胞であり、適応免疫応答と自然免疫応答の両方に重要な役割を果たしています1。B細胞には2つの主要な集団があります:主に胚期に産生されるB1細胞のより小さな集団と、骨髄1で成人期に産生されるB2細胞の優勢集団です。骨髄で成熟した後、B細胞は一次および二次リンパ器官に移動します。そこから、血管とリンパ管を通過するリンパ器官の間を継続的に再循環します2。B細胞は、受容体として機能する特異的抗体を表面に発現します。B細胞が受容体に結合する抗原に遭遇すると、活性化シグナルがトリガーされる可能性があります。活性化されたB細胞は、抗原が発見された組織に移動するか、骨髄に戻り、そこで抗体産生形質細胞に成熟することができます3,4。

最近、心臓にはかなりの数のB細胞が宿っていることが評価されています。げっ歯類の研究は、B細胞が胚発生の早い段階で心臓にコロニーを形成することを示しており5、心筋関連B細胞は主に血管内のナイーブなB2細胞であり、内皮に接着しており6,7、B1細胞の割合はわずかです7。不確実性の領域はまだたくさんありますが、入手可能なデータは、B細胞がナイーブ心臓と損傷への心筋適応の文脈の両方で重要な役割を果たすことを示しています。

ナイーブマウス心臓での研究では、ベースライン時に心筋B細胞が主に血管内腔に位置し、内皮に接着していることが示されています(マウス心臓B細胞の>95%が血管内腔にあることがわかりました)。これらのB細胞は、末梢血から単離された循環B細胞のものとは異なる遺伝子発現パターンを有することがわかった。B細胞欠損動物および同系対照からのナイーブ心臓の分析は、B細胞を欠く動物がより小さく、駆出率が高いことを発見しました6。これらすべての証拠は、B細胞が心筋の成長および/または心筋機能を調節する可能性があり、間質性だけでなく血管内のB細胞もそのような観察の原因である可能性があることを示唆しています。B細胞は、心筋常在マクロファージの表現型を調節することも見出された8。

いくつかの研究は、B細胞が損傷に対する心筋適応の文脈において重要な役割を果たすことを示している8、9、10、11、12、13。B細胞は、おそらくCXCL13-CXCR5依存性機構を介して、損傷した心臓に一過性に蓄積する11,13。そこから、B細胞は、サイトカインを介した単球の動員を含むいくつかのメカニズムを通じて、有害な心臓リモデリングを促進します9,12。さらに、B細胞は、いくつかのメカニズムを介して心臓損傷の拡張および有害な心臓リモデリングを促進することができる心臓タンパク質に対する抗体を産生することができる14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25.B細胞はまた、IL-1010の分泌を介して損傷した心臓に保護効果を発揮することができる。

ナイーブで負傷した心臓におけるB細胞の役割を調査するグループの数が増えるにつれて、心筋B細胞を適切に定量および評価し、すでに文献に現れ始めている矛盾を回避するための共有プロトコルを定義することがますます重要になっています。これまでのところ、B細胞は実際にげっ歯類の心臓7で最も一般的な免疫細胞の1つであり、骨髄系細胞よりも著しく低い有病率で存在すると報告されています26,27、または非常にまれです28。同様に、いくつかのグループは、急性虚血性心筋損傷後に心筋B細胞の数が増加すると記載している7,9,13が、1つのグループは、損傷心筋のB細胞数に変化を報告しなかった29。心臓免疫細胞の研究では、灌流条件の詳細が説明されることはめったになく、消化条件に関するコンセンサスはありません。げっ歯類の心臓ではB細胞の大部分が血管内であり、心筋からの免疫細胞の抽出は使用する消化方法に大きく依存するため、文献で報告されている違いは臓器灌流と組織消化の違いの結果である可能性があります。

ここでは、灌流および消化条件を最適化することでB細胞回収の収率を最大化し、血管内心筋B細胞と血管外心筋B細胞の識別を可能にする、マウス心筋B細胞のフローサイトメトリーベースの定量の詳細な方法を示します6。このプロトコルは、血管内免疫細胞と間質免疫細胞とを区別する他の類似のプロトコルの適応および最適化である28、30、31。

このプロトコルでは、心筋灌流を標準化して、微小血管内皮に接着した生物学的に関連するB細胞を除去することなく、血管内空間に浮遊するB細胞を排除します。さらに、血管内免疫細胞と間質免疫細胞を区別するための抗体の静脈内注射の使用を説明した以前のプロトコルに基づいて32、B細胞が表面マーカーB220を発現するという事実を利用して33、動物の犠牲および心臓灌流の直前にB220特異的抗体の血管内注射を通じて血管内心筋B細胞を区別する方法を示します。このプロトコルは、ナイーブで負傷した心臓の心筋B細胞の分析を含めることに関心のある科学者の研究に関連しています。このプロトコルの広範な実装は、研究グループ間の不一致を減らし、血管内および血管外の心筋B細胞プールの変化の分析を可能にし、したがって心臓免疫学の分野における発見の進歩を強化します。

要約すると、このプロトコルは、フローサイトメトリーを介して心筋B細胞を定量および分析すると同時に、血管外空間と血管内空間に位置する細胞を区別するための最適化されたワークフローを表しています。

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プロトコル

この原稿に記載されているすべての実験は、ジョンズホプキンス大学医学部のIACUCの承認を得て実施されました。

1. 事前準備

  1. 表 1 の説明に従って、FACS バッファーを準備します。
  2. 動物を安楽死させるのに十分なCO2 があることを確認してください。
  3. 解剖スペースを準備します(ベンチパッドを置き、テープと解剖ツールを近くに置きます)。
  4. 15 mLチューブにラベルを付け、各チューブにカルシウムとマグネシウムを含むHBSSを3 mL入れ(材料の表を参照)、氷上に置きます(心臓ごとに1本のチューブと、参照群/フローサイトメトリーコントロール用に1本追加)。また、小さな(35 mm)ペトリ皿にHBSSを入れます。
  5. 温度制御されたシェーカーの電源を入れ、37°Cに設定し、遠心分離機を4°Cの温度で事前に冷却します。
  6. シリンジポンプを準備し、流量を3mL/minに設定します。20 mLシリンジにHBSSを満たし、チューブラインにバッファーをプライミングし、気泡を取り除きます。

2.血管内B細胞染色(in vivo)

  1. C57BL/6J系統の12週齢の雄マウスの体重を測定します。3/10 ccインスリン注射器に100 μLのB220抗体希釈液(1:10、PBS中)をロードします。光から保護するためにシリンジをアルミホイルで覆います。
  2. 1匹のマウスを麻酔します。
    1. 2%2,2,2-トリブロモエタノールを400mg / kgの用量で腹腔内注射し、10〜20分待ちます。.
      注意: マウスの呼吸と動きを監視します。マウスの動きが止まったら、つま先をつまんで痛みを刺激します。離脱反射がないことは、適切な麻酔を示しています。
    2. 20分以内に適切な麻酔が達成されない場合は、100 mg / kgの追加麻酔薬を投与し、マウスの動態、離脱反射、および呼吸の評価を5分ごとに行う必要があります。.
  3. マウスを片側に傾けたベンチパッドの実験台に置き、背中の皮膚をそっと引き下げ、体をベンチに軽く押し付けて目を突き出します。
  4. ステップ2.1の希釈B220抗体を眼窩後注射により注入する。
    1. マウスの頭矢状面から45°で注射器を目に導入します。溶液をゆっくりと注入します。抵抗が感じられた場合は、シリンジを取り外して再度入力してください。2分間待ちます。
      注:インキュベーション時間を長くすると、注入された抗体が血管系外に拡散する時間を与えるため、血管内B細胞と血管外B細胞を区別する能力が危険にさらされます。
  5. IACUCの規制に従ってマウスを安楽死させます。
    1. 安楽死チャンバーへのCO2 フローを0.5 L / minの速度、またはチャンバーのサイズに基づく推奨流量で開きます。
    2. マウスを推奨時間チャンバーに入れ、呼吸していないことを確認します。それを取り除き、安楽死の二次的な方法として頸部脱臼を行います。
    3. マウスが安楽死したら、速やかに臓器摘出と灌流に進みます。

3.ハートコレクション

  1. 胸の開口部。
    1. 上腹部で鉗子でマウスの皮膚を保持します。ハサミを使って皮膚に2mmの開口部を作り、鉗子を使って皮膚を剥がすと、胸と腹部の筋膜層、光沢のある半透明の層が現れます。筋膜と腹膜を通して上腹部を切って腹壁を開き、剣状突起を明らかにします。止血鉗子を使用して剣状突起をクランプします。
    2. はさみで、両側の中央鎖骨線の高さで胸壁を垂直に切り込み、前胸壁を持ち上げて縦隔の内容物を明らかにし、止血鉗子を重りとして使用して開口部を維持します。
  2. 心臓の灌流と抽出。
    1. 鉗子を使用して、心臓を取り巻く脂肪や胸腺組織を取り除きます。
    2. 鉗子を使用して大動脈を後ろからしっかりと保持します。シリンジ針(25 G)を心臓の頂点に導入します。3 mL /分の速度で3 mLのHBSSで灌流します。
      注意: 灌流を監視します。肝臓がいっぱいになり、冠状血管内の血液が完全に除去されます。安定した流れを維持するために、1 mL /分に校正されたシリンジポンプの使用をお勧めします。
    3. ハサミを使って大動脈を切り、心臓を取り出します。残っている血液を取り除くためにHBSSでペトリ皿の心臓を洗います。はさみと鉗子を使用して、脂肪、結合組織、胸腺を取り除き、心臓を乾燥させます。孤立した心臓の重さを量り、ミリグラム単位で体重を書き留めます。室温で心臓を刃で小片(1〜2 mm)にミンチします。
      注:成体マウスの心臓の体重は0.090〜0.210mgです。
    4. 心臓組織の質量を測定し、消化するミンチ心臓60 mgを3 mLのHBSSを含む15 mLチューブに入れます。残りの心臓組織を保持し、「参照対照組織」とラベル付けされたチューブに入れます。これは、生死シグナルと自家蛍光の補償制御に使用されます。

4.心臓の消化と細胞染色

  1. ミンチ組織を含む各チューブに酵素を追加します( 表1を参照)。DNase 1 0.5 μL/mg (心臓組織 60 mg に対して 300 単位)、コラゲナーゼ II 0.5 μL/mg (心臓組織 60 mg に対して 625 単位)、およびヒアルロニダーゼ 0.2 μL/mg (心臓組織 60 mg に対して 50 単位) をチューブに加えます。
  2. 消化反応をシェーカーに300rpmで30分間入れます。シェーカーラックを約25°の傾斜に調整します。
  3. 15 mLの反応チューブのそれぞれに7 mLのHBSSを加え、加速と破壊を中程度または低速に設定して、250 x g で4°Cで5分間遠心分離します。上清をデカントし、各ペレットを5 mLのACK溶解バッファーに再懸濁して赤血球を除去します。ACK溶解バッファー中で室温で5分間インキュベートします。
  4. 各チューブに10 mLのPBSを加えて混合し、40 μmのストレーナーで50 mLのチューブにろ過します。すべての破片がフィルターチャンバー内にあることを確認してください。フィルターチャンバー内に完全に吊り下げられるまで、シリンジプランジャーでフィルターの破片を粉砕します。
  5. 容量が心臓あたり25mLに達するまで、フィルターを通してPBSを追加します。これにより、懸濁細胞がフィルターを通過できるようになります。リファレンスコントロール組織チューブにさらに25 mLのPBSを追加し、容量を異なるチューブ(それぞれ25 mL)に分割します。チューブの1つに「染色されていない」というラベルを付け、もう1つに「生きている死者」というラベルを付けます。250 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
    注:この時点で、生きている死んだ染色の希釈を準備します(希釈:1x PBSで1:500)。
  6. 上清をデカントし、ペレットを100μLのPBS中の未染色チューブに再懸濁し、他の各ペレットを100μLの生死染色希釈液に再懸濁する。氷の上で暗闇の中で30分間インキュベートし、アイスバケットをアルミホイルで覆います。
  7. 各サンプルに500 μLのFACSバッファーを加え、40 μmのフィルターを通して標識されたFACSチューブに移します。FACSチューブを250 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上澄み液を捨てる。ペレットを500 μLのFACSバッファーに再懸濁します。
  8. 50 μLのFcブロッキング溶液( 表1を参照)を、染色されていないチューブとライブデッドチューブを除く各チューブに追加します。混合して5分間インキュベートします。
  9. 50 μLの抗体混合溶液( 表1を参照)を、未染色チューブとライブデッドチューブを除く各チューブに加え、暗所で30分間インキュベートし、アイスバケットをアルミホイルで覆います。
  10. 各チューブに2 mLのFACSバッファーを加え、250 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を除去し、300〜500μLのFACSバッファーに再懸濁します。

5. フローサイトメトリー

  1. 計測器制御の設定を行います。
    注:このプロトコルでは、サンプルは4レーザーCytek Auroraフローサイトメーターで分析されます。別の適切なフローサイトメーターを使用して、目的のマーカーを検出することができます。
    1. 計測器制御ソフトウェアを開きます( 材料表を参照)。ウィンドウの上部で、[ 取得 ]タブを選択し、[ 新規+]をクリックします。 [新しい実験の作成] というウィンドウが表示されます。
    2. [ライブラリ] セクションの [フィルターに入力] フィールドに、「PE」、「PerCP-Cy5.5」、「BV421」、「Alexa Fluor 700」、「ゾンビ アクア」と入力し、それぞれ入力後に [追加] をクリックします。蛍光色素の名称は右側に表示されます。次に、[次へ]をクリックして[グループ]タブに進みます。
    3. [ グループ ] タブで、チューブ付きのシンボルをクリックして、解析用のハートを追加します。
    4. +参照グループをクリックすると、ウィンドウが表示されます。蛍光タグ列でゾンビアクアを選択し、コントロールタイプ列でセルを選択し、[保存]をクリックします。
    5. [ マーカー>次へ] タブをクリックします。蛍光色素の名前が表に表示されます。各蛍光色素カラムの最初の行に対応する細胞マーカーを入力し、PerCP-Cy5.5の場合はCD45と 入力します。BV421のためのCD19;CD11b for Alexa Fluor 700;PEのためのB220;そしてゾンビアクアのために生きている死者。
    6. [ 次へ ] を 2 回クリックして、[ 集録 ] タブに移動します。実験グループの [記録するイベント ] に「10,000,000」と入力し、参照グループの行の同じフィールドに「200,000」と入力します。「 保存して開く」をクリックします。その他の設定はデフォルトのままで、[ 停止時間は 10,000]、 [停止ボリューム] は3,000のままにする必要があります。
    7. 左下の [機器コントロール]をクリックします。 電圧 をFSC-50、SSC-175、SSC-B-175に設定します。次に、 取得コントロールを選択します。[ 流量 ] オプションで、ドロップダウン メニューから [高 ] を選択します。
  2. サイトメーターで参照サンプルを取得し、ソフトウェアで解凍します。
    1. 染色されていない心臓チューブをボルテックスし、サンプル注入ポート(SIP)にしっかりと置きます。緑色のインジケーター矢印が正しいサンプルを指していることを確認してから、サイトメーターソフトウェアのデータ収集コントロールパネルで開始をクリックし、イベントが記録されるまで待ちます。生きている死者で染色された心臓組織についても同じことを行います。
    2. [アンミックス] メニューを選択し、次のコントロールを設定します。
      1. ライブラリの列で、PE、PerCP-Cy5.5、BV421、Alexa Fluor 700のチェックボックスをオンにします。同じ列でゾンビアクアがオフになっていることを確認します。下部にある、蛍光 タグとしての自家蛍光のオプションをチェックします。
      2. [ 次へ ] をクリックして、[ 陽性/陰性の母集団の識別 ] タブに進みます。このタブには、FSC-A対SSC-B-Aのプロットが表示されます。ポリゴンのポイントをクリックしてドラッグし、FSC-A 軸で 1.0 M から 4.0 M の間、および SSC-B-A 軸で 0.2 M から 3.0 M の間の領域を選択します。
      3. 右の次のプロットでは、V5-AがX軸に表示されます。ゲートを移動して、右端のピークの半分を正として選択し、プロットの左側の領域を負として選択します。参照グループ - 染色されていないというタイトルのプロットで、同様の範囲の集団を選択します。このためには、無染色の正負を設定する必要はありません。
  3. 実験サンプルの取得。
    1. 個々のマウスのサンプルを含む各チューブについて、チューブをボルテックスし、SIPにしっかりと置きます。緑色のインジケーター矢印が正しいサンプルを指していることを確認してから、サイトメーターソフトウェアの収集コントロールパネルで開始をクリックし、イベントが記録されるまで待ちます。
  4. ゲーティング戦略。
    1. デフォルトの混合されていないワークシートタブを選択します。上部のドットプロットツールを使用して、FSC-A対SSC-Aプロットを作成します。ポリゴン選択ツールを使用して、FSC-A 軸で 0.4 M を超えるイベント、SSC-A 軸で 0.8 M を超えるイベントを選択します。この選択をダブルクリックすると、新しいプロットが表示されます。
    2. 新しく作成したプロットから、X軸ラベルを右クリックし、AF-Aを選択します。Y軸ラベルを右クリックして、ライブデッド染色を選択します。上部の長方形選択ツールをクリックし、下のライブデッド信号に対応するライブデッド軸上の105未満のすべてのイベントを選択します。この選択をダブルクリックすると、新しいプロットが表示されます。
    3. 新しいプロットで右クリックして、X軸に PerCP-Cy5.5-A を選択し、Y軸に SSC-A を選択します。 長方形選択ツールを使用して、CD45陽性細胞に対応するPerCP-Cy5.5-A軸上の104 より大きいイベントを選択します。選択範囲をダブルクリックすると、新しいプロットが表示されます。
    4. 新しいプロットで、右クリックしてX軸にFSC-Aを選択し、Y軸にFSC-Hを選択します。ポリゴン選択ツールを使用して、FSC-A 値と SSC-A 値が同じトレンドに従うイベントを選択します。これにより、細胞ダブレットが除去され、選択の集団はCD45 +集団と呼ばれます。選択範囲をダブルクリックして、CD45+母集団の新しいプロットを表示します。
    5. CD45+母集団プロットを右クリックして、X軸の BV421 とY軸のSSC-Aを選択します。 ポリゴン選択ツールを使用して、 BV421 軸の右側の人口を選択します。これがB細胞集団です。この母集団を2回ダブルクリックして、B細胞母集団で2つの新しいプロットを作成します。
      1. 右クリックして、X軸にPE-A、Y軸にBV421-Aを持つ最初のBセルプロットを設定します。 右側の集団は血管内B細胞に対応し、左側の集団は間質性B細胞を表します。ポリゴン選択ツールを使用して、両方を選択します。
      2. 右クリックして、Alexa Fluor 700-A をX軸に、 SSC-A をY軸に設定した2番目のB細胞プロットを設定します。左側の集団はCD11b-細胞に対応し、右側のイベント(存在する場合)はCD11b+細胞に対応します。
      3. 各選択項目を右クリックし、[ ゲートのプロパティ]をクリックします。[ カウント ]と [%親 ]をクリックして、サイズとパーセンテージを表示します。さらにデータ分析するために、イベントの数とパーセンテージを記録します。

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結果

取得が完了し、すべてのイベントが収集されたら、標準的なフローサイトメトリーの実践に従ってデータを分析する必要があります。分析の焦点は、各実験の個々の目標によって異なります。この場合、血管内および血管外のB細胞の定量を追求し、組織1mgあたりの細胞数として表した。

スペクトルサイトメーターを使用する場合は、免疫細胞に対応する範囲にないサイズの破片を除去するための最初のゲーティングから分析を開始し、その後、生死染色+シグナルを除去することをお勧めします。これにより、白血球に対応するCD45陽性細胞のきれいな集団の検出が可能になる(図1)。ダブレットの除去後、ナイーブな無傷の心臓では、CD45+細胞の約20%がCD19+ B細胞になると予想されています(図2A、この代表的な実験では18.1%B細胞)。これらの細胞のうち、平均して5.5%が間質腔に位置し、94.5%が血管内腔に位置しています(図2B)。心臓で見つ...

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ディスカッション

ますます多くの証拠が、B細胞が心筋生理学および心筋のリモデリング/損傷への適応の文脈で重要な役割を果たすことを示しています7、8、9、10、11、12、13、36。フローサイトメトリーは、あらゆる組織の免疫細胞集団を研究するための優れたツールであり、心臓のB細胞に焦点を当てたあらゆる研究にとってほぼ必須のツールです。

B細胞と心臓に関する新たな文献は、心臓のB細胞の数や損傷に伴う心筋B細胞数の変化など、非常に基本的な側面に関する対照的な発見をすでに報告し...

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開示事項

Luigi Adamoは、心不全の治療のための免疫調節分子の開発に焦点を当てた会社であるi-Cordis、LLCの共同創設者であり、B細胞調節薬ピルフェニドンの誘導体に特に関心を持っています。残りの著者は宣言する矛盾はありません。

謝辞

この研究は、ルイジ・アダモに授与されたNHLBI助成金5K08HLO145108-03および1R01HL160716-01によって資金提供されました。

この研究の開発に使用されたオーロラフローサイトメーターは、NIHグラントS10OD026859によって資金提供されました。JHUロスフローサイトメトリーコアのサポートに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Alexa Fluor 700 抗マウス/ヒト CD11b 抗体101222BioLegend100 µG 200 &マイクロ;L
(CellTreat 29481) セルストレーナー、40 & マイクロ;m, BlueQBIAP303Southern Labware
0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube1605-0000SealRite, USA Scientific
0.9% Sodium Chloride Injection, USP114-055-101Quality Biological0.90%
1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube1615-5500SealRite, USA Scientific
10 & micro;L目盛り付きTipOneフィルターのヒント11213810USA Scientific
1000 & micro;L 目盛り付き TipOne フィルターチップ11267810USA Scientific
15 mL 遠心分離チューブ、プラグシールキャップ、ポリプロピレン、RNase/DNase-free430052Corning
1 ウェイストップバルブ、ポリカーボネートSVPT951ECT 製造
2,2,2-トリブロモエタノールT48402Sigma-Aldrich
200 µL 目盛り付き TipOne フィルターチップ11208810 USA Scientific
3 ウェイストップバルブ、ポリカーボネートSVPT953ECT 製造
5 mL ポリスチレン丸底チューブ、12 x 75 mm スタイル352054ファルコン、コーニングブランド
50 mL 遠心分離チューブ、プラグシールキャップ、ポリプロピレン、RNase-/DNase-フリー430290コーニング
ACK (アンモニウム-塩化カリウム) 溶解バッファー118-156-101品質 生物学的浸透圧:290 + または -5% mOsm/Kg H20
アダプター 4x50ml、ローター A-4-63 の 250 mL 長方形バケット用5810759005
15 mL 遠心分離チューブ用 アダプター、アダプターあたり 9 チューブ、ローター モデル A-4-62 で使用するための円錐底22638289Eppendorf
15個の丸底チューブ用アダプター 2.6 –7 mL、ローター A-4-6222638246Eppendorf
アルミ ホイル 12 インチ x 75 フィート ロール .0007UPC 109153レイノルズ ラップ
麻酔導入チャンバー - マウスRWD-AICMV-100コンダクト サイエンス
BD ルアー スリップ チップ シリンジ 針付き 25 G x 5/8 インチ、滅菌済み、単回使用、1 mL309626BD Becton, Dickinson and Company
Brandzig 超微細インスリン注射器 29G 1cc 1/2" 100パックCMD 2613Brandzig
ブリリアント バイオレット 421 抗マウス CD19 抗体115537BioLegend50 µg/mL
CAPS フローチューブ用 ストレーナメッシュ付き 35 & micro;m、12 x 75 mmチューブ用デュアルポジション、滅菌T9009Southern Labware
Carbon Dioxide USP E CGA 940 CD USPEAirGas USA
Cole-Parmer Essentials 低形状ビーカー、ガラス、500 mLUX-34502-46Cole-Parmer
コラゲナーゼ 2LS004176Sigma-Aldrich
コネクタ 真鍮 クロムメッキ 1/4" メス NPT x 1/4" バーブY992611-AGAirGas USA
Cytek Aurora Flow CytometerCytek Biosciences
Diss 1080 ニップル 1/4 BARB CPM-08-12AirGas USA
DNase I - 40,000 UD4527Sigma-Aldrich
Easypet 3 - 電動ピペットコントローラー4430000018Eppendorf
Electronic Balance, AX223/E30100606Ohaus Corp.
エッペンドルフ 5810R 遠心分離機5810Rエッペンドルフ
・エッペンドルフ・リサーチ プラス 1チャンネル可変ピペットエッペンドルフ
FlowJo 10.8.1BD ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー
グレイシャーブランド、三重密度アイスパン (IPAN-3100)Z740287ヒースロー・サイエンティフィック
HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]14025076gibco1x
ヒアルロニダーゼH3506Sigma-Aldrich
Kelly 止血剤、ストレート13018-14ファイン サイエンス ツール
ルアー スリップ シリンジ 滅菌、単回使用、20 mL302831BD ベクトン、ディキンソン アンド カンパニー
M1 調整 Reg 0-100 PSI/CGA940M1-940-PGエアガス USA
マッケッソン アンダーパッド、中程度4033-CS150McKesson
Navigator 多目的ポータブル天びんNV2201オーハウス
PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]10010023gibco1x
PE 抗マウス/ヒト CD45R/B220 抗体103208BioLegend200 µg/mL
PerCP/Cyanine5.5 抗マウス CD45 抗体103132BioLegend100 µg 500 uL
ペトリ皿、積み重ね可能 35 mm x 10 mm 滅菌ポリスチレンFB0875711YZFisher Scientific
Pkgd: Diss 1080 ナット/CO2/CO2-02M08-1AirGas USA
強力な 6 ワット LED デュアル グース ネック イルミネーターLED-6WAmScope
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm)305122BD Becton, Dickinson and Company
精製ラット 抗マウス CD16/CD32 (マウス BD FC ブロック) クローン 2.4G2 (RUO)553141BD Becton, Dickinson and Company Biosciences0.5 mg/mL
R 4.1.1R Foundation
Razor Blades9501250000Accutec Blades Inc
レギュレーター 分析 2 段階 0-25 psi 送達 CGA320 3500 psi インレットY12244A320-AGAirGas USA
ローター A-4-62、長方形バケツ x 4 x 250 mL を含む ローターA-4-62エッペンドルフ
血清ピペット、プラグ付き、10 mL、滅菌済み、非発熱性/エンドトキシンフリー、非細胞毒性、1 個/ブリスター86.1254.001Sarstedt AG &Co KG
シグマ ラベル テープL8394Sigma-Aldrich
SpectroFlo 3.0.0Cytek Biosciences
Spex VapLock ルアー フィッティング、PP、ストレート、オス ルアー ロック x 1/8" ホース バーブ; 1/EAMTLL230-6005Spex
Std 壁ラボ チューブ、サイズ S2、エクセロン、1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" 壁 x 50' ロングCG-730-003エクセロン研究所
針なしシリンジPP / PE、3 mLZ683566 Millipore Sigma
リンジポンプ55-1199(95-240)Harvard Apparatus
Thomas 3チャンネルアラームタイマー TM105009371W13トーマスサイエンティフィック
チューブラック、12 ポジション、5.0 mL と 15 mLチューブと6本で25 mLおよび50 mLチューブ、ポリプロピレン、番号付きポジション、オートクレーブ可能30119835Eppendorf
Tube Rack、12 ポジション、5.0 mL と 15 mLチューブ、ポリプロピレン、番号付きポジション、オートクレーブ可能30119827Eppendorf
TYGON R-3603 Laboratory Tubeing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in.T8913 (ミリポアシグマ)Tygon, Saint-Gobain
Vortex-Genie 2SI-0236Scientific Industries, Inc.
89259-946ガイドピン付きVWR解剖鉗子VWR
VWR解剖はさみ、シャープチップ、4½「82027-578Avantor、VWR
VWR Incubating Orbital Shaker、Model 3500I12620-946Avantor、VWR
Zombie Aqua Fixable Viability Kit423102BioLegend
シ湾曲した先端アバンターを備えた、

参考文献

  1. Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease. Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).
  2. Gowans, J. L., Knight, E. J. The route of re-circulation of lymphocytes in the rat. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).
  3. Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes. Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).
  4. Tanaka, T., et al. Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).
  5. Rocha-Resende, C., et al. Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs. JCI Insight. 5 (16), (2020).
  6. Adamo, L., et al. Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart. JCI Insight. 5 (3), 139377(2020).
  7. Adamo, L., et al. Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury. JCI Insight. 3 (11), (2018).
  8. Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).
  9. Zouggari, Y., et al. B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction. Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).
  10. Wu, L., et al. IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).
  11. Heinrichs, M., et al. The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).
  12. Sun, Y., et al. Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice. Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).
  13. Yan, X., et al. Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).
  14. Iwata, M., et al. Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo. Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).
  15. Jahns, R., et al. Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy. The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).
  16. Christ, T., et al. Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).
  17. Jane-wit, D., et al. Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis. Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).
  18. Ludwig, R. J., et al. Mechanisms of autoantibody-induced pathology. Frontiers in Immunology. 8, 603(2017).
  19. Haudek, S. B., et al. Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).
  20. Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).
  21. Zhang, M., et al. The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).
  22. Zhang, M., et al. Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).
  23. Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function. Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).
  24. Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy. The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).
  25. Caforio, A. L. P., et al. Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases. European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).
  26. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
  27. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).
  28. Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
  29. Horckmans, M., et al. Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction. Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).
  30. Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).
  31. Bajpai, G., Lavine, K. J. Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens. Journal of Visualized Experiments. (154), e60015(2019).
  32. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
  33. Coffman, R. L., Weissman, I. L. B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family. Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).
  34. Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. B-1 B cell development in the fetus and adult. Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).
  35. Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure. Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).
  36. Zhao, T. X., et al. Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study. Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).
  37. Kushnir, N., et al. B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice. Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).

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