低分子細胞外小胞のハイスループット単離および精製のためのフローサイトメトリーソーティングパラメータの最適化(英語)

Summary

このプロトコルは、エアスプレーノズルのサイズ、シース液の圧力、サンプルフロー圧力、電圧、ゲイン、およびトリガーしきい値パラメータを最適化することにより、小さな細胞外小胞の迅速かつサイズ固有の分離方法を提供します。

Abstract

小さな細胞外小胞(sEV)は、すべての細胞タイプから放出され、タンパク質、DNA、およびRNAを運びます。シグナル伝達分子は、細胞の生理学的および病理学的状態の指標として役立つ。しかし、sEVの分離には標準的な方法がないため、下流のバイオマーカーの同定や薬物介入研究ができません。この記事では、フローセルソーターによる50-200 nm sEVの分離と精製のための詳細なプロトコルを提供します。このために、50μmのノズルと80psiのシース液圧を選択して、良好な選別速度と安定したサイドストリームを得ました。標準サイズのポリスチレンミクロスフェアを使用して、100、200、および300 nmの粒子の集団を見つけました。電圧、利得、順方向散乱(FSC)トリガスレッショルドをさらに最適化することで、sEV信号をバックグラウンドノイズから分離することができます。これらの最適化は、FSC対側方散乱(SSC)のみを使用してsEVの代表的な母集団を取得できるようにする重要なソート設定のパネルを提供します。フローサイトメトリーベースの単離法は、ハイスループット分析を可能にするだけでなく、バイオマーカー発現に基づくsEVの同期分類またはプロテオーム解析を可能にし、多くのダウンストリーム研究アプリケーションを開きます。

Introduction

細胞はさまざまなサイズの細胞外小胞(EV)を放出し、細胞間コミュニケーションに重要なシグナル伝達分子と膜封入体をもたらします¹。異なるサイズのEVも異なる生物学的役割を果たし、50〜200nmのsEVはRNA、DNA、およびタンパク質を正しい細胞外位置に正確に分配することができます。sEVはまた、免疫監視、幹細胞維持、血液凝固、組織修復などの正常な生理学的プロセスの調節だけでなく、腫瘍の進行や転移などのいくつかの疾患の根底にある病状を含む、それらの分泌メカニズムを決定するのに役立ちます^2,3。sEVの効果的な分離と分析は、バイオマーカーを特定し、将来の薬物介入を設計するために重要です。

sEVの臨床応用に関する継続的な研究により、sEVの分離方法はより高い要件を提唱しています。sEVのサイズ、ソース、内容の不均一性、および物理化学的および生化学的特性における他のEVとの類似性により、sEVを分離するための標準的な方法はありません^4,5。現在、超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、ポリマー沈殿、および免疫親和性捕捉が最も一般的なsEV分離方法です^6<....

Protocol

1. 細胞培養

1. 10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)の培養培地を調製する。ヒト膵臓がん細胞PANC-1を75 cm² の培養フラスコ内で1 x 10⁶ 細胞/mLの密度で培養します。培養物を5%_CO2と共に37°Cでインキュベートする。
2. 顕微鏡観察下で細胞密度が75%〜80%に達したときに細胞を継代培養する。培地を除去し、3〜5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS、0.01 M、pH 7.2〜7.4)で2回すすぎます。
3. 溶液を廃棄し、1〜2 mLのトリプシン-EDTA溶液を加え、細胞が丸くなり、顕微鏡下で培地に懸濁するまで細胞を剥離させます。新鮮な培地を加え、吸引し、15 mLの培養液と共に75^cm2 の培養フラスコに分散させる。1:2から1:4のサブ栽培比を使用してください(推奨)。
   注:すべての操作は、細胞の汚染を避けるためにバイオセーフティキャビネットで行われます。

2. 培地回収

1. 細胞を5%_CO2と共に37°Cで48時間インキュベートする。細胞上清(90 mL)を2本の50 mL遠沈管に集め、300 x g で4°Cで10分間遠心分離します....

Results

実験プロトコルのフローチャート図を 図1に示します。この方法では、標準サイズのポリスチレンミクロスフェアを粒度分布の参照標準として使用しました。特定の機器パラメータ条件下では、対数形式を使用して、粒子信号はFSC対SSCプロットのバックグラウンドノイズと明確に区別できました。ゲーティング戦略を 図 2 に示します。R4、R5、およびR6は、それぞれ100nm、200nm、および300nmの微小球の位置を指す。R7は50nm未満の電子ノイズの検出限界であり、R8は50〜200nmの粒子の位置範囲です。

PANC-1細胞由来のEVs混合物の粒度分布は、超遠心後40-400nmの広い範囲にありました(図3)。50-200 nmのsEVを単離および精製するために、フローサイトメトリーソーティングを実施し、標準的なミクロスフェアの位置に応じて特定のサイズのsEVを取得しました(

Discussion

このプロトコルは、NTAによって検証されたフローセルソーターを使用して、指定された粒子サイズ50〜200nmのsEVを分離および精製するための最適化された方法を概説しています。この方法は、大型^EV22に包まれた無関係な生体分子からの干渉を回避し、均一な粒径と高純度のsEVを得るというボトルネックの問題を解決した。フローサイトメトリーでは、毎秒100,000個の粒子を捕捉し、毎秒70,000回の選別決定を行うことができ、高速でハイスループットな分析が可能になり^17、時間を大幅に短縮し、sEV粒子の不均一性を反映します。さらに、このフローサイトメトリーベースのプロトコルは、特定のサイズのEVの亜集団に対する個々の関心に基づいてカスタマイズすることができます。代替ゲート範囲を使用して、エアスプレーノズル、シース液圧力、サンプル流量圧力、トリガーしきい値パラメータなど、上記と同じ機器パラメータで関心のある母集団を識別および分離できます。

この方法の技術的困難は、特にバックグラウンドノイズと区別.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
遠心分離管	ベックマンコールター	344058
培養フラスココー	ニング
ダルベッコ改変ワシ培地	Corning Cellgro	10-013-CV
ウシ胎児血清	SUER	SUER050QY
Flow 細胞選別機	ベックマン・コールター	モフロ アストリオスEQ
ヒト膵臓がん細胞、PANC-1	NA		NA PANC-1 細胞は、浙江大学生命科学部の Weijun Yang 教授から寄贈されました
レーザー粒子サイズとゼータ電位アナライザー	Malvern	Zetasizer Nano ZS 90
リン酸緩衝液 生理食塩水	Gibco	C20012500BT
ポリスチレン蛍光マイクロスフェア	ベックマン・コールター	6602336
透過型電子顕微鏡	JEOL	JEM-1200EX
トリプシン-EDTA溶液	Gibco	1713949
Ultra rainbow fluorescent particles	ベックマン・コール	ターB28479
超遠心分離機	ベックマン・コール	ターOptima-L80XP
超遠心ローター	ックマン・コールターSW32TI