原子間力顕微鏡を用いたヒト関節軟骨外植片のマイクロインデンテーションにおける実用的課題への対処

Summary

原子間力顕微鏡のマイクロインデンテーションに関連する最も一般的な問題を特定し、対処するための段階的なアプローチを紹介します。私たちは、変形性関節症によるさまざまな程度の変性を特徴とする天然のヒト関節軟骨外植片の新たな問題を例示しています。

Abstract

原子間力顕微鏡(AFM)は、現在、生物学的分野におけるマイクロやナノキューを評価するための最も強力で有用な技術の1つであることは間違いありません。しかし、他の微視的アプローチと同様に、方法論的な課題が生じる可能性があります。特に、サンプルの特性、サンプル調製、装置の種類、およびインデンテーションプローブは、望ましくないアーチファクトにつながる可能性があります。このプロトコルでは、健康な変形性関節軟骨外植片だけでなく、変形性関節症の関節軟骨外植片に関するこれらの新たな問題を例示します。この目的のために、まず、組織外植片全体の大規模な2Dモザイク蛍光イメージングにより、変性のさまざまな段階に応じてex vivo関節軟骨椎間板を生成、等級付け、および視覚的に分類する方法を段階的なアプローチで示します。ex vivoモデルの主な強みは、老化した天然のヒト軟骨で構成されており、変形性関節症の早期発症から進行までの変化を調査できることです。さらに、組織調製における一般的な落とし穴、および実際のAFM手順とその後のデータ解析についても説明します。サンプルの調製と処理、高度な縮性によって引き起こされるトポグラフィーサンプルの特性、サンプルとチップの相互作用など、基本的かつ重要なステップがデータ取得にどのように影響するかを示します。また、AFMの最も一般的な問題を精査し、可能であれば、それらを克服する方法を説明します。これらの限界に関する知識は、正しいデータの取得、解釈、そして最終的には幅広い科学的文脈への発見の埋め込みにとって最も重要です。

Introduction

電子機器やシステムの小型化に伴い、マイクロ・ナノベースの技術や機器の急速な発展が加速しています。そのようなデバイスの1つが原子間力顕微鏡(AFM)で、生体表面をスキャンし、ナノメートルスケールとマイクロメートルスケールの両方で地形情報または生体力学的情報を取得できます^1,2。その膨大な機能の中で、このツールは、さまざまな生物学的システムの機械的特性に関する情報を取得するためのマイクロおよびナノインデンターとして操作できます^3,4,5,6。データは、先端部で約1nmと小さくなり得る機械プローブを介して表面と物理的に接触することによって収集^{される7。}次に、試料の結果として生じる変形は、片持ち梁先端のくぼみの深さと試料⁸に加えられた力に基づいて表示される。

変形性関節症(OA)は、関節および周辺組織の関節軟骨の劣化を特徴とする長期の変性慢性疾患であり、骨表面の完全な露出につながる可能性があります。オープンアクセスの負担....

Protocol

ドイツのテュービンゲン大学病院で人工膝関節全置換術を受けている患者から採取した大腿骨顆が使用されました。この研究には、変性および心的外傷後関節病変のある患者からの関節軟骨サンプルのみが含まれていました。研究の開始前に、部門、機関、および地域の倫理委員会の承認が得られました (プロジェクト番号 674/2016BO2)。参加前にすべての患者から書面によるインフォームドコンセントが受け取られました。

注:実験ステップのフローチャートを時系列で示したものを 図1に示します。

1. 組織処理と軟骨椎間板の作製

1. 組織の準備
   1. 術後切除後、軟骨サンプルを、5%(v / v)ペニシリンストレプトマイシンを添加したダルベッコ修正イーグル培地(DMEM)で満たされた容器に入れます。サンプルが培地に完全に浸されていることを確認してください。外科的切除と軟骨のさらなる処理の間の期間は24時間を超えてはなりません。サンプルの乾燥を防ぐために、処理全体を通して、サンプルが培地に完全に浸されていることを確認してください。
   2. メスを使って軟骨を骨から切り取ります。
2. 軟骨椎間板の生成
   1. 生検パンチを使用して直径4mmの軟骨椎間板を生成します。
      注:....

Results

自作の切断装置を用いて、単一糸(SS、図2A)、二重糸(DS)、小クラスター(SC)、大クラスター(BC;図2A)、および拡散(図2B)です。代表的な軟骨外植片を図3Aに示します。1種類のパターンのみを表示するディスクの選択は、トップダウン蛍光イメージングを使用して行われました(図2)。軟骨表面円板のトポグラフィー的変化は、軟骨円板から生成された厚さ60μmの切片の側面画像によってさらに示されました(図2C)。摘出された変形性関節症軟骨椎間板の表面には、表在性細動とマトリックスの裂け目が見られました(図3B、C)。これは、BCの存在によって表さ.......

Discussion

進行性および多因子性疾患として、OAは関節軟骨の構造的および機能的変化を引き起こします。OAの過程を通じて、機械的特徴の障害は、関節軟骨の表面における構造的および生化学的変化を伴う^27,31。OAで発生する最も初期の病理学的事象は、コラーゲンネットワークの破壊と組み合わされたプロテオグリカンの枯渇である32,33,34。このような初期の微妙な表面変化は、機械的挙動が組織全体の深さにわたって平均化されるため、バルク試験で特定して特定することは困難です。さらに、臓器や組織レベルでの機能的変化が、ミクロまたはナノスケールの構造的および機能的変化に関連しているかどうかという問題もまだ解決されていません。このため、AFMは最も感度の高い方法の1つであり、OA^発症に伴って発生する最も初期の生体力学的変.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1397-89-3
原子間力顕微鏡(AFM)ヘッド	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	JPK00518
生体適合性サンプル接着剤	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	H000033
Calcein AM	Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA	14948	軟骨椎間板の選別に使用される細胞膜透過性染色-上面図イメージング
カンチレバー	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SAA-SPH-5UM	周波数名:30KHz、k:0.2N/m、長さ名:115μm、幅公称:40μメートル、 幾何学:長方形、5&muの円筒形の先端。m終末橈骨
切除装置	自作	n/a	4mmx1mm CDDカメラの定義済み全体を含む切断プラスチックデバイス
	The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany	DFK 31BF03
CDDカメラは蛍光顕微鏡に統合	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DFC3000G
Cryotome	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	CM3050S
Data Processing Software for the AFM	Bruker Nano GmbH, Berlin,	n/a	Version 5.0.86,  は、次のウェブサイトから無料でダウンロードできます https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany	41966052
蛍光顕微鏡 (Leica DMi8)	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	11889113
ガラスブロック カンチレバーホルダー	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SP-90-05	JPK PetriDishHeaterTM (Bruker) で使用するために特別に設計された、角度のついた面を持つ超長ガラスブロックです。
倒立位相差顕微鏡(AFMに内蔵)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	F1315
Microscope glass slides	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS294775X50
Mounting medium With DAPI	ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany	50011	軟骨椎間板に使用される核DAPI(4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)対比染色による封入剤  サイドビューイメージング
ペニシリン-ストレプトマイシン	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P4333
AFM(Petri Dish Heater)Bruker	Nano GmbH, Berlin, Germany	T-05-0117
Scalpel	Feather Medical Products, Osaka, Japan	2023-01
Silicone Skirt	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	保護シリコン膜 (D55x0.25) これは、AFMヘッド内の中程度の結露を防ぐために、グラスブロックのベースに基づいて配置されています。
統計プログラム - SPSS	IBM, Armonk, New York, USA	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 (190)
組織培養皿	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	SA6255012	水溶性包埋培地