原子間力顕微鏡を用いたヒト関節軟骨外植片のマイクロインデンテーションにおける実用的課題への対処

Summary

原子間力顕微鏡のマイクロインデンテーションに関連する最も一般的な問題を特定し、対処するための段階的なアプローチを紹介します。私たちは、変形性関節症によるさまざまな程度の変性を特徴とする天然のヒト関節軟骨外植片の新たな問題を例示しています。

Abstract

原子間力顕微鏡(AFM)は、現在、生物学的分野におけるマイクロやナノキューを評価するための最も強力で有用な技術の1つであることは間違いありません。しかし、他の微視的アプローチと同様に、方法論的な課題が生じる可能性があります。特に、サンプルの特性、サンプル調製、装置の種類、およびインデンテーションプローブは、望ましくないアーチファクトにつながる可能性があります。このプロトコルでは、健康な変形性関節軟骨外植片だけでなく、変形性関節症の関節軟骨外植片に関するこれらの新たな問題を例示します。この目的のために、まず、組織外植片全体の大規模な2Dモザイク蛍光イメージングにより、変性のさまざまな段階に応じてex vivo関節軟骨椎間板を生成、等級付け、および視覚的に分類する方法を段階的なアプローチで示します。ex vivoモデルの主な強みは、老化した天然のヒト軟骨で構成されており、変形性関節症の早期発症から進行までの変化を調査できることです。さらに、組織調製における一般的な落とし穴、および実際のAFM手順とその後のデータ解析についても説明します。サンプルの調製と処理、高度な縮性によって引き起こされるトポグラフィーサンプルの特性、サンプルとチップの相互作用など、基本的かつ重要なステップがデータ取得にどのように影響するかを示します。また、AFMの最も一般的な問題を精査し、可能であれば、それらを克服する方法を説明します。これらの限界に関する知識は、正しいデータの取得、解釈、そして最終的には幅広い科学的文脈への発見の埋め込みにとって最も重要です。

Introduction

電子機器やシステムの小型化に伴い、マイクロ・ナノベースの技術や機器の急速な発展が加速しています。そのようなデバイスの1つが原子間力顕微鏡(AFM)で、生体表面をスキャンし、ナノメートルスケールとマイクロメートルスケールの両方で地形情報または生体力学的情報を取得できます^1,2。その膨大な機能の中で、このツールは、さまざまな生物学的システムの機械的特性に関する情報を取得するためのマイクロおよびナノインデンターとして操作できます^3,4,5,6。データは、先端部で約1nmと小さくなり得る機械プローブを介して表面と物理的に接触することによって収集^{される7。}次に、試料の結果として生じる変形は、片持ち梁先端のくぼみの深さと試料⁸に加えられた力に基づいて表示される。

変形性関節症(OA)は、関節および周辺組織の関節軟骨の劣化を特徴とする長期の変性慢性疾患であり、骨表面の完全な露出につながる可能性があります。オープンアクセスの負担は相当なものです。現在、65歳以上の女性の半数、男性の3分の1がOA⁹に罹患しています。外傷、肥満、およびその結果生じる関節¹⁰の変化した生体力学は、関節軟骨変性を決定し、これは一般的な最終結果と見なされる。Ganzらの先駆的な研究は、OAプロセスの初期段階には軟骨の生体力学的特性が関与している可能性があると仮定し¹¹、それ以来、研究者はこの仮説を確認してきました¹²。同様に、組織の生体力学的特性は、超微細構造組織、ならびに細胞間および細胞マトリックスのクロストークによって機能的に調整されることが一般的に認められています。いかなる変化も、組織全体の生体力学的機能に劇的な影響を与える可能性がある¹³。今日まで、OA診断は臨床的であり、プレーンフィルムX線撮影に基づいている¹⁴。このアプローチは2つの側面があります:第一に、OAの診断を定式化するための定義された変性カットオフ閾値がないため、状態の定量化が困難になり、第二に、イメージング法は感度と標準化を欠いており、局所的な軟骨損傷を検出できません15,16,17。この目的のために、軟骨の機械的特性の評価は、疾患の病因に関係なくOAの過程で変化するパラメータを記述し、非常に早い段階で組織の機能に直接影響を与えるという決定的な利点を有する。圧痕器具は、組織が圧痕に抵抗する力を測定します。実際、これは新しい概念ではありません。初期の研究は1980年代と1990年代にさかのぼります。この時期、多くの研究により、関節軟骨の関節鏡視下測定用に設計された圧痕器具が軟骨の変性変化を検出するのに適している可能性があることが示唆されました。30年前でさえ、いくつかの研究は、関節鏡検査中に圧縮剛性測定を行うことにより、組織変性中の軟骨表面のin vivo変化をインデンテーション機器が検出できることを実証することができました18,19,20。

関節軟骨のAFMインデンテーション(AFM-IT)は、組織の極めて重要な機械的特性、すなわち硬さに関する情報を提供します。これは、加えられた非破壊荷重と、くぼみのある組織領域²¹の結果として生じる変形との関係を記述する機械的パラメータである。AFM-ITは、巨視的に影響を受けていないコラーゲンネットワークにおける硬さの加齢による変化を定量化できることが示されており、したがって、OA発症に関連する病理学的変化(関節軟骨のアウターブリッジスケールでグレード0)を区別することができます²²。AFM-ITは、軟骨細胞の早期変性を示す画像ベースのバイオマーカーとして、軟骨細胞の空間的組織化に基づいて、定量化だけでなく、最も初期の変性機械的変化を実際に特定できることを示しました。これらの発見は、すでに他の人によって確認されています^23,24。したがって、AFM-ITは、初期の変性変化を診断および特定するための興味深いツールとして機能します。これらの変化はすでに細胞レベルで測定されており、OAの病態生理学的プロセスの理解を再構築しています。

このプロトコルでは、天然の軟骨外植片の準備からAFMデータの取得と処理まで、関節軟骨外植片の完全な組織学的および生体力学的等級付け手順を実証します。ステップバイステップのアプローチにより、2D大型モザイクイメージングとそれに続くマイクロAFMインデンテーションにより、変性のさまざまな段階に応じて関節軟骨組織を生成、等級付け、および視覚的に分類する方法を示します。

現在、AFM-ITは、他の機器技術と同様に、軟骨の生体力学的変化を測定するための最も感度の高いツール^の1つですが7、誤ったデータ収集につながる可能性のある制限と実用的な特殊性²⁵があります。そのために、軟骨外植片のAFM測定中に発生する最も一般的な問題を精査し、可能であれば、それらを最小化または克服する方法を説明します。これらには、サンプルの地形的側面と、AFM互換環境でサンプルを安定させることの難しさ、組織表面の物理的特性、およびそのような表面でAFM測定を行うことの難しさが含まれます。また、誤った力-距離曲線の例も示され、それらを引き起こす可能性のある条件が強調されています。また、カンチレバー先端の形状に固有の制限や、データ解析にヘルツモデルを使用することについても説明します。

Protocol

ドイツのテュービンゲン大学病院で人工膝関節全置換術を受けている患者から採取した大腿骨顆が使用されました。この研究には、変性および心的外傷後関節病変のある患者からの関節軟骨サンプルのみが含まれていました。研究の開始前に、部門、機関、および地域の倫理委員会の承認が得られました (プロジェクト番号 674/2016BO2)。参加前にすべての患者から書面によるインフォームドコンセントが受け取られました。

注:実験ステップのフローチャートを時系列で示したものを 図1に示します。

1. 組織処理と軟骨椎間板の作製

1. 組織の準備
   1. 術後切除後、軟骨サンプルを、5%(v / v)ペニシリンストレプトマイシンを添加したダルベッコ修正イーグル培地(DMEM)で満たされた容器に入れます。サンプルが培地に完全に浸されていることを確認してください。外科的切除と軟骨のさらなる処理の間の期間は24時間を超えてはなりません。サンプルの乾燥を防ぐために、処理全体を通して、サンプルが培地に完全に浸されていることを確認してください。
   2. メスを使って軟骨を骨から切り取ります。
2. 軟骨椎間板の生成
   1. 生検パンチを使用して直径4mmの軟骨椎間板を生成します。
      注:軟骨層の厚さが1mmを超える顆の領域を選択して切除することが重要です。これは、特に軟骨層が通常、摩耗や損傷プロセスまたは変性のために厚さを失う耐荷重ゾーンの周りで問題になる可能性があります。
   2. 以前に作成した4mmの軟骨椎間板を特注の切断装置に置き、へらで軟骨椎間板を固定して安定させます。軟骨ディスクを切断装置に置くときは、注意が必要です。軟骨の最上層(関節軟骨の表層部)がブレードに面しないようにサンプルを配置します
   3. 軟骨椎間板をカミソリの刃で切ります。したがって、4 mm x 1 mmの円盤状の軟骨サンプルが生成されます。サンプルの乾燥を防ぐために、組織切断はできるだけ早く行ってください。
   4. スパチュラの助けを借りて各椎間板を回収し、生成された軟骨椎間板を、5%(v / v)ペニシリンストレプトマイシンを添加した1mLのDMEMを含む1.5mLのチューブに入れます。1本のチューブに約15枚のディスクを入れます。
3. 軟骨椎間板のクライオトーム切片(垂直スライス用)
   注:このステップはオプションであり、軟骨椎間板内の細胞パターン分布を横から視覚化したい場合に使用できます。細胞パターンの分布は関節軟骨²⁶の3D特徴であるため、検証方法として用いることができる。共焦点顕微鏡を用いた軟骨椎間板全体の光学的切片作成および3D再構成も使用でき、したがって、プロトコルに記載されているようにサンプルを切片化する必要がなくなります。
   1. 軟骨椎間板を水溶性包埋剤で覆い、クライオトームノブの端に置きます(椎間板の表面がノブの表面に垂直になるようにします)。クライオトーム装置では、包埋培地は低温で凍結します。
   2. 標準的なクライオトームを使用して、椎間板の中央に達するまで(つまり、凍結切片の長さが4 mmに達したとき)、組織を60 μmの厚さで横向きに切片し、スライスを回収します。椎間板外植片を垂直に切断することで、軟骨のすべてのゾーン(表在性、中層、深部)を視覚化できます。
   3. スライドガラスで切片を回収し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄して水溶性包埋剤を除去します。

2. 細胞空間パターンの関数としての軟骨椎間板選別

1. 円盤状軟骨サンプルの染色
   1. 軟骨ディスク(セクション1.2)を96ウェルプレートの各ウェルに1枚ずつ置き、130 μLの細胞透過性蛍光色素を1:1,000の希釈率で各ウェルに添加します。
   2. プレート全体を目視検査し、各ウェルにディスクが1枚だけ配置されていることを確認します。プレートを標準細胞培養インキュベーターで37°Cで30分間インキュベートします。
2. 60μm軟骨切片の染色
   1. 軟骨椎間板切片(セクション1.3)を鉗子の助けを借りてガラス顕微鏡スライドにそっと置きます。
   2. 核DAPI対比染色を含む封入剤で軟骨切片を覆い、蛍光顕微鏡に適したカバーガラスを静かに配置します。
   3. 各カバーガラスの端を通常の透明なマニキュアで密封し、3分間乾かします。
3. トップダウンおよびサイドビューの軟骨の選別とイメージング
   注意: 各ディスクは蛍光顕微鏡で検査する必要があります。このステップの目的は、主要なセルパターン(シングルストリング、ダブルストリング、小さなクラスター、大きなクラスター、または拡散)に基づいてディスクを並べ替えることです。
   1. 96ウェルプレートを蛍光顕微鏡のプレートホルダーに置きます。
   2. Em 495 nm/Ex 515 nm(セクション2.1で作製した軟骨椎間板のトップダウンイメージング用)またはEm 358 nm/Ex 461 nm(セクション2.2で作製した軟骨切片のサイドビューイメージング用)と10倍対物レンズのいずれかの適切な蛍光フィルターを選択します。
      注:10倍対物レンズを使用すると、ディスクの全周を検査でき、不均一または不適切な染色を含むサンプルを除外できます。しかし、トップダウンの視点だけでは、表在性侵食によってトップダウン観察で見える深層組織層の解析の結果として、細胞組織の変化が知覚される可能性があります。一例として、コラーゲンアーケードに続く上向きの文字列は、単一の細胞または散乱した細胞(拡散パターン)として知覚される可能性があります²⁶。そのため、ディスクの両面を検査して、適切なセルラーパターンの選択を確認する必要があります。
   3. 各軟骨椎間板に表示される細胞パターンを視覚的に決定します。椎間板が1種類の細胞パターンしか持たないことはまずありません。軟骨細胞の配列が目的のパターンと一致しない椎間板の部分については、望ましくないパターンがAFM測定が行われていない非常に周辺部(すなわち、椎間板の境界から0.5mmまで)にある場合にのみサンプルを受け入れ、これが椎間板の全表面の10%を超えないようにします^27。28。
4. 軟骨椎間板全体の画像取得
   1. 顕微鏡の10倍対物レンズを選択し、個々の軟骨椎間板を含む事前に選択されたウェルの下に配置します。椎間板に焦点を合わせて、細胞のパターンを確認します。
   2. ナビゲーター機能を選択すると、坑井全体の概要が表示されます。マウスの左ボタンを使用してドラッグし、別のステージ位置に移動します。マウスホイールを使用して、ズームインおよびズームアウトします。
      注: この時点で、各関心領域を順番にダブルクリックすると、サンプル全体を含むウェルのプレビューを表示できます。
   3. スキャンする対象領域を囲む正方形を選択します。この時点で、モザイクを構成するすべての単一タイルが表示されます。
   4. 露出/光の強さを調整して、セルが背景からはっきりと見えるようにします。この時点で、画像の明るさ/コントラストはすべてのタイルで調整されており、タイルごとに個別にカスタマイズすることはできなくなりました。
      注:椎間板の端付近の細胞は、中央の細胞よりも高い蛍光シグナルを発することが多いため、露光量/光強度の設定を調整する必要があります。
      1. 露光時間が特定のチャンネルに適しているかどうかを評価するには、ヒストグラムの信号の分布を調べます。顕微鏡の画像ソフトウェアに搭載されている自動露光機構を使用して、ディスク内に存在するすべての細胞を視覚化します。
   5. ソフトウェアの [フォーカス マップ ポイント ] オプションを選択し、タイルの中央を左クリックして個々のタイルを選択します。
   6. 「 フォーカスマップ」オプションを選択します。ウィンドウが開き、以前に選択したすべてのタイルが表示されます。リスト内のタイルをダブルクリックすると、そのタイルが表示され、適切なフォーカスが置かれます。
   7. 「 Z を設定 」をクリックしてフォーカル・プランを保存し、次のタイルに進みます。個々のタイルのフォーカルプランを調整した後、[ スキャンの開始]を押して画像取得を開始します。
      1. スキャンで横棒や縦棒が暗くなる場合は、単一フレームの照明が不適切で不均一であることが原因である可能性があります。この問題を解決するには、実際のスキャンの前にソフトウェアに組み込まれている リンク シェーディング オプションを使用します。
   8. 画像を保存、エクスポートし、正しく注釈を付けます。

3. 軟骨外植片の生体力学的アプローチ

1. AFM測定用のサンプル調製
   1. 細胞パターン(セクション2)を含む事前に選択された各軟骨椎間板を、生体適合性接着剤を使用してペトリ皿に固定します。ディスクの上面、下面、左側面、右側面に十分なサンプル接着剤を追加します。
   2. L-グルタミンを含まないリーボビッツのL-15培地2.5 mLでディスクを覆います。Leibowitz培地をサンプルにそっと添加し、培地によって発生する波によるサンプルの剥離を防ぎます。
2. AFMへのサンプルのロード
   1. シャーレをAFM装置のサンプルホルダーにセットし、37°Cに設定したシャーレヒーターをオンにします。 組織培養皿を所望の温度に到達させます。これは、温度変化によって引き起こされる可能性のあるアーティファクトを排除するために行われます。
3. AFM-カンチレバーキャリブレーション
   1. Danalache et ^al.29 で以前に説明したように、ソフトウェアのセットアップを初期化します。
   2. 液体測定に適したガラスブロックカンチレバーホルダーを選択し、AFMヘッドに慎重に配置します。ロック機構により、ガラスブロックをAFMヘッドに固定します。ガラスブロックの反射面がまっすぐで、AFMホルダーと平行であることを確認してください。
   3. ガラスブロックカンチレバーホルダーの表面にカンチレバーを注意して置きます。カンチレバー自体は、ガラスブロックの中央にある研磨された光学面に置く必要があります。
   4. カンチレバーホルダーの底面にシリコンスカート(シリコンメンブレン)を慎重に置き、AFMヘッド内の媒体結露を防ぎます。
   5. カンチレバーが媒体に完全に沈むまで、ステッピングモーター機能を使用して100μmステップでカンチレバーを下げます。
   6. Danalache et ^al.29 によって記述されたアプローチ パラメーターを使用してスキャナー アプローチを実行します。ペトリ皿の底に達したら、カンチレバーを100μm引っ込めます。
   7. 正確な手順でカンチレバーを校正し、Danalache et ^al.29 によって記述されたパラメータを実行します。キャリブレーションの最後に、垂直方向のたわみは、ボルト(V)ではなく、ニュートン(N)の力の単位(フォトダイオード検出器による元のレジストレーションの単位)で保存および表示されます。ここでの実験では、キャリブレーション後に4.47 nNの設定値が得られました。
   8. ステッピングモーター機能を使用して、カンチレバーを1,000μmまで後退させます。
4. AFM下での所望の軟骨測定部位の特定
   注:軟骨ディスクの厚さが1mmであるため、サンプル上をナビゲートしている間、カンチレバーは視野に見えません。
   1. 顕微鏡のCCDカメラを使用して、カンチレバーを特定します。AFMカンチレバーは、ペトリ皿のサンプルフリーエリアに配置する必要があります。
   2. Danalache et ^al.29 によって記述されたのと同じパラメータを使用して、ペトリ皿の清潔でサンプルのない領域にカンチレバーでスキャナーアプローチを開始します。
   3. さらに、ステッピングモーター制御でカンチレバーをプレートの底から1.5mm引き込みます。このステップは、カンチレバーとサンプルの直接衝突を避けるために重要です。
   4. 明視野表示から蛍光表示に切り替えて、ディスクの上部を視覚的に識別します。
   5. AFMサンプルホルダーをディスクの中央に向かって正確に2mm動かします。この点が軟骨椎間板の中心と考えられています。
   6. スキャナーアプローチを実行し、軟骨椎間板の表面に達したら、カンチレバーを100μm後退させます。
5. 力-距離曲線測定
   1. 目的の測定部位に配置された細胞に焦点を合わせます。Runボタンをクリックして、測定を開始し、目標位置で力-距離曲線を生成します。
   2. 各測定部位で5つの力-距離曲線を取得します。カンチレバーを500μm後退させ、カンチレバーを次の測定場所に移動します。
      注:軟骨椎間板の表面は均質ではなく、不規則性があるため、カンチレバーの収縮は重要なステップです。サンプル表面のヒロックが高いと、劇的な衝突が発生し、望ましくないカンチレバーチップ/サンプルの損傷につながる可能性があります。ディスクの表面に分散した5つの異なる測定部位を少なくとも5つ選択し、各部位で少なくとも5つの力-距離曲線を取得することをお勧めします。
   3. 力-距離曲線を検査し、保存します。
6. ヘルツ近似モデルを用いたヤング率の推定
   1. 解析する生成した力-距離曲線(.jpkファイル)をデータ解析ソフトウェアでOpen a Batch of Spectroscopy Curves オプションを使用して開きます。
   2. ヘルツ近似モデルを選択し、弾性近似オプションを選択します。
      1. 弾性フィットオプションは、選択した力-距離カーブに対して次の計算を自動的に実行します。 ベースラインを計算し、カーブ全体から減算してベースラインオフセットを削除します(ベースラインはY軸上でゼロに戻ります)。力-距離曲線がゼロ力線と交差する点を検出して接触点を決定します(接触点はx軸上でゼロに設定されます)。チップとサンプルの分離を計算します(カンチレバーの曲がりを考慮したピエゾの高さ信号を差し引く)。をクリックし、力-距離曲線を選択したモデルに自動的に適合させます。所望であれば、これらの各ステップを独立して実行することもできる。
   3. 次のフィットパラメータを使用して適応します:ポアソン比0.5と適切な片持ち梁先端半径。
      注意: 球形のカンチレバーチップを備えたカンチレバーを使用する場合は、ヘルツフィットモデルを使用する必要があります。本研究で用いたカンチレバーは、先端が半径5μmの球形であった。最大適用力(設定値)に達するまで、力-距離曲線をフィッティングすることをお勧めします。
   4. 力と距離の曲線のフィットを目視で確認して、正確であることを確認します。このステップは、解析された力-距離曲線ごとに実行する必要があります。
7. くぼみの深さの決定
   注: 使用しているデータ分析ツールによっては、このプロセスが異なる場合があります。実験者は、データ解析プログラムに含まれる一連の手順に従うことで、くぼみの深さを簡単に読み取ることができます。
   1. 生成された各力-距離曲線をデータ解析ソフトウェアで開き、解析プロセスとして ヘルツ近似モデル を選択します。
   2. [ 基線オフセットの減算 ]オプションを適用して垂直方向のたわみ軸(y軸)をゼロにし、[ オフセット+チルト ]機能を選択します。
   3. 接触点 の検索 機能を使用すると、接触点が自動的に識別され、自動的に x 座標が 0 になります。
   4. Vertical Tip Position関数を使用して、インデント中の生のピエゾ高さからカンチレバーのたわみのみを考慮した距離を差し引きます。
   5. [ 弾性フィット ]オプションを選択して、処理された力-距離曲線を表示し、垂直 先端位置軸 (X 軸)上で最も負の値と揃うようにグラフの領域を選択します。
   6. パラメータタブの[X Min]ボックスからインデントを読み取り、文書化します。結果を保存して文書化します。

4. 統計解析

1. 統計ソフトウェアを開きます。ドロップダウンメニューから [ 新しいデータセット ] を選択します。
2. DataSetファイルを選択した後、変数ビュータブを開きます。各セルパターンカテゴリの数値変数を定義します:単一文字列 = SS、二重文字列 = DS、小さなクラスター = SC、大きなクラスター = BC、拡散、ヤング率。
3. データ表示タブで、対応するセルパターンカテゴリごとに測定されたヤング率データを入力します。メニュー バーから [分析] を選択し、次に [探索的データ分析] を選択して、データ分布を分析します。
4. 従属変数として「 ヤング率 」を、因子リストとして 「細胞パターン 」を選択します。結果セクションに使用される箱ひげ図は、出力ファイルの結果の中に表示されます。
5. 統計分析を実行するには、分析メニューバータブのノンパラメトリック検定セクションで従属サンプルを選択します。フィールドタブで、テストフィールドとしてヤング率を選択し、グループとしてセルラーパターンを選択します。 [実行]を押します。
   注: 結果は出力ファイルに表示されます。統計分析では、フリードマン検定が実行されます。
6. ノンパラメトリック検定の p値をステップ4.4で作成した箱ひげ図に組み込みます。メニューバーの 「ファイル 」をクリックし、「 保存」を選択して結果を保存する。

Results

自作の切断装置を用いて、単一糸(SS、図2A)、二重糸(DS)、小クラスター(SC)、大クラスター(BC;図2A)、および拡散(図2B)です。代表的な軟骨外植片を図3Aに示します。1種類のパターンのみを表示するディスクの選択は、トップダウン蛍光イメージングを使用して行われました(図2)。軟骨表面円板のトポグラフィー的変化は、軟骨円板から生成された厚さ60μmの切片の側面画像によってさらに示されました(図2C)。摘出された変形性関節症軟骨椎間板の表面には、表在性細動とマトリックスの裂け目が見られました(図3B、C)。これは、BCの存在によって表さ...

Discussion

進行性および多因子性疾患として、OAは関節軟骨の構造的および機能的変化を引き起こします。OAの過程を通じて、機械的特徴の障害は、関節軟骨の表面における構造的および生化学的変化を伴う^27,31。OAで発生する最も初期の病理学的事象は、コラーゲンネットワークの破壊と組み合わされたプロテオグリカンの枯渇である32,33,34。このような初期の微妙な表面変化は、機械的挙動が組織全体の深さにわたって平均化されるため、バルク試験で特定して特定することは困難です。さらに、臓器や組織レベルでの機能的変化が、ミクロまたはナノスケールの構造的および機能的変化に関連しているかどうかという問題もまだ解決されていません。このため、AFMは最も感度の高い方法の1つであり、OA^発症に伴って発生する最も初期の生体力学的変...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1397-89-3
原子間力顕微鏡(AFM)ヘッド	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	JPK00518
生体適合性サンプル接着剤	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	H000033
Calcein AM	Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA	14948	軟骨椎間板の選別に使用される細胞膜透過性染色-上面図イメージング
カンチレバー	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SAA-SPH-5UM	周波数名:30KHz、k:0.2N/m、長さ名:115μm、幅公称:40μメートル、 幾何学:長方形、5&muの円筒形の先端。m終末橈骨
切除装置	自作	n/a	4mmx1mm CDDカメラの定義済み全体を含む切断プラスチックデバイス
	The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany	DFK 31BF03
CDDカメラは蛍光顕微鏡に統合	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DFC3000G
Cryotome	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	CM3050S
Data Processing Software for the AFM	Bruker Nano GmbH, Berlin,	n/a	Version 5.0.86,  は、次のウェブサイトから無料でダウンロードできます https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany	41966052
蛍光顕微鏡 (Leica DMi8)	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	11889113
ガラスブロック カンチレバーホルダー	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SP-90-05	JPK PetriDishHeaterTM (Bruker) で使用するために特別に設計された、角度のついた面を持つ超長ガラスブロックです。
倒立位相差顕微鏡(AFMに内蔵)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	F1315
Microscope glass slides	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS294775X50
Mounting medium With DAPI	ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany	50011	軟骨椎間板に使用される核DAPI(4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)対比染色による封入剤  サイドビューイメージング
ペニシリン-ストレプトマイシン	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P4333
AFM(Petri Dish Heater)Bruker	Nano GmbH, Berlin, Germany	T-05-0117
Scalpel	Feather Medical Products, Osaka, Japan	2023-01
Silicone Skirt	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	保護シリコン膜 (D55x0.25) これは、AFMヘッド内の中程度の結露を防ぐために、グラスブロックのベースに基づいて配置されています。
統計プログラム - SPSS	IBM, Armonk, New York, USA	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 (190)
組織培養皿	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	SA6255012	水溶性包埋培地