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方法論記事

左冠動脈結紮術:心筋梗塞の外科用マウスモデル

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DOI:

10.3791/64387

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2022年8月9日

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1Pittsburgh Heart, Lung, Blood, and Vascular Medicine Institute, Department of Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Immunology, University of Pittsburgh, 3Department of Bioengineering, Swanson School of Engineering, University of Pittsburgh

この記事について

サマリー

ここに提示されるのは、マウスの左冠状動脈の永久結紮のための外科的処置である。このモデルは、心筋梗塞後の病態生理学および関連する炎症反応を調査するために使用できます。

要約

虚血性心疾患とそれに続く心筋梗塞(MI)は、米国および世界中の主要な死亡原因の1つです。心筋梗塞後の病態生理学的変化を探索し、将来の治療法を設計するためには、MIの研究モデルが必要です。マウスの左冠状動脈(LCA)の永久結紮は、MI後の心機能と心室リモデリングを調査するための一般的なモデルです。ここでは、LCAの永久結紮による、侵襲性が低く、信頼性が高く、再現性の高い外科用マウスMIモデルについて説明します。私たちの手術モデルは、簡単に可逆的な全身麻酔、気管切開を必要としない気管内挿管、および開胸術で構成されています。MIを確実にするために心電図検査とトロポニン測定を実施する必要があります。 MI後28日目の心エコー検査は、心機能と心不全のパラメーターを識別します。心臓線維症の程度は、マッソントリクローム染色および心臓MRIによって評価することができる。このMIモデルは、MI後の病態生理学的および免疫学的変化を研究するのに役立ちます。

概要

心血管疾患は、毎年1,790万人の命を奪う主要な公衆衛生上の懸念事項であり、世界の死亡率の31%を占めています1。最も一般的なタイプの心血管異常は冠状動脈性心臓病であり、心筋梗塞(MI)は冠状動脈性心臓病の主要な症状の1つです2。MIは通常、脆弱なプラークの破裂による冠状動脈の血栓性閉塞によって引き起こされます3。結果として生じる虚血は、罹患した心筋の深刻なイオン性および代謝変化、ならびに収縮機能の急速な低下を引き起こす。MIは心筋細胞の死をもたらし、さらに心室機能障害や心不全につながる可能性があります4。

MI5の患者から得られた組織が不足しているため、患者におけるMIに関する研究は限られています。このように、MIのマウスモデルは、疾患メカニズムの研究と潜在的な治療標的の開発の両方に役立ちます。現在利用可能なMIのマウスモデルには、不可逆的虚血モデル(LCAおよびアブレーション法)および再灌流モデル(虚血/再灌流、I / R)6が含まれます。マウスの左冠状動脈(LCA)の永久結紮は最も使用されている方法であり、患者7,8,9のMIの病態生理学および免疫学を模倣します。永久MIは、電気的損傷または凍結損傷を伴うアブレーション法によっても誘発され得る。アブレーション法は、正確な位置10で均一なサイズの梗塞を生成することができる。一方、瘢痕形成、梗塞形態、および分子シグナル伝達機構は、アブレーション法によって異なり得る10、11。マウスI/R法は、再灌流療法の臨床シナリオを表すため、もう12つの重要なMIモデルです。I/Rモデルは、梗塞サイズの可変、初期損傷の反応の区別の難しさ、再灌流などの課題に関連しています6。

LCA結紮法は広く使用されていますが、生存率の低さと術後の痛みに関連しています13。このプロトコルは、マウスの準備と挿管、LCA結紮、術後ケア、およびMIの検証を含むLCA結紮のマウス外科MIモデルを実証します。 浸潤気管切開14を使用するのではなく、この方法は気管内挿管を使用します。動物は、喉頭鏡を使用して中咽頭を照らすことによって挿管され、手順をより簡単に、より安全に、そして外傷性を少なくします15。マウスは、手順全体を通して人工呼吸器サポートとイソフルラン麻酔下に保たれます。また、心エコー検査とマッソントリクローム染色を行い、MI後の心機能および心線維症をそれぞれ評価します。全体として、この方法は、MI後の病態生理学および炎症を研究するために使用できるMIの信頼性が高く再現性のある外科的マウスモデルを提供します。

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プロトコル

本研究プロトコルは、ピッツバーグ大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によってレビューおよび承認されました。体重24〜30gの8匹(偽n = 4およびMI n = 4)の1歳の雌C57BL / 6Jマウスをこれらの実験に使用しました。マウスの約100%および少なくとも80%が、それぞれ最初の24時間および28日間で生存した。

1.マウスの準備と気管内挿管

  1. ビーズ滅菌器( 材料の表を参照)を250°Cに予熱し、オートクレーブ滅菌した手術器具を数分間入れます。
  2. 3%イソフルランと1 L / min酸素を含む誘導チャンバーでマウスを5分間麻酔します。
  3. しっかりとしたつま先のつまみに対する反応をチェックして、マウスの麻酔の深さを確認してください。
  4. マウスの体重を測定して、術前の鎮痛薬であるブプレノルフィン(0.1 mg / kg)の投与量を推定します。.薬物を腹腔内に注射する。
  5. 電気かみそりを使用して胸部の左側の毛皮を整えます。
  6. その後、ポビドンヨードと70%エタノールで手術部位を3回消毒します。
  7. マウスを傾斜したボードの仰臥位に置きます。マウスの頭と手足を、それぞれ上顎切歯に取り付けられたゴムバンドと粘着テープを使用して固定します。麻酔下での乾燥を防ぐために、滅菌眼科用潤滑剤を目に塗布します。
  8. 顎を開き、舌を口腔からそっと引き出します。
  9. 喉頭鏡を使用して中咽頭を照らすことによって喉頭の開口部を特定します( 材料の表を参照)。
  10. 24 Gのカテーテル針から約0.5 cmを切り取り、鈍い針をプラスチックシールドに挿入します。プラスチック製のシールドが付いた鈍い針を気管に向けます。プラスチック製のシールドを気管に残して、針を取り出します。
  11. 人工呼吸器( 材料の表を参照)を毎分137拍の呼吸数(この研究で使用したマウス用に最適化)と一回換気量0.18ccに設定します。人工呼吸器チューブをカテーテルシールドに接続し、人工呼吸器と同期した胸の動きを探して、正しい挿管を確認します。
  12. 呼吸用保護チューブをカテーテルシールドから外し、予熱された温度制御された手術用ボード上で動物を仰臥位に置きます。マウスを人工呼吸器に再接続します。

2.左冠状動脈の永久結紮術

  1. 手術部位をポビドンヨードと70%アルコールで消毒します。中央に四分の一サイズの穴がある滅菌ドレープを適用して、手術部位を固定します。鉗子を使用して皮膚をそっと持ち上げ、外科用ハサミを使用して左大胸筋と小筋の間の線に沿って小さな(1.5〜2 cm)皮膚横切開を行います。
    注:はさみを使用して切開を行い、カットの深さと方向を必要な制御を提供します。
  2. 下にある胸筋を鉗子と解剖ハサミで分離します。筋肉は、ゴムバンドに取り付けられた開創器を使用して分離されました。
  3. 胸郭の自然な角度に従って、マイクロハサミで3番目の肋間腔を切開します。この段階では、心臓や肺の損傷を防ぐために細心の注意を払う必要があります。
  4. 開創器を使用して肋骨をそっと伸ばし、左心室を露出させます。心膜脂肪を脇に動かし、左心房の端から心臓の頂点に向かって走るLCAを見つけます。
  5. パス 8-0ニードルホルダーの助けを借りてLCAの下にナイロン縫合糸。LCAをダブルノットでリゲートし、その後に2番目のノット(変更された外科医のノット)を付けます。
    注:左心室の下脳室の白化により、LCA結紮が成功したことが確認されます。これに加えて、トロポニン測定、ECGモニタリング(ST上昇)、エコー/生体 内心臓依存MRI、またはマイクロCT画像も、同等のMI病変を確認することをお勧めします。
  6. 開創器を取り外し、22Gのカテーテル針を胸腔に挿入します。プラスチックシールドの先端を胸腔に残して、針を取り外します。4-0ナイロン縫合糸を使用して胸郭を閉じます。
  7. シリンジを22 Gのプラスチックシールドに接続し、胸部を軽く押して負圧を確立し、胸腔に閉じ込められた余分な空気をゆっくりと取り除きます。プラスチックシールドを取り外します。
  8. 4-0ナイロン縫合糸で皮膚を閉じます。
  9. イソフルランの供給をオフにします。この段階で、マウスは人工呼吸器の上にいて酸素を供給しています。

3.術後ケア

  1. 自発呼吸が始まったら、人工呼吸器のスイッチを切ります。
    注:この手順は、マウスの準備からこのステップまで、動物あたり約30〜35分かかります。
  2. マウスをヒートランプの下に置き、スリープ状態になるまで監視します。動物は、胸骨横臥を維持するのに十分な意識を回復するまで放置しないでください。
  3. 手術後、動物を別のケージに入れ、完全に回復した後にのみ他の動物と一緒に元のケージに戻します。
  4. 痛みや不快感の兆候がないかマウスを毎日監視します。
  5. 手術後さらに2日間、6〜8時間ごとにブプレノルフィン(0.1 mg / kg)の腹腔内注射を継続します。.

4.心エコー検査の評価

注:心エコー検査は、MI後28日目に心不全のパラメーターを評価するために実施されました。

  1. 手術後28日後、マウスに3%イソフルランと1 L / min酸素を麻酔し、滅菌眼科用潤滑剤を目に塗布し、脱毛クリームを使用して胸毛を取り除きます。胸部をポビドンヨードと70%エタノールで3回消毒します。
  2. 麻酔をかけたマウスをイメージングプラットフォーム( 材料の表を参照)の上に仰臥位で固定し、麻酔システムに接続されたノーズコーン(1%〜2%イソフルランと1 L / min酸素)を使用して、手順全体を通して安定したレベルの麻酔を維持します。
  3. 4本の足を電極ゲルでECG電極にテープで留めます( 材料の表を参照)。直腸プローブを挿入して動物の体温を監視します( 材料の表を参照)。
  4. スキャニングゲル( 資料表を参照)を胸部に塗布し、トランスデューサーを垂直に配置し、胸骨傍線(胸部に平行)まで下げ、反時計回りに35°回転させて、左心室の胸骨傍長軸図を取得します。
  5. イメージングソフトウェアの Bモード イメージングボタン( 材料の表を参照)をタップして、心臓の完全な長軸ビューを取得します。ゲートサイズと明るさを調整し、後の測定のために [クリップ の保存]または [フレームの保存] を使用して画像を保存します16。
  6. Mモード(モーションモード)に切り替え、Mモード軸を乳頭筋のレベルに配置します。ゲートサイズを調整し、Mモードスタートボタンをタップします。[クリップの保存]または[フレーム16,17の保存]を使用して画像を保存します。
  7. 4Dモードの画像取得プロセスは自動化されているため、データを取得する前に、ECGと呼吸信号がアクティブであることを確認してください(図1)。
  8. Bモードでデータ集録を開始します。4Dスキャンパネルを開き、3Dモーターを起動します。4Dスキャンパネルで画像パラメータを設定し、スキャンボタンをタップして スキャン を開始します。2Dビューで画像をレビューした後、4Dにロードボタンを使用して画像を 4D モードにロードします。

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結果

図1は、偽(図1A)およびMI(図1B)マウスの心エコー評価中の代表的な活動的ECGおよび呼吸信号を実証する。心エコーデータを取得する前に、アクティブなECGと呼吸信号の検証が重要です。 図2は、LCA結紮後28日後の心機能パラメータの心エコー測定を示しています。図2は、偽心臓(図2A)およびMI(図2B)心臓の傍胸骨短軸図のMモード画像を示す。図2Bは、LCA結紮後の心臓壁運動の欠陥を示しています。LV質量の増加(図2C)、駆出率の減少(図2D)、心拍出量の減少(図2E)...

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ディスカッション

MIのマウスモデルは心臓血管研究所で人気を集めており、この研究では、再現性があり臨床的に関連するMIモデルについて説明しています。このプロトコルは、いくつかの方法でLCAライゲーションプロセスを改善します。まず、キシラジン/ケタミンやペントバルビタールナトリウム14,15などの注射可能な術前麻酔薬の使用は避けられます。イソフルラン麻酔のみが使用され、他の薬剤と比較して、動物の生存率を高め(手術後28日の生存率>80%の生存率)、薬物誘発性合併症を最小限に抑え、心臓への影響を最小限に抑えます19。しかしながら、イソフルランはまた、他の麻酔薬と比較して低い程度ではあるが、心臓を遅くする20。このプロトコルには、気管切開21を回避する侵襲性の低い気管内挿管が含まれ、術後の痛みと不快感を軽減します。以前のマウスLCA結紮研究では、気管内挿管の視覚化を改善するために首の中央切開を行うことが...

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開示事項

著者は、開示する利益相反はありません。

謝辞

この研究は、国立衛生研究所の助成金(R01HL143967、R01HL142629、R01AG069399、およびR01DK129339)、AHAトランスフォーメーショナルプロジェクトアワード(19TPA34910142)、AHAイノベーティブプロジェクトアワード(19IPLOI34760566)、およびALAイノベーションプロジェクトアワード(IA-629694)(PDへ)によってサポートされました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
22 G カテーテル針Exel INT26741胸腔穿刺
24 G カテーテル針Exel INT26746気管内挿管
4-0 ナイロン縫合Covetrus29263筋肉と皮膚の縫合
8-0 ナイロン縫合S&T3192LAD
麻酔気化器獣医装備VE-6047麻酔サポート
動物生理学モニター富士フイルムVEVO 3100心拍数、呼吸数、体温のモニター
ベタジン溶液PBS 動物の健康11205抗刺激薬
ブプレノルフィンコベトラス55175鎮痛薬
解剖顕微鏡OMANOOM2300S-V7双眼電気
カミソリWahl79300-1001Mシェービング
電極ゲルParker LaboratoriesW60698L導電性ゲル
エタノールデコンラボラトリーズ22-032-601消毒剤
鉗子FST11065-07ステンレス鋼
ガーゼCurityCAR-6339-PK滅菌
ヒートランプSatcoS4998手術後のケア
ヒーティングパッドケント科学Surgi-M温度制御
ホットビーズ滅菌器発火器 50011503手術器具の滅菌
イソフルランコベトラス29405麻酔
マッソン’s トリクローム染色キットThermoscientific87019心臓線維症の測定
マイクロニードルホルダーFST12500-12ステンレス製
マイクロハサミFST15000-02ステンレス製
眼科用軟膏DechraPuralube 獣医滅菌眼用潤滑剤
スキャン ゲルパーカー研究所アクアソニック 100水性超音波伝送ゲル
さみFST14060-11ステンレス鋼
小動物喉頭鏡ペンセンチュリーモデルLS-2-M中咽頭を照らす
動物換気扇ド大学装置557058人工呼吸器サポート
手術用ライトコールパーマー41723イルミネーター幅(インチ):7
Vevo 3100 前臨床イメージングプラットフォーム富士フイルムVEVO 3100心エコー検査
VevoLABソフトウェア富士フイルムVevoLAB 3.2.6心エコー検査データ分析
糸 糸 の結紮 は小ハーバー

参考文献

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