方法論記事

2D細胞培養モデルにおけるベルテポルフィン細胞毒性を高めるための自作発光ダイオードベースの光線力学治療装置

DOI：

10.3791/64391

⸱

2023年1月13日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate Program in Pharmaceutical Sciences, Laboratory of Cancer Drug Resistance, Federal University of Parana, 2Graduate Program in Pharmaceutical Sciences, Federal University of Parana, 3Federal Institute of Parana

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、2次元HeLa細胞培養と光増感剤としての椎体を使用する in vitro 光線力学療法(PDT)アッセイを成功させるための、新しくてシンプルで低コストのデバイスについて説明します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この論文では、PhotoACTと呼ばれる 、in vitro 光線力学療法(PDT)アッセイを実行するための新しい、シンプルで低コストのデバイスについて説明します。このデバイスは、従来のプログラマブル発光ダイオード(LED)、液晶ディスプレイ(LCD)モジュール、および商用マイクロコントローラボードに接続された光センサのセットを使用して構築されました。プロトタイプのボックスベースの構造は、中密度ファイバーボード(MDF)で作られました。内部コンパートメントには、4つの細胞培養マルチウェルマイクロプレートを同時に配置できます。

概念実証として、HeLa細胞株に対する光増感剤(PS)バーテポルフィンの細胞毒性効果を2次元(2D)培養で研究しました。HeLa細胞を、増加濃度のバーテポルフィンで24時間処理した。薬物含有上清培地を廃棄し、接着細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、薬物非含有培地を加えた。この研究では、細胞に対する椎骨の影響を、光に曝露しない場合、または光に1時間曝露した後、赤緑青(RGB)値255、255、および255(平均フルエンス49.1±0.6 J / cm2)を使用して調べました。24時間後、細胞生存率は、3−(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイによって評価した。

実験結果は、椎骨で処理された細胞をデバイスからの光に曝露すると、活性酸素種(ROS)によって媒介されるメカニズム を介して 薬物の細胞毒性効果が高まることを示しました。さらに、この作業で説明されているプロトタイプの使用は、結果を市販のPDTデバイスと比較することによって検証されました。したがって、このLEDベースの光線力学療法プロトタイプは、PDTの in vitro 研究のための良い代替手段を表しています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

最も致命的な非感染性疾患の中で、癌は早死の世界的な主要な原因を表しています。2020年には1,000万人近くが死亡し、世界の約6人に1人が死亡しました1。さらに、多剤耐性(MDR)現象は、承認された化学療法プロトコルがこの臨床状態の寛解段階に到達できないため、公衆衛生上の大きな脅威を表しています2。癌細胞は、いくつかのメカニズムを通じて化学療法に対する耐性を発達させることができます。しかし、一部のATP結合カセット(ABC)トランスポーター(ATP依存性排出ポンプ)の過剰発現は、腫瘍微小環境内でのMDR発生の主な原因と考えられています3。MDRに加えて、再発や転移などの他の癌合併症は、この腫瘍学的課題を克服するための治療アプローチを開発および改善するという緊急の要求を強化します。

光の治療的利用は何世紀にもわたって実践されており4、光線力学療法(PDT)は、固形腫瘍の臨床的に承認された治療アプローチを表しています。PDTは、光増感剤(PS)の投与とそれに続く光照射を組み合わせて活性酸素種(ROS)を生成し、腫瘍細胞に選択的な細胞毒性を発揮します。この治療アプローチは、手術、放射線療法、化学療法などの従来の方法よりも優れています5。これは、結合組織6においてより低い細胞毒性を示す低侵襲技術である。腫瘍またはその微小環境に直接光を当ててPSを蓄積することで、正確な標的化が保証され、その結果、軽微で望ましくない全身性の副作用7と、同じ部位での繰り返し治療の可能性が保証されます。さらに、コストは他のアプローチよりも低くなります。その有望な特徴により、PDTは、特に手術不能な腫瘍の場合の単一または補助的な癌治療7の両方にとって適切な選択肢と見なすことができ、化学療法に関連するMDRの代替手段となります8,9。

PDTを用いた高い客観的奏効率を示す最初の報告は、マウスおよびラットモデル10において1975年に記載された。それ以来、PDTを用いて研究が行われ、2D細胞培養におけるヒト腫瘍細胞株を用いたin vivoおよびin vitroの両方で陽性の結果7が得られました11,12。臨床的に承認されたPSの幅広い適用性を考慮すると、それらの特定の蓄積経路および吸収ピークの波長範囲にかかわらず、一般的なプロセスは以下の通りである:(i)PS取り込み、(ii)腫瘍またはその微小環境におけるPS濃度のピーク、(iii)光の適用、(iv)PS光相互作用、(v)PS励起状態エネルギーの組織基質または周囲の酸素分子のいずれかへの伝達、 (vi)一重項酸素またはスーパーオキシドアニオンを含むROS産生、(vii)腫瘍細胞死を介した、本質的に、壊死またはアポトーシス(直接死)、オートファジー(細胞保護機構)、組織虚血(血管損傷)、免疫調節、またはこれらの機構の重複7。この最終段階では、特定の細胞死経路の活性化は、細胞特性、実験デザイン、そして最も重要なことに、PS細胞内局在およびPDT関連の標的損傷などの多くの要因に依存する13。

Verteporfinは第2世代のPSであり、加齢黄斑変性症を治療するためにノルウェーと中国で臨床使用するために規制当局によって承認されています7。用量送達後、このプロドラッグはミトコンドリアに部分的に蓄積し14、細胞タンパク質チロシンリン酸化およびDNA断片化を誘導し、腫瘍細胞のアポトーシスをもたらすことが報告された15,16。椎骨のインターナリゼーションのための24時間のインキュベーション後、隣接する分子への電磁放射伝達の有効レベルを達成するために、690nmの波長設定を使用するPDTプロトコルが推奨されます7,17。

PDTの光源に関しては、従来のダイオードレーザーシステムは通常高価で、技術的に複雑で、特大であるため、持ち運びが困難です18,19。LEDベースのPDT機器でも観察できる単一波長プロファイルの結果として、各光増感剤アプリケーションのための独立したユニットの需要は、ダイオードレーザーシステムの利用をさらに複雑にし、経済的に実行不可能にします20,21。したがって、LED機械の利用は、コスト22とメンテナンスの問題を解決するだけでなく、高出力と害の少ない23とより広い照明能力を提供する最も有望な代替手段と考えられています24,25,26,27。

LEDベースの機器がPDT実験28に提供できる潜在的な貢献にもかかわらず、ほとんどの商用オプションには、携帯性の欠如、高コスト、複雑な建設プロジェクトおよび操作29などの欠点が依然としてあります。この研究の主な目的は、 in vitro PDTアッセイのためのシンプルで信頼性の高いツールを提供することでした。本稿では、安価で使いやすく、ポータブルな自社製のLEDベースのPDTデバイスであるPhotoACTについて説明します。概念実証として、このデバイスは、2D細胞培養モデルにおける椎骨ポルフィンの細胞毒性を高めることが示されているため、PDT実験の研究ツールとして使用できます。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意: このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、およびソフトウェアに関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。

1. デバイス構築

  1. 厚さ3mmの中密度繊維板(MDF)を鋸で挽き、 図1Aに示す寸法のピースを得ました。
    注意: コンピューター数値制御(CNC)切断には、ベクターファイル(補足ファイル1)を使用してください。
  2. 次の寸法(長さx幅x高さ)の2つのボックスを作成します:大きいボックスの場合は330 mm x 235 mm x 225 mm、小さいボックスの場合は300 mm x 220 mm x 150 m(図1B)。
  3. 大きい方の箱の背面にドリルで穴を開けて、バレルジャックコネクタを取り付けます。大きい方の箱の上部にドリルを開け、小さい方の箱の上部と下部をドリルで開けて、電気ケーブル用の通路を確保します(図1C)。
  4. すべての内面を黒インクでペイントして、均一な光の入射を促進します(図1D)。
  5. 小さい方のボックスの上部内面に、それぞれ10個のLEDが付いた3本のLEDテープを並行して取り付けます(図1E)。
  6. 小さい方の箱の底面の内面の中央に輝度センサーを取り付けます(図1F)。
  7. 3D印刷ファイル(補足ファイル1G)を使用して、コントロールユニットの構造(図2G)を印刷します。
  8. すべてのコンポーネント(電源ボタン、ポテンショメータ、時刻/開始タッチパッド、LED、輝度センサー、LCD、ブザー、および電源装置)を、コントロールユニットの内部に取り付けられたESP32コントロールボードのポートに取り付けます(図2)。
  9. プログラミングコード(補足ファイル3、補足ファイル4、補足ファイル5)をアップロードし、テストを実行して、すべての接続が機能していることを確認します(図1H)。
  10. ボックスを組み立てて固定し、隙間を防ぎ、その結果、外光の干渉や放出された光の損失を防ぎます。取り付けられたコントロールユニットをプロトタイプの上部にあるドリル領域に取り付けます(図1I)。
  11. 同じ素材と330 mm x 225 mm(長さx幅)の寸法のフロントドアを、2つの小さなヒンジで大きなボックスに固定します。また、ベルクロテープを大きな箱に横向きに取り付けて、プロトタイプのクロージャーを補強します(図1J)。機器の正面玄関を操作するためのハンドルを取り付けます。
  12. プロトタイプの下部に4つのゴム製フットパッドを取り付けて、操作中の安定性を確保します(図1K)。

2.細胞株:培養、播種、処理

  1. 化学薬品
    1. ポルフィリンをジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解して、100 mMの濃度を達成します。
      注意: DMSOは慎重に操作する必要があります(個人用保護具を使用したり、換気された場所で取り扱ったりしてください)。ストック溶液と希釈液の両方を慎重に操作して、過度の光にさらされないようにします。
  2. 細胞株
    1. 10%ウシ胎児血清と1%ゲンタマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)低グルコース培地でHeLa細胞株を培養します。
    2. 培養フラスコを37°Cの5%CO2 細胞培養インキュベーターに保管する。
    3. 細胞が80%〜90%のコンフルエントに達するまで細胞を管理および検査します。
  3. 播種プロセス
    1. フラスコから培地を取り出します。
    2. 細胞単層をPBSで洗浄する。
    3. コンフルエントな細胞培養液をトリプシン-EDTA(0.5%)で1回、37°Cで5分間剥離します。 10%ウシ胎児血清と1%ゲンタマイシンを添加した培養液で細胞を再懸濁することにより、トリプシンの作用を停止します。
    4. 再懸濁した細胞を血球計算盤でカウントし、2.0 ×10 4 細胞/ウェルの96ウェルプレートに播種します。
    5. 暗い状態と明るい条件のために2つのプレートを準備します。
    6. 細胞付着のためにプレートを24時間インキュベートします。
  4. 治療の流れ
    1. 両方の96ウェルプレートから培地を除去します。
    2. 細胞を100 μLの増加する濃度のバーテポルフィン(0.045〜24 μM、段階希釈)で処理します。
    3. 細胞を薬物処理で24時間インキュベートして、椎体ポルフィンのインターナリゼーションを可能にします。
    4. 24時間後、薬物を含む培地を廃棄し、単層の細胞をPBS(100μL)で洗浄し、薬物を含まない培地(100μL)を加える。
    5. 1枚のマイクロプレートをアルミホイルで覆い、光にさらされないように保護し、24時間インキュベートします。このプレートは、PDT結果(暗条件)の制御データを提供します。もう一方のマイクロプレートは、デバイス内の光露光条件で使用されます。

3.デバイスの操作

  1. PDTデバイスを電源コンセントに差し込み、 電源 ボタンを押して電源をオンにします。
  2. もう一方のマイクロプレート(光の状態)をPDTデバイスに置き、フロントドアをベルクロテープで固定して機器を閉じます。
  3. ポテンショメータを使用してRGB構成を調整し(ここではRGB 255 、255、255 の実験)、発光の色を設定します。
    注:RGBの組み合わせごとに特定の発光スペクトルがあり、異なる光増感剤を使用した実験のために調整する必要があり、その結果、異なる吸光度曲線があります。
  4. (+) /(-)タッチパッド を押して時間 構成 を調整し(ここでは 60分の 実験)、 アッセイの期間を設定します 。
    注:放射照度値に関連する時間構成は、プロセスのフルエンス、つまりアッセイに適用される光線量を決定します。
  5. ディスプレイで セットアップ 情報を確認してください。
  6. スタートボタンを押してアッセイを開始します。アッセイの開始時にビープ音が1回鳴ることを確認します。
  7. 実験の過程で、 放射照度 や 残り時間などのリアルタイム情報をディスプレイに観察します。
  8. PDTアッセイ中は、フロントドアを開けたり、構成を変更したりしないでください。
  9. アッセイの最後に、ビープ音が4回鳴り、電子システムがすべてのLEDをオフにするのを待ちます。ディスプレイで、 完了 メッセージと実験中に消費された最終的なエネルギー量(フルエンス)を観察します。
    注: フルエンスの最終値は、式 (1) を使用して計算されます。
    figure-protocol-1 (1)
    ここで、F は J/cm 2 に等しく、I は mW/cm 2 または mJ/s·cm 2 に等しくなります。放射照度の値は、LED(発光源)の効力と暗室の均一に照射された領域(660cm2)を考慮します(式[2]):
    figure-protocol-2 (2)
    理論上の放射照度値は、PDTアッセイ全体を通してデバイスディスプレイに表示されます。操作の最後に、式 (3) を使用してフルエンスを計算します。
    フルエンス(F)=放射照度(I、定数値)×動作時間(s) (3)

4. 細胞生存率アッセイ

  1. PDTアッセイ後、光にさらされたマイクロプレートを覆い、24時間インキュベートします。
  2. インキュベーション期間の後、両方のプレートから培養液を取り出し、単層の細胞をPBS(100 μL)で洗浄し、MTT溶液(0.5 mg/ml、100 μL)を加えます。プレートを暗条件と明条件の両方で4時間インキュベートして、ホルマザン結晶を形成します。
  3. MTT溶液を注意深く取り除き、紫色の結晶をDMSO /エタノール(1:1)溶液で溶解します。
  4. 結晶が完全に溶解した後、595nmでマイクロプレートリーダーを用いて吸光度測定を行う。
    注:このデバイスは、フローサイトメトリー30による光曝露後の光増感剤によって引き起こされるROS媒介細胞死などの他の重要な実験に使用できます。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PhotoACTと名付けられた最後のPDTデバイスには、最大4つのマルチウェルマイクロプレートを割り当てるための暗室が含まれ、その上部内面には、異なるスペクトルの可視光を放出するようにプログラムされた30個の散乱LEDのセットが装備されています(図3 および 補足ファイル6)。このデバイスは、PDTアッセイ用の暗室として設計された内部ボックスと、内部チャンバーを覆い、制御ユニットを保持するための外部ボックスの2つの関連ボックスを使用して構築されました(図1B)。内部ボックスは黒く塗られ(図1D)、30個のLEDと長さ1 m(後で3つにカットされた)と内蔵プロセッサを保持する9ワットのLED RGB WS2812(またはWS281B)のテープモデルで構成されていました。この装置は、より制御された利用を可能にし、その結果、より正確な発色を可能にした。30個のLEDは、それぞれ10個のLEDを備えた3本の平行なテープによって、PDT...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

最終的なPhotoACTデバイスは、市販の低コストコンポーネントで50ドル未満の総コストで構築するのに便利でした。さらに、メンテナンスの要求が少ないこと、複数種類の培養プレートを照射できること、アッセイごとに最大4ユニットの同時使用、携帯性を可能にする軽量(2kg)/サイズ(44cm3)、正確で再現性のある照射(データ未表示)、コンピュータや他の機械への接続を必要としないユーザーフレンドリーでシンプルなセットアップインターフェースなどの利点があります。

建設プロトコルと運用プロトコルの両方の特定の重要なステップは、プロジェクトの構想中に改善の機会を生み出しました。PDTチャンバーは均質な発光と一貫したエネルギー測定を必要とするため、外部光干渉と放射光損失の両方を回避するために、内部ボックスと外部ボックスを密閉しました。追加のベルクロテープを正面ドアに横向きに固定して、チャンバーの閉鎖を補強し、中断のない実験を確保しました。必要なRGB構成を証明するために、コントロールユニットに代表的なLEDを取り付け、アッセイ中に放出された光の色と強度を示しました。最後に、プ...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は競合する利益を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

撮影プロセスを手伝ってくれたアーサー・エンリケ・ゴメス・デ・オリベイラとルーカス・ジュリアン・クルス・ゴメスに感謝します。このプロジェクトは、ブラジル研究評議会(CNPq、助成金番号400953 / 2016-1-404286 / 2021-6)およびFundaçãoAraucária-PPSUS 2020/2021(SUS2020131000003)の支援を受けました。この研究は、Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil(CAPES)-Finance Code 001によっても資金提供を受けた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5% トリプシン-EDTA (10倍)Gibco15400054哺乳類細胞培養解離試薬
3D プリンタFlashforgeFinder モデル
96 ウェルプレート非滅菌、ポリスチレン、高結合面プレート、平底ウェル、2D 細胞培養用
Arduino
輝度センサ0.1-40.000+ルクス検出レベルとI2Cインターフェース
ザー
細胞培養フラスコ滅菌、ポリスチレン、組織培養(TC)処理された表面、傾斜したネックとベントキャップ(サイズ)
を備えた長方形の底フラスコTSL2561アッセイの播種ステップでの細胞培養希釈に使用される容量15/50 mLの滅菌ポリプロピレンチューブ
CO2インキュベータ
コントローラーボードESP32
デザインソフトウェアTrimbleSketchUp
DMEM High GlucoseGibco11965092DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)は、多くの異なる哺乳類細胞の増殖をサポートするために広く使用されている基礎培地です。
DMSOSigma-AldrichD4540-500MLジメチルスルホキシド、≥99.5%(GC)、植物細胞培養に適した
ウシ胎児血清 Gibco12657029FBS は、長期にわたる細胞増殖と継代にわたる一貫性を提供することで、最高の価値を提供します。
ゲンタマイシン (50 mg/mL)Gibco15750060この菌から精製された水溶性抗生物質 Micromonospora purpurea。ゲンタマイシンは細胞培養の汚染を防ぐことによって作用
血球計算盤ノイバウアーパターンチャンバー アッセイの播種ステップでの細胞カウントに使用される
倒立型ラボ顕微鏡ライカDM IL
LED 層流フードキャビンは、HEPAろ過された空気のワーク上の一定の一方向の流れを維持することにより、作業環境を汚染物質から保護するように設計されています面積。細胞培養および治療手順のいくつかのステップで使用されます:
LCDディスプレイ
LED、RGB、WS28125050、RGB SMDモデル、プロセッサ内蔵モデル。30個のLED付きテープ、長さ1メートル、長さ9ワット
MDFファイバーボード厚さ3mmの中密度ファイバーボード
マイクロ遠心チューブ安全蓋付き無菌ポリプロピレンチューブ、容量1.5/2.0mL。アッセイの治療ステップで少量を操作するための便利なツール
マイクロプレートリーダーThermoFischerMultiskan FCマイクロプレート光度計は、広い波長範囲の吸光度(340-850nm)を検出するように設計されています。この装置は、MTTインキュベーション後の細胞生存率を評価するために使用されました。
MTT試薬InvitrogenM64943-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド。細胞生存率アッセイに使用
Operational SystemReal Time Engineers ltd.FreeRTOS
P10 micripipette非電子、シングルチャンネル、1-10 μL容量
P1000マイクロピペット電子、シングルチャンネル、10-1000 μL容量
P200マイクロピペット非電子、シングルチャンネル、20-200 μL容量
PDT装置LumaCareモデル LC-122
リン酸緩衝生理食塩水 pH 7.4Gibco10010031培養およびアッセイ手順中に細胞を洗浄するために使用されるバランスの取れた塩製剤
ポテンショメータ
ヒント非滅菌、ユニバーサルフィット、10/200/1000 μL最大容量
Verteporfinグマ-AldrichSML0534-5MGベルテポルフィン、≥94%(HPLC対応)
ボタンブーします 、非シ

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