カエノラブディティス・エレガンスのマイクロバイオーム研究のための微生物的に多様な自然のような環境としての堆肥小宇宙

線虫のCaenorhabditis elegansは、宿主とその腸内細菌叢との間の相互作用を研究するための有用なモデルとして浮上しています^1,2。モデルとして、それはいくつかの利点を提供します。第一に、無菌動物または無菌動物は入手と維持が容易です。漂白剤は、妊娠虫や関連する微生物を殺すために使用でき、漂白剤耐性の卵を無傷のままにして、関心のある細菌によってコロニーを形成することができる年齢同期集団として成長します^3,4。さらに、細菌の存在下で増殖すると、細菌であるC.エレガンスは、遭遇した細菌を摂取し、感受性種が消化または排泄され、耐性種と持続性種が安定して虫の腸にコロニーを形成します。さらに、C.エレガンスは主に雌雄同体であり、遺伝的に同一の子孫の集団を生み出し、交絡遺伝的変異を減らします。変異株およびトランスジェニック線虫株の利用可能性と相まって、C. elegansとの共同研究は、宿主と微生物の相互作用の分子基盤を調査するためのグノトバイオティックで遺伝的に扱いやすいモデルを研究者に提供します5,6,7,8。

十分に特徴付けられた細菌を用いた実験は分子メカニズムの解析を容易にすることができるが、そのようなメカニズムの多様性を探り、その機能の自然な文脈を解明し、それらの進化を形作った選択力を理解するためには、細菌が自然界で相互作用する細菌を特定して研究することが不可欠です。実験室の外では、 C. elegans は世界的に湿潤温帯気候で見られ、そこでは個体群は「ブームとバスト」のライフサイクルを経験すると考えられており、資源が豊富であるときに急速な個体数増加が続き、資源が枯渇すると先駆的でストレス耐性のあるダウアーに発達的にシフトします⁹。土壌線虫と考えられていますが、野生で増殖する C.エレガンスの 個体群は、細菌の個体群が豊富で多様である腐った花や果物などの分解有機物を食べているのが最も一般的です。

野生から分離された線虫の腸内細菌叢の研究により、多様でありながら特徴的な細菌群集が特定され^10,11、その組成は、自然のような小宇宙環境で飼育された線虫で実施された研究によってさらに裏付けられました^12,13。一緒に、そのような研究はコアワーム腸内細菌叢の描写を可能にしました²。野生のC.エレガンス個体群のサンプリングは、自然の虫と微生物の相互作用の最も直接的な調査を表していますが、降水量の多い地域や季節に限定されているため、いつでもどこでも実行可能ではありません^10,11。あるいは、ワームを自然の生息地から分離する代わりに、小宇宙を使用した実験では、自然の生息地を実験室に持ち込みます⁶、⁸、12、^13、14、15。小宇宙環境は、さまざまな果物や野菜で堆肥化された土壌から作られ、出発土壌群集のさらなる多様化を可能にします。それらは、微生物の多様性と3次元の野生土壌環境を、制御された実験施設と遺伝的に定義されたワーム株の実験的利点と組み合わせた扱いやすい実験方法を提供します。以下のプロトコルは、堆肥の小宇宙を扱うことに関連する手順を詳述し、多様な環境からの特徴的なワーム腸内細菌叢の組み立てを理解する上でのそれらの使用を示しています。

1.堆肥の準備

1. 便利な供給源から堆肥や庭の土を入手し、空気を入れるために蓋に穴を開けた標準的なキッチンプラスチック容器に実験室内に保管します。ショウジョウバエや他の無脊椎動物を防ぐために、脱脂綿で穴を塞ぎます(図1A)。
   注:500グラムの土壌(1.5ガロンの容器に収まる、寸法:30 cm x 20 cm x 10 cm)は、12の小宇宙に十分な材料を提供します。
2. 堆肥または土壌を、刻んだ農産物または異なる農産物の混合物を、農産物と土壌の質量比が1:2で濃縮します。
3. 20〜25°Cで7〜14日間インキュベートし、1日1回混合し、必要に応じてM9培地を加えて、濁らせずに水分を維持します。
   注:農産物が豊富でない土壌は通常、 C.エレガンス の成長をサポートしませんが、使用する特定の農産物は研究者次第であり、ワームの成長をサポートできる多くの種類と混合物があります。さまざまな農産物で濃縮すると、さまざまな方法で細菌群集の多様化が促進され、さまざまな出発点からの腸内細菌叢アセンブリの研究が可能になります(ディスカッションセクションを参照)。

2.堆肥小宇宙の調製

1. 各小宇宙について、スズ箔とオートクレーブで覆われた30 mLのガラスビーカーに10 gの濃縮堆肥を追加します(図1B)。
2. オートクレーブ処理した堆肥を補充するための微生物抽出物を調製するには、まず、ステップ2.1で使用したのと同じ堆肥30gを3本の50mLチューブのそれぞれに加え、M9を充填します。1分間渦巻きます(図1C)。
   注:これは、それぞれが数百の線虫の発生をサポートする9つの小宇宙に十分な細菌を提供するはずです。
3. チューブを560 × g で室温(RT)で5分間遠心分離します。
4. ペレットを乱さないように注意しながら、血清学的ピペットで上清を取り除き、新しい50mLチューブで混ぜ合わせます。
5. RTで最高速度(2,000 × g)で15分間遠心分離して細菌抽出物を濃縮します。 ペレットを十分なM9に再懸濁して、各小宇宙に200 μL、さらに200 μLを加えて、小宇宙内のワーム発生の目に見える代理として機能するプレートに追加します。
   注:たとえば、9つの小宇宙の場合、微生物ペレットを2mLのM9に再懸濁します。
6. 200 μLの濃縮微生物抽出物を、オートクレーブ処理された堆肥の各ビーカーと、目に見えるプロキシプレートとして機能するNGMプレートに追加します。
7. ワームを添加する前に、ミクロコズムとプロキシプレートを20〜25°Cで24時間インキュベートします。

3.堆肥の小宇宙でワームを育てる

1. 500〜1000個の卵またはL1幼虫³ を各小宇宙とプロキシプレートに追加し(ステップ2.7)、実験を開始します(図1D)。
   注:ここで説明する実験では、N2野生型ワームを利用します。しかしながら、他の C.エレガンス 株(および潜在的に他の線虫)を使用することができる。
2. ワームを20°C(通常は3日間)で成体になるまで上げます。

図1:堆肥の小宇宙の準備、ワームの飼育、収穫 。 (A)地元の土壌または堆肥を農産物で豊かにし、2週間インキュベートします。(B)オートクレーブ滅菌された濃縮土壌と(C)微生物抽出物を組み合わせ、(D)少なくとも24時間インキュベートしてから、同期したL1ワームを小宇宙に追加して実験を開始します。(E, F)収穫の準備ができたら、小宇宙からの堆肥をベアマン漏斗サポートシリンダーに加え、M9で覆います。(g)15分後、ろ液を50mLチューブに放出する。略称:sup. = 上清。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4.ワームを収穫するためのベアマン漏斗の準備

1. プラスチック製の漏斗の端に5〜8 cmの硬質ゴムチューブを取り付けて、Baermann漏斗を組み立てます。
2. クランプをチューブにスライドさせ、クランプで閉じます。
3. 漏斗に、長さ7 cm、直径5 cmの円筒形のPVCパイプを置き、その底に1 mmのナイロンメッシュを接着します(図1E)。シリンダーに2枚のティッシュペーパーを並べます。
4. ベアマン漏斗をフラスコに入れます(図1F)。

5.小宇宙からワームを収穫し、それぞれの土壌サンプルを収集する

1. ワームが飼育された小宇宙に20mLのM9を加え、混合物を攪拌してから、ビーカーからBaermann漏斗セットアップのティッシュペーパーで裏打ちされたシリンダーに混合物を注ぎます。M9を追加して、堆肥を漏斗に完全に沈めます。
   注: C.エレガンス (N2)の個体群は、 大腸菌を播種した標準的な寒天プレートと同様の速度で堆肥の小宇宙で成体に達します。特定の発生段階でワームを収集する際のさらなる精度については、ステップ3.3のプロキシプレートを参照してください。
2. 30分後、クランプを外して、収穫したワームを含むろ液を50 mLチューブに放出します(図1G)。
3. シリンダーにM9を追加し、2回目のラウンドを繰り返してさらにワームを収穫し、追加のワームが必要な場合はもう一度繰り返します。
   注意: 収穫ラウンドを繰り返すときは、土壌粒子が通過する可能性のあるティッシュペーパーの完全性を損なわないように注意してください。最大4回の収穫ラウンドで、ティッシュペーパーの完全性を損なうことなく、小宇宙に最初に追加されたワームの少なくとも50%を分離する必要があります。
4. 560 × g で2分間遠心分離してワームを濃縮します(RT)。血清学的ピペットで35 mLの上清を除去します。
5. 残りの15 mLを15 mLチューブに移し、560 × g で1分間遠心分離して、ワームをさらに濃縮します。血清学的ピペットで上清14 mLを除去します。
6. 並行して、残りの小宇宙土壌1 gを1.5 mLチューブに集めます。環境細菌群集を含む土壌サンプルを直ちに処理するか、後で核酸を抽出するために-20°Cで保存します(ワームサンプルの場合、以下で説明します)。

6.収穫されたワームの洗浄と表面滅菌

1. 濃縮、採取したワーム1 mLをステップ5.5からガラスピペットを使用して1.5 mLチューブに移します。ワームがチューブの底に落ち着くように2分間インキュベートします。上清を除去し、下部100 μLを乱さないようにします。
2. 1.5 mLのM9 + T(M9では0.025%Triton-X)で6回洗浄し、ワームが毎回底に定着するようにします。
3. 洗浄したワームを100 μLの容量で、ガラスピペットを使用して新しい1.5 mLチューブに移します。
   注意: プロトコルのこの時点で、最初の洗浄から約30分が経過しているはずです(ステップ6.2)。レバミゾールを添加する前に少なくとも1時間、ワームを食物なしで放置することは、一過性の細菌の排泄および食物細菌の完全な消化を可能にするために推奨される。
4. 100 μLの25 mMレバミゾール塩酸塩を加えて、ワームを麻痺させます。RTで5分間インキュベートします。
5. 200 μLの4%漂白剤溶液を追加します。2分間インキュベートします。
6. 最下段の150 μLを乱さずに上清を取り除き、上記のようにM9+Tで3回洗浄します。
   注意: サンプルの汚染を最小限に抑えるために、フィルター付きのM9 + T(0.2 μmフィルターを介して)を使用し、この時点から手袋を着用することをお勧めします。
7. 洗浄後、最後の洗浄から残りの150 μLのうち50 μLを採取し、LBプレート上にプレートし、25°Cで48時間インキュベートして、外部細菌の効果的な除去を確認しました。
   注:最後の洗浄で最大30のコロニー(サンプルに残っている合計60の外部細菌細胞を表す)を観察することは許可されており、各成虫に典型的にコロニーを形成する数千の細菌を考えると、分析された微生物叢組成へのわずかな寄与しか持たないことが期待されます¹⁵。それ以上が観察されると、サンプルの完全性が損なわれる可能性があります。
8. 表面滅菌したワームを直ちに使用するか(例えば、培養用の生菌を抽出するため[CFUカウント])、またはその後の核酸抽出のために-20°Cで保存してください。

7.DNA抽出

注:次の手順では、土壌から微生物DNAを抽出するために設計された市販のキット( 材料の表を参照)を使用して、収穫されたワームのDNA抽出について説明し、ワームからの微生物DNAの抽出を容易にするために以下に説明する変更を加えます。

1. 表面滅菌ワームを含むサンプルをキット付属のチューブに移し(必要に応じてRTで解凍)、付属のガラスビーズを直径約30〜50 1 mmのジルコニアビーズと交換します(材料の表を参照)。
   注:観察されたDNA収量は、キットに付属のガラスビーズよりもジルコニアビーズの方が高くなります。この観察の背後にある理由は不明ですが、ジルコニアビーズは線虫のキューティクルをより効率的に壊し、より多くの細菌を放出する可能性があります。
2. 堆肥サンプルの場合は、ガラスビーズを交換せずに、収集した土壌を約250mgをキットのチューブに追加します。
3. キットから提供された緩衝液をすべてのサンプルに加えた後、RTのパワーホモジナイザー( 材料表を参照)で2,000 rpmをそれぞれ30秒間2ラウンドホモジナイズし、その間に30秒間一時停止します。
4. キットのプロトコルに従って残りのDNA精製手順を完了します。ワームサンプルを50 μL以下の溶出バッファーで溶出し、シーケンシングに十分なDNA濃度を確保します。

土壌小宇宙のコミュニティを多様化する能力を探るために、カリフォルニア州バークレー市から入手可能な工業用グレードの堆肥である同じ初期土壌を、リンゴ、ピーマン、オレンジ、ジャガイモ(それぞれ三重にセット)の異なる農産物で濃縮することによって調製された堆肥小宇宙の微生物群集を比較しました。さらに、各堆肥環境の微生物群集を、それぞれの小宇宙で飼育された野生型 C.エレガンスの 腸内細菌叢と比較しました。分析は、小宇宙ごとに約500人の表面滅菌された成人から抽出されたDNAサンプルと、それぞれの小宇宙の250 mgの堆肥サンプルから抽出されました。

環境土壌と虫腸内細菌叢の特性評価は、細菌16S rRNA遺伝子のV4領域の次世代シーケンシングに依存していました。シーケンシングライブラリの調製は、標準キットを使用して達成され、製造元の指示に従って実行され、シーケンシングは市販のシーケンサーで実行されました(材料の表を参照)。デマルチプレックス配列はDADA2を使用して処理され、SILVA v132参照データベースに基づいて分類法が割り当てられ、phyloseq16、17、18で解析されました(補足ファイル1、補足図S1、補足図S2、補足図S3、補足表S1、および補足表S2を参照)。 シーケンシングと分析の詳細な説明。完全な計算パイプラインは GitHub [https://github.com/kennytrang/CompostMicrocosms]) で入手できます。生データはNCBIシーケンスリードアーカイブ(バイオプロジェクトID PRJNA856419)で入手できます。

平均して、サンプルあたり73,220の配列が得られた。これらの配列は、27門と216科にまたがる15,027のアンプリコン配列変異体(ASV)を表しており、これには、リゾビア科、バークホルデリア科、バチルス科などのコアC.エレガンス腸内細菌叢13の一部と見なされる家族が含まれます。以前は優勢なメンバーであることが判明していた腸内細菌科とシュードモナス科は、今回は少数派でしたが、それぞれの土壌環境と比較して依然として濃縮されています(2〜10倍)。重み付けされていないUniFracと重み付けされたUniFracの両方の19,20距離に基づく比較は、密接なクラスタリングによって示されるように、同じ農産物で濃縮された小宇宙の三重体の間で良好な再現性を示しました。対照的に、異なる農産物で強化された環境土壌微生物叢は互いに離れてクラスター化し、異なる農産物を追加することで初期の微生物群集を多様化する能力を示しています(図2)。

ワーム腸内細菌叢と環境コミュニティの比較では、重み付けされていないUniFrac距離または重み付けされたUniFrac距離のいずれかを使用した主座標分析(PCoA)は、各マイクロコズムタイプについて、それぞれの環境のそれから離れたワーム腸内細菌叢の明確なクラスタリングを示しました(図2)。重み付けされていないUniFrac距離に基づくPCoAは、土壌とワームのマイクロバイオームを区別しませんでしたが(図2A)、重み付けされた距離に基づくクラスタリングでは、ワームの腸と堆肥のマイクロバイオームの明確な分離が明らかになりました(図2B)。これらの結果は、宿主フィルタリングが環境の利用可能性に基づいて作用し、分類群の存在に関して環境源と完全に区別されていないが、利用可能な分類群のサブセットを濃縮することによってそれらの存在量を調節し、最終的に異なる環境で育てられたワーム間で共有されるコアワーム腸内細菌叢を形成するプロセスを支持しています。

図2:それぞれの農産物が多様化した微生物環境から離れてクラスター化するワーム腸内細菌叢。 マイクロバイオーム組成は16Sシーケンシングで決定され、指定された農産物で濃縮された小宇宙またはそれらで育てられたワームからのコミュニティは、(A)重み付けされていないまたは(B)重み付けされたUniFrac距離に基づいてPCoAを使用してクラスター化されました。示されている軸は、サンプル間の群集組成の最大の変化を説明する軸です(各小宇宙タイプでN = 3)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:次世代シーケンシングとデータ解析。 ここでは、ライブラリ調製、ラボ内シーケンシング、およびデータ解析の手順を示します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S1:1つのサンプルから逆読み取りするための精度管理グラフの例。 X軸(サイクル)は、読み取られた配列に沿ったヌクレオチド位置を示す。左側の Y 軸は品質スコアを示します。グレースケールヒートマップは、各ヌクレオチド位置における品質スコアの頻度を表します。緑色の線は、各ヌクレオチド位置における品質スコアの中央値を示しています。一番上のオレンジ色の線は、品質スコア分布の四分位数を示しています。下の赤い線は、そのヌクレオチド位置を拡張した配列リードの割合を示しています(右側のY軸、ここでは100%)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S2:異なるサンプルのエラー率。 異なるサンプル(黒い点)の誤差頻度は、予想される傾向を反映して、示されている各可能な塩基対置換の品質スコアが増加するにつれて減少するはずです。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S3:加重ユニフラク距離に基づくPCoAの例。 凡例に示されているグループ名は、さまざまな小宇宙で使用される堆肥を豊かにするために使用される農産物を表しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S1:シーケンシャルシーケンスフィルタリング。 あるフィルタリング前のシーケンス読み取り数。b-d 各列は、低品質読み取りの除外 (ステップ 2.5)、dada() によって実行されるノイズ除去アルゴリズム (ステップ 2.8)、順方向読み取りと逆方向読み取りのマージ (手順 2.9)、キメラの削除 (ステップ 2.11) のフィルター処理ステップの後に残っているシーケンス読み取りの数を表します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表 S2: メタデータ テーブル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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