ヒト胞状卵胞からの系統特異的細胞の抽出、標識、精製

ヒト卵巣の主要な機能要素は卵胞であり、卵母細胞の成長と発達を支配する。卵胞細胞を単離するためのプロトコルは、 体外 受精の文脈で十分に確立されていますが、これらは卵母細胞回収の時点で黄体化卵胞から細胞を収集する場合にのみ適切^です1。私たちは、天然の卵巣または異種移植された^{卵巣組織から}生じるさまざまな発生段階で、胞状卵胞から離散細胞集団を分離できるようにするプロトコルを開発しました2。卵母細胞の培養に対する卵胞常在細胞の寄与が非常に重要であるというコンセンサスがありますが、胞期卵胞に存在する固有の表現型サブタイプを前向きに特定して抽出した研究はほとんどありません。異なる発生段階における特殊細胞間の分化階層とシグナル伝達のより深い理解は、恒常性および病理学的条件下での卵巣生理学の理解を広げる可能性があります。さらに、個別の細胞サブタイプと卵胞の成長/成熟へのそれらの分子的寄与の識別は、卵母細胞の成熟を促進し、および/または内分泌機能障害を治療するために卵巣機能を再構築する ex vivo 代理を生成する手段を提供する可能性があります。

卵巣内のそれぞれのユニークな細胞型は、卵胞の複雑な機能に寄与し、卵胞に含まれる卵母細胞の成長と成熟を促進するための個別のミニ器官として効果的に機能します。卵胞の中心である卵母細胞は、顆粒膜細胞(GC)の連続層に直接包まれており、テカ細胞(TC)は卵母細胞およびGCと結合して卵胞単位を構成する細胞の二次層を形成します。GCとTCは2つのグループに分類されますが、多数のサブタイプが含まれています。GCは卵胞内の位置に従って分類されます。卵母細胞を囲むGCと基底膜に隣接するGCは、それぞれ卵母性GCと壁状GCとして指定され、これらのサブタイプは固有のトランスクリプトームシグネチャを示します。TCには、ステロイド産生性、代謝性、および構造的サポートを提供するように機能する多数のサブタイプがあります。内皮細胞、血管周囲細胞、および免疫細胞は、正常な卵巣生理機能を維持する上で中心的な役割を果たします。卵巣間質は、卵胞の成長の基質として機能するだけでなく、TCを生じさせる前駆細胞の供給源を提供する可能性があります。卵巣内の細胞サブタイプのこの多層複合体は、内分泌器官と生殖器官の両方としての機能を可能にするものです。

この論文は、胞状卵胞からの顆粒膜、テカ、間質、内皮、および造血細胞の同定と精製のためのプロトコルを提示します。このプロトコルを利用して、これらの卵巣細胞を分離し、シングルセルシーケンシングを使用して分析し、その後、さまざまな発生段階の卵胞で特異的染色を行いました。このプロトコルは、複製可能な簡単な方法論を提供し、卵巣の生理学と病理学の両方の高解像度分析を可能にします。

マウスを含むすべての手順は、ワイルコーネル医学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。卵巣組織を用いたすべての異種移植実験は、関連するガイドラインおよび規制に従って実施された。両方の卵巣は、放射線/化学療法の病歴がなく、内分泌または生殖状態の病歴が記録されていない14歳の脳死臓器提供者から分離されました。ワイルコーネル医学の治験審査委員会(IRB)委員会は組織の収集を承認し、組織の使用に関するインフォームドコンセントの後に臓器提供者の家族からの承認が得られました。

1.卵巣組織の収集と取り扱い

1. 卵巣全体と関連組織を収集し、滅菌生理食塩水ですすいでください。
2. 滅菌ピンセットを使用して、卵巣を滅菌容器に入れます。滅菌、緩衝、冷たい溶液(例えば、リーボヴィッツのL-15培地)を容器に注ぎます。組織が液体で完全に覆われていることを確認してください。
3. 容器を閉じ、滅菌ビニール袋を使用して二重袋に入れます。容器を氷上で隔離された箱(発泡スチロールなど)に入れて輸送します。できるだけ早く、できれば5時間^3,4を超えない時間で、卵巣を処理するラボに検体を移します。

2.卵巣組織の処理

注:虚血間隔を可能な限り短縮するために、組織がラボに到着する前にすべての試薬とツールが準備されていることを確認してください。バッファーは、凍結の1週間前までに調製し、使用するまで冷蔵することができます。

1. 卵巣処理と凍結のための準備
   1. 組織処理の準備としてバイオセーフティキャビネットに滅菌手術器具をセットします:1つの番号21メス;1つの番号11メス。鋭く細かい湾曲したはさみ。1つの長い鉗子(~150 mmの長さ);2つの中型鉗子(~110mmの長さ)。
   2. 100 mLの組織処理培地を準備します( 材料の表を参照):抗生物質抗真菌溶液を含むLeibovitzのL-15培地を0.2 μmフィルターを使用してろ過します。培地を冷やしてください。
   3. クライオバイアルにラベルを付け、各バイアルに1.5 mLの凍結溶液( 材料表を参照)を加え、4°Cで保存します。
   4. 6ウェルプレートを手元に用意して使用してください。
2. 組織の到着時
   1. 容器に70%エタノール溶液をスプレーし、完全に拭いて、バイオセーフティキャビネット内に置きます。
   2. 滅菌手袋を着用して、容器を開けます。卵巣を滅菌ペトリ皿に入れ、冷やした培地(ステップ2.1.2から)を注ぎ、組織を水和させます。卵巣が培地に半分沈んでいることを確認してください。
   3. 縫合糸やその他の材料を取り除き、残っている周囲の組織を卵巣から解剖します。

3.胞状卵胞の分離

1. 分離のために個々の卵胞を特定します。健康な卵胞を選択する際には、血液で満たされた、暗い、または非対称の卵胞は、肛門である可能性が高いため、除外します。
2. メスを使用して卵巣全体から選択した枝状卵胞を分離し、卵胞を囲む皮質組織を切除して前庭を無傷に保ちます。
3. 摘出した無傷の胞状卵胞をそれぞれ6ウェルプレートの1ウェルに入れる。説明の目的で必要な場合は、皿の下に配置された定規を使用して、卵胞の直径を決定します。
4. メスを使用して、無傷の胞状卵胞を二等分して胞状腔にアクセスし、4 mLの酵素細胞剥離培地を追加します。プレートを加湿インキュベーター内で5%_CO2 、37°Cで10分間インキュベートします。
5. 必要に応じて、追加の胞状卵胞の抽出を繰り返します。

4.卵胞常在細胞の単離

1. インキュベーション後、20%FBSを含む4 mLの利用可能な培地を加え、P1,000マイクロピペットで二等分した卵胞上で培地を繰り返し激しくピペッティングして洗い流します。
2. 培地を回収し、100 μmのフィルターに通します。
3. ろ過した上清を300 × g 、4°Cで3分間遠心分離します。上清を吸引し、標識および蛍光活性化細胞選別(FACS)のために細胞ペレット(GCで濃縮)を氷上に保存します。
4. 残りの組織をバランスのとれた生理食塩水(ハンクスなど)で希釈したコラゲナーゼ(100 U/mL)とディスパーゼ(1 U/mL)の混合物に入れ、5%_CO2 および37°Cで30分間インキュベートし、10分後と20分後に2回、粉砕と激しいピペッティング(つまり、ピペットチップを10〜15回通過)によって組織を機械的に破壊します。
5. 組織を含む培地を回収し、P1,000マイクロピペットチップでピペッティングで洗い流し、100 μmフィルター で ひずみを加えます。
6. 300 × g 、4°Cで3分間遠心分離します。上清を吸引し、標識およびFACSのために細胞ペレット(TCおよび間質細胞で濃縮)を氷上に脇に置きます。

5. 蛍光活性化セルソーティング

1. 細胞ペレットをブロッキング溶液(PBS + 0.1% FBS)に再懸濁し、4°Cで10分間インキュベートします。
2. 300 × g 、4°Cで3分間遠心分離し、上清を吸引した。
3. 細胞ペレットを直接結合した抗体を含むブロッキング溶液に再懸濁し(GCおよびTCを同定するための適切な抗体の組み合わせについては 表1 を参照)、氷上で10分間インキュベートします。
4. 細胞を洗浄し、300 × g 、4°Cで3分間遠心分離します。4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含むFACSバッファーに細胞を再懸濁し、細胞懸濁液をFACS装置に通して、ゲーティング用の蛍光色素標識抗体の蛍光強度を使用して細胞の小さな集団(500-1,000)を捕捉します。
5. 固有の部分集団の同定には、次のゲーティング戦略を利用します。
   1. GCの精製のために、CD45+細胞の周囲にゲートを描き(図1B)、CD99⁺集団からこの集団を除外します(図1Aおよび図1C)。次いで、残りのCD99+画分をさらにPVRL^+/-画分に細分化する(図1Aおよび図1C)。
   2. TCおよび間質の精製のために、総ENG+(図1A)またはCD55⁺⁽図1D)集団をゲートしてCD34+内皮画分(図1E)を除外し、ステロイド原性(ANPEP⁺)細胞と非ステロイド原性(ANPEP^-)細胞を区別します。発光スペクトルが近い蛍光色素間のブリードスルーを補正するように注意してください。
6. 選別された細胞画分の純度を検証するには、捕捉された総体積の5%をFACS装置で実行し、細胞が予想されるゲートに住み、>95%の純度で存在することを確認します。

6.卵巣皮質組織の処理

1. 卵巣の残りの部分を二等分し、卵巣皮質への損傷を避けるために注意しながら、湾曲した細かいハサミとメスを使用して髄質を切除します。
2. 最小限の髄質が残るまで穏やかにこすることによって卵巣皮質の処理と薄化を続けます。必要最小限の力を使用してください。
   注:皮質組織の厚さは1mmから1.5mmの間でなければなりません。
3. 皮質組織を卵巣の長さに沿って幅2〜3 mmのストリップに分割します。

7.卵巣組織がゆっくりと凍結する

1. 凍結の準備
   1. 凍結溶液を含む各冷却極低温バイアルに1つの皮質ストリップを置きます。
   2. 皮質ストリップを含む極低温バイアルを回転プレート上で4°Cで20分間振とうします。
2. 卵巣^{組織のゆっくりと}した凍結5
   1. 卵巣組織を含むクライオバイアルを、0°Cで開始するように設定されたプログラム可能な冷凍庫に入れます。
   2. -7°Cまで2°C/分の速度で冷却します。
   3. クライオバイアルをこの温度で10分間維持します。
   4. 液体窒素(LN₂)に短時間浸漬した綿の先端で各クライオバイアルに触れることにより、核氷結晶を形成します。
   5. サンプル温度が-40°Cに達するまで、0.3°C/minの速度で冷却します。
   6. サンプル温度が-140°Cに達するまで、冷却速度を10°C/分に上げます。
   7. LN₂に保管するためにクライオバイアルを移します。

卵巣表面から卵胞を分離し、酵素処理してGCと胞状腔周囲のテカ細胞と間質細胞を分離しました。細胞を回収し、細胞画分を胞状卵胞(直径0.5 mmから4 mmの範囲)からFACSによって純度>95%まで選別しました(図1)。

ヒト胞状卵胞内のユニークな細胞画分を標識および精製するために、酵素消化とフローサイトメトリーソーティングを組み合わせました。我々は以前に、卵胞常在画分2を特異的にマークする表面タンパク質を同定した。CD99(図1Aの赤色)はGCを特異的に標識し、PVRL1(図1Aの黄色)は、胞状卵胞のサイズ2が大きくなるにつれて、卵巣胞GCコンパートメントにますます局在することを示しました。また、エンドグリン(ENG、図1Aの緑色)またはCD55(図1D)に対する抗体がすべての間質とTCを特異的に区別し、アラニンアミノペプチダーゼ(ANPEP、図1E)がアンドロゲンTCによって特異的に発現されることも示しました2,6。

細胞をCD99に対する抗体で標識してGCを同定し、CD45に対する抗体を使用して造血細胞を除外しました(図1B、C)。PVRL1に対する抗体により、GC集団を卵性コンパートメントと壁コンパートメントに分離することができました(図1C)。コラゲナーゼ/ディスパーゼによる酵素消化後、CD55(またはENG)、CD34、およびANPEPに対する抗体で標識された細胞調製物は、TC集団から内皮細胞(CD34+)を除外して、すべての間質/TC(CD55+)および/またはアンドロゲンTC(ANPEP+)の捕捉を可能にしました(図1D、E).このパネルと段階的な酵素解離プロトコルを使用して、切除したばかりの卵巣の胞状卵胞から造血細胞、内皮細胞、顆粒膜細胞(卵性および壁状細胞)、およびテカ細胞(間質およびアンドロゲン性細胞)を標識および精製しました。

図1:ヒト胞状卵胞由来の系統特異的細胞の標識と精製。 (A)腹膜期のヒト卵胞内のGC(CD99+ PVRL+/-)およびTC(ENG+)コンパートメントを示す代表的な顕微鏡写真。白いストロークボックスは右に拡大されます。(B-E)GCをCD45-CD99+ PVRL1+/-細胞(aおよびb)、ならびにジェネリック(CD34-CD55+)およびアンドロゲン(CD34-CD55+ ANPEP+)TC(C、D)として識別する代表的なソートプロット。ゲート集団は(B、C)と(D、E)の間で共有されます。染色されていないコントロールは、(B-E)の左側に示されています。スケールバー = (A) 100 μm。略語:GC =顆粒膜細胞;TC = テカ細胞;PVRL = ネクチン;ANPEP = アラニンアミノペプチダーゼ;ヌク=核;SSC = 側方散乱;PE =フィコエリスリン;APC = アロフィコシアニン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:GC、TC、および卵巣間質を同定するために使用できる抗体のリスト。 略語:GC =顆粒膜細胞;TC =テカ細胞。

すべての著者は、競合する利益がないことを宣言します。