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方法論記事

げっ歯類の目の微小解剖

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DOI：

10.3791/64414

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2023年4月21日

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Institute of Immunology

この記事について

サマリー

この論文は、げっ歯類の眼の微小解離のためのプロトコルを提示します。このプロセスには、刺激膜(すなわち、第3のまぶた)とともに眼球の除核が含まれます。その後、後眼カップと前眼カップが分離します。

要約

げっ歯類の眼の微小解離は、前眼および後眼カップを得るために、付着した窒化膜または第3まぶたを有する除核眼球のセグメンテーションを含む。この技術により、角膜組織、神経組織、網膜色素上皮(RPE)組織、および水晶体を含む眼のサブパーツを、特定の眼組織のホールマウント、凍結切片、および/または単一細胞懸濁液のために得ることができる。第3のまぶたの存在は、局所的な介入後の眼の生理学を理解するために、または眼の空間地形に関連する眼の分析を含む研究において重要な眼の向きの維持に利益をもたらすため、独特で重要な利点を提示する。

この方法では、眼窩と第三まぶたの眼球を慎重にゆっくりと切断し、視神経を切断します。眼球は、マイクロブレードを使用して角膜辺縁部に突き刺されました。切開部を入口とし、切開点からマイクロハサミを挿入することで角膜-強膜接合部に沿って切断することができました。カップが分離するまで、円周に沿って小さく連続したカットが行われました。これらは、コリブリ縫合鉗子を使用して神経網膜の半透明層を穏やかに剥離し、神経網膜およびRPE層を得ることによってさらに解剖することができた。さらに、視神経に達するまで、周辺から視神経中心に垂直に3/4の等距離の切り込みが行われました。これにより、半球形のカップが小花の形に開き、平らになり、簡単に取り付けることができました。この技術は、私たちの研究室で角膜全体マウントと網膜切片に使用されています。3番目のまぶたの存在は、鼻側頭方向を描写し、移植後のさまざまな細胞療法介入の研究を可能にし、したがって、そのような研究での視覚化と正確な表現に不可欠なターゲットを絞った生理学的検証を可能にします。

概要

眼科解離は眼科研究における重要な技術であり、研究者は標的研究のために眼のセグメントにアクセスすることができました。以前は、眼の研究者は彼らの研究のために病気の個人の眼組織に頼っていました。しかし、眼科げっ歯類モデル1の系統が長年にわたって徐々に増加しているため、ヒトの眼組織の必要性が減少しています。これらのマウス系統は、眼疾患と介入のより深い理解を可能にしました。しかし、彼らはまた、眼の微小解剖の革新的な技術の必要性を生み出しました。サイズが小さく、操作領域が限られているため、眼のサブパーツへの効果的なアクセスが大幅に制限されます。さらに、後眼眉および前眼眉の細胞集合が均質であるため、解剖後に標的介入を行うことは困難である。レーザー2と外科的マイクロダイセクション3,4の現在のマイクロダイセクション技術は、眼科研究のそのような要件を満たすには不十分です。レーザーマイクロダイセクションはシングルセル分析に非常に効果的ですが、レーザー手順2の前に特定の組織をマイクロ解剖する必要があります。この技術は、分子分析のために事前に解剖された組織から関心のある小さな領域を分離することができます。したがって、この技術は、ホールマウントの準備や、最適な視覚化のための軸方向に詰め込まれた眼層の分離には適していません。

外科的方法は最も広く使用されている技術です。この方法は、視神経5を介して眼を固定し、次いで解剖を行うことを含む。この方法は骨の折れるものであり、解剖中に球形の目が動き続けるため、壊れやすい組織に損傷を与える可能性があります。網膜層のさまざまなセクションを分離するのに有益であるにもかかわらず、この技術は解剖時に組織の空間的配向を画定することはできません。

解剖中、付着した硝化膜または第3まぶた(図1)の存在を維持することは、ユニークで重要な利点を提示します。この方法では、まず、眼球を第3の眼瞼で除核する。そして、第3の眼瞼を用いて被検眼6を固定化する(図2A)。これに続いて、眼球を角膜辺縁に突き刺し、切開部を入口として使用します(図2B、C)。次に、円周に沿って前後に切断することにより、アイカップを分離します(図2D-G)。後眼カップをさらに解剖することにより、神経網膜の半透明層を特定し、穏やかに剥がすことができます。次に、得られた半球状の前部および後部カップに3つまたは4つの等距離の切り込みを入れ、これらの花の形のカップをスライド上に平らに落下させることができます(図2H)。

3番目のまぶたは、解剖中の簡単で効率的な取り扱いを支援し、さまざまな眼層にアクセスしたり、ホールマウントを作成したりする際に、組織への損傷を最小限に抑えます。さらに、3番目のまぶたの存在は、視覚化中の局所的な介入を見つけて調べるのに役立ちます。

私たちの研究室では、この手順は、あらゆる性別のP28のCBA / Jまたはrd1マウス系統で実行されています。この手順は、動物のあらゆる系統、年齢、または性別に対して実行でき、これらの特性に応じた偏りはありません。

動物は商業的な供給源から調達され( 材料表を参照)、国立免疫学研究所(NII)の小動物施設(SAF)で飼育されました。彼らは個々の換気ケージ(IVC)に保管され、酸性化されたオートクレーブ水と食物への 自由 アクセスを受けました。それらは21〜23°Cで、14時間/ 10時間の明暗サイクルで維持されました。

以下に、マウスの目の微小解剖のための修正された外科的方法を示します。

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プロトコル

この手順は、ニューデリーの国立免疫学研究所の施設動物倫理委員会によって承認されました。承認のシリアル参照番号はIAEC#480/18です。実験は、インド政府水産畜産酪農省の動物実験管理監督委員会の規制ガイドラインに従って、NIIのSAFの専門獣医師の監督の下で実施されました。

1. 事前準備

  1. 各眼に0.8%トロピカミドと5%フェニレフリン眼科溶液を滴下してげっ歯類の目を拡張させる。手順の前に30分間動物を暗い場所に置きます。
    注:動物は30分を完了した直後に安楽死させるため、鎮痛剤は必要ありません。動物の目を暗く順応させ、拡張することで、観察者は処置の前に眼の裂傷や損傷をチェックすることができます。さらに、色素性眼球組織を扱う際に拡張が有利である。
  2. 腹腔内に5倍の麻酔を投与することにより、動物を安楽死させる。典型的な用量は、10 mgのケタミンと1 mgのキシラジンを含む200 μLのPBSです。
    注:動物を安楽死させるための用量は、400〜500 mg / kg体重のケタミンと50 mg / kg体重のキシラジンです。体重20 gの典型的なマウスの場合、用量は、10 mgのケタミン(100 mg/mLケタミンのストック溶液100 μL)と1 mgのキシラジン(10 mg/mLキシラジンのストック溶液100 μL)を含む200 μLのPBSになります。
  3. ペダル反射を調べて、刺激に対する反応の完全な欠如を確認します。心拍と呼吸がないことも重要な指標です。
  4. マウスを横臥にして、目への完全なアクセスを可能にします。
  5. コリブリ縫合鉗子、湾曲した鉗子、マイクロブレード(15°、サイズ3 mm)、スプリングマイクロはさみ、角度付きスプリングマイクロはさみを準備します。

2.マウスの目の第三まぶたの除核

  1. マウスを横臥位にして、目への完全なアクセスを可能にします。鉗子で外側まぶたを開き、3番目のまぶたを最適に視覚化します。
    注意: 窒化膜としても知られる3番目のまぶたは、鼻接線の上隅に向かって位置しています(図1A)。
  2. 3番目のまぶたを、色素沈着した境界を持つ小さな半透明の隆起として識別します(図1B)。
  3. 眼球の周りに湾曲した鉗子を置き、つまんで無関係な付着から目を解放します。これにより、周囲の組織からの目への出血が最小限に抑えられます。
  4. 湾曲した鉗子をスプリングマイクロハサミに交換し、3番目のまぶたを取り付けて眼球の周りを切ります。小さな連続的なカットを使用して、周囲の組織の付着物から眼球を解放します。
  5. 湾曲したスプリングマイクロはさみを眼球の下に置き、視神経を切断して目を解放します。眼球が眼窩から完全に解放されていることを確認してください。

3.無関係な組織をきれいにする

  1. 安楽死させたマウスからの除核眼を、pH 7.4のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)緩衝液を含むペトリ皿に入れ、眼球がPBSに沈むようにペトリ皿を満たします。
  2. マウスの摘出眼球を片手で片手で固定する。
  3. 眼球を液体媒体に吊るして、より効率的な取り扱いを可能にします。一部の外眼の筋肉または組織は眼球から浮き始めます。スプリングマイクロハサミを使用して眼球からそれらを切り取ってそれらを削除します。
  4. マイクロハサミを使用して眼球の基部から視神経を切断して除去し、網膜をよりよく分離して、ホールマウントの準備を可能にします。
    注:組織切片作成のために視神経を切除する必要はありません。
  5. 眼球をPBSで洗浄し、1 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を含む1.5 mLチューブに4°Cで最低2時間移して組織を固定します。
    注:この手順は、組織をPFAに4°Cで最大12時間放置することにより、このステップで一時停止できます。 しかしながら、生細胞の単離のためには、固定ステップは実行されるべきではなく、そして手順全体は休止することなく実行されるべきである。

4.前眼眉と後眼窩を得るための摘出眼の解剖

  1. PFA固定後(生細胞を採取する場合は、眼球を固定せずに進めます)、眼球をPBSを含むペトリ皿に移し、解剖顕微鏡下に置いてその後の手順を実行します。
  2. Colibri縫合鉗子で3番目のまぶたをしっかりと押さえて眼球を固定します。
  3. マイクロブレードを使用して穿孔することにより、縁部を小さく切開します。辺縁は角膜 - 強膜接合部です。できれば3番目のまぶたの反対側に切開を行い、それによってスプリングマイクロハサミのアクセスポイントを作ります。
    注意: サイズが15°および3mmのマイクロブレードを使用すると、この切開の深さをより適切に制御できる場合があります。
  4. 次に、この切開を出発点として、一対のマイクロハサミを使用して、角膜強膜縁部の周囲に沿って小さく連続的な切り込みを入れます。まず、切開点から3番目のまぶたまでの半円のカットを完了します。次に、反対側の残りの半円のカットを完了します。最後に、3番目のまぶたの周りに切り込みを入れて、後部カップと前カップを分離します。
    注意: 対象のアイカップに応じて、窒化膜は前眼カップまたは後眼カップのいずれかに取り付けたままにすることができます。
  5. 鉗子を使用して後カップからレンズを取り外し、神経網膜と網膜色素上皮(RPE)層を含む後カップを取得します。したがって、レンズ、後カップ、および眼の前カップは分離されています。
    注:未固定組織で作業する場合、前カップと後部カップを酵素的に消化して、角膜または網膜の単一細胞懸濁液を得ることができます。
  6. 組織を固定するために、これらのカップを1 mLの4%PFAを含む1.5 mLチューブに4°Cで12時間移します。
    注:固定後、組織を適切な培地に埋め込むことができ、凍結切片またはパラフィン切片を行って角膜または網膜切片を得ることができます。

5.神経網膜およびRPE層の分離

  1. 後部カップをPBSバッファーを含むペトリ皿に再導入して、組織を沈めます。
  2. 神経網膜の存在を確認します。これは、カップの周縁に付着した色素性RPE層上の不透明な層として視覚化することができる。
  3. 3番目のまぶたを鉗子で保持して後カップを固定し、2番目の鉗子を使用して末梢から神経網膜を剥がします。
    注意: 組織を傷つけないように、手の非常に穏やかでわずかな動きを強くお勧めします。視神経出口では、湾曲したスプリングハサミを神経網膜の下に挿入することができ、 図3に示すように神経網膜が付着したままであれば、層を完全に解放するために切断を行うことができます。必要に応じて、柔らかいブラシを使用して穏やかなストロークで網膜を解放または取り外します。ただし、組織学のために網膜を収集する場合は、そうすることは適切ではありません。
    注:このようにして、神経網膜および第3まぶたを有する色素性RPE層が得られる。

6. ホールマウントのための網膜層とRPE層のセグメンテーション

  1. 前部および後部カップをPBSバッファーを含むペトリ皿に再導入し、解剖顕微鏡の下に置きます。
  2. 3番目のまぶたを押し下げて前カップを固定します。
  3. 角度の付いたスプリングマイクロはさみを使用して、3番目のまぶたの横にあるアイカップの直径の約3/4のカットを作成し、周辺から光学中心に向かって垂直にカットします。
  4. 3番目のまぶたを握ったまま、最初のカットの隣にカットを入れます。
  5. 2番目のカットと3番目のまぶたの間に同様のカットを入れます。
    注:このような等距離のカットが3つまたは4つあり、半球形のカップが花の形に開き、平らになり、簡単に取り付けることができます。
  6. 3番目のまぶたを押さえて後部カップを固定します。
  7. 前カップに切り込みを入れる場合と同じ手順(手順6.3〜6.5)に従って、後カップに3つまたは4つの等距離の切り込みを入れます。
    注:ステップ5で分離された神経網膜の組織像については、同様のカットを行って、表面に平らになるようにします。カップの中央を深く切り込むと、葉の部分がバラバラになったり、簡単に分離したりする可能性があるため、行わないでください。
  8. 染色を行い、効果的な可視化のために組織をホールマウントする7、8。
    注:ニトロ化膜の存在は、ホールマウントのアイカップの鼻側の一定の物理的指標として機能します。アイカップの3番目のまぶたは鼻/腹側の向きを示すため、アイカップの背側/腹側を画定するのに役立ちます。

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結果

罹患状態にある前部/角膜組織におけるリンパ血管新生の可能性を研究するために、rd1マウスの眼/角膜組織の全体集合を調製した。角膜はリンパ管を欠いているので、第3眼瞼からの付着結膜組織は陽性対照として作用した。この研究では、角膜組織を結膜で解剖し、4%PFAで固定した後、透過処理とブロッキングを行いました。次に、リンパ管内皮マーカー(LYVE1)9に対する一次抗体で組織を染色しました。その後、Alexa Fluor 488(緑色)で標識した二次抗体とのインキュベーションを行った。代表的な画像(図4)は、蛍光顕微鏡を用いて4倍および10倍で撮影した。

網膜の形態学的、構造的、機能的研究のために網膜血管系を視覚化するために、後部眼カップからの神経網膜の全体マウントが準備されました7。神経網膜を脈絡膜RPE層から慎重に剥離し、小花構造に平らになるように切り込みを入れた。網膜血管構造を可視化するために、リーフレットをイソレクチンIB4-A...

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ディスカッション

眼の微小解離は、げっ歯類の眼のサイズが小さく球形であるため困難な作業であることがわかっているが、げっ歯類の眼は効率的な取り扱いのための革新的な技術を必要とする8。

現在実証されている方法では、有効で簡単な取り扱いのために、第3のまぶたを取り付けた状態で除核したマウス眼球が得られます。3番目のまぶたを使用して、眼球を完全に固定することができ、これにより、解剖を容易に、最小限のエラーで進めることができます。さらに、第3のまぶたの存在は、眼のサブパーツの向きを描写する。したがって、眼球は、前眼瞼および後眼瞼を得るために第3のまぶたで解剖される。はさみの入り口にスリットを使用して、均一できれいなカットを可能にすることで、目の球形の性質での作業が容易になります。さらに、後眼カップをさらに解剖して、神経網膜の半透明層を穏やかに剥離することにより、組織特異的研究のための神経網膜およびRPE層を得ることができます。

さらに、このプロトコルでは、半球形のカップを小花状に開くために、視神経に到達す...

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開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

米国カリフォルニア大学デービス校の細胞生物学および人体解剖学部のアラクナンダ・ミシュラ博士は、ニューデリーの国立免疫学研究所でこの方法を訓練しました。この研究は、インド政府のバイオテクノロジー省からニューデリーの国立免疫学研究所に受け取ったコア助成金によってサポートされました。P.S.はバイオテクノロジー学科から研究フェローシップを授与されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アセトアミノフェン(ビオセタモール)EG医薬品特定のカタログ番号なし(現地調達)
アルカリホスファターゼキット(DEA)コーラルクリニカルシステム、インド特定のカタログ番号なし(現地調達)
自動分析装置チューリップ、アルトサンタクルス、インドスクリーンマースター3000肝臓機能試験用生化学分析装置
ベタジン(ポビドン-ヨウ素溶液)-メディケア; インド特定のカタログ番号なし (現地調達)
生物学的安全キャビネット (クラスI)Kartos international;インドカタログ番号なし (現地調達)
明視野顕微鏡Olympus, JapanLX51
CBA/J 近交系マウスジャクソン研究所在庫番号 000654
セフォタキシム (タキシム)AlKem ;インドフォタキシムナトリウム注射、特定のカタログ番号なし(現地調達)
セルストレーナーシグマ;米国CLS431752
コラゲナーゼ I 型Gibco by Life Technologies17100-017
Cotton BudsPure Swabs Pvt Ltd ;インド特定のカタログ番号なし(現地調達)
DPX封入剤シグマ;US6522
ドレープシートJSD Surgicals、デリー、インド特定のカタログ番号なし(現地調達)
Eosin Y 溶液、アルコールシグマ ;米国HT110132
鉗子の主要な外科手術;インド特定のカタログ番号なし (現地調達)
ガス麻酔システムUgo Basile;イタリア211000
グルコースHimedia, インドGRM077
脱毛クリーム (Veet)Reckitt Benckiser , インド特定のカタログ番号なし (現地調達)
ヘマトキシリン溶液, Mayer'sSigma ;米国MHS16
ヘパリンナトリウム塩ハイメディア;インドRM554
ヒツジ精巣シグマ由来ヒアルロニダーゼ;USH6254
I.V. カニューレ (プラスフロン)Mediplus, IndiaRef 1732411420
Insulin SyringesBD ;USREF 303060
イソフルラン ( フォラン)Asecia QueenboroughNo B506吸入麻酔
薬ケタミン (Ketamax)Troikaa Pharmaceuticals Ltd.ケタミン塩酸塩IP、特定のカタログ番号なし(現地調達)
メロキシカム(メロネックス)Intas Pharmaceuticals Ltd;インド特定のカタログ番号なし (現地調達)
マイクロニードルホルダー ストレート&カーブメルシャン; イングランドBS-13-8
マイクロニードルホルダーストレート&
カーブ		したメルシアン ; イギリスBS-13-8
ミクロトームHisto-Line Laboratories, ItalyMRS3500
Nylon ThreadMighty ;インド特定のカタログ番号なし(現地調達)
パラホルムアルデヒドHimedia;インドGRM 3660
PercollGE Healthcare17-0891-01
Refresh Tears/Eyemist GelAllergan India Private Limited/Sun Pharma, IndiaP3060特定のカタログ番号なし
RPMIHimedia;インド特定のカタログ番号なし (現地調達)
メスMajor Surgicals;インド特定のカタログ番号なし(現地調達)
はさみ主要な外科;インド特定のカタログ番号なし (現地調達)
SGOT (ASAT) KITCoral Clinical System, インド特定のカタログ番号なし (現地調達)
SGPT (ALAT) KITCoral Clinical System, India特定のカタログ番号なし (現地調達)
Shandon Cryotome E CryostatThermo Electron Corporation ;米国特定のカタログ番号なし
スクロースシグマ ;USS0389
Surgical Blade No. 22La Medcare, India特定のカタログ番号なし(現地調達)
Surgical BoardLocally Made特定のカタログ番号なし(現地調達)
Surgical White Tape3M India ;インド1530-1マイクロポア外科用テープ
縫合Ethicon、Johnson&縫合ジョンソン、インドNW 5047
シリンジ (1ml、26 g)ディスポバン;インド特定のカタログ番号なし (現地調達)
トリマー (クリッパー)フィリップスNL9206AD-4 DRACHTEN QT9005
計量機ブラウン特定のカタログ番号なし (現地調達)
ウィリアムズ E メディアハイメディア;インドAT125
キシラジン(キシラキシン)インド免疫学限定鎮静剤、麻酔前剤、鎮痛剤および筋弛緩剤
セ

参考文献

  1. Choi, Y., et al. Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice. Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
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  3. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  4. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997(2018).
  5. Claybon, A., Bishop, A. J. Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (48), e2563(2011).
  6. Steven, P., et al. Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).
  7. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. (77), e50546(2013).
  8. Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour. Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).
  9. Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye. Journal of Ophthalmology. 2012, 783163(2012).
  10. Mishra, A., et al. Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412(2020).

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