ヒト化酵母モデルを用いたα-シヌクレインの毒性と凝集の研究法

Summary

パーキンソン病の病態を研究・理解するためには、α-シヌクレインの in vivo 生理学的モデルが必要です。ヒト化酵母モデルを用いてα-シヌクレインの細胞毒性と凝集体形成をモニターする方法を記載する。

Abstract

パーキンソン病は2番目に多い神経変性疾患であり、誤って折りたたまれ凝集したα-シヌクレインを含むレビー小体の形成によって引き起こされる進行性の細胞死を特徴としています。α-シヌクレインは、シナプス小胞輸送を調節する豊富なシナプス前タンパク質ですが、そのタンパク質性封入体の蓄積は神経毒性をもたらします。最近の研究では、細菌のシャペロンを含むさまざまな遺伝的要因が、in vitroでのα-シヌクレイン凝集体の形成を減少させる可能性があることが明らかになりました。しかし、これを患者の潜在的な治療法として適用するために、細胞内の抗凝集効果を監視することも重要です。神経細胞を用いるのが理想的ですが、これらの細胞は取り扱いが難しく、抗凝集表現型を示すまでに長い時間がかかります。したがって、in vivo抗凝集活性のさらなる評価のために、迅速かつ効果的なin vivoツールが必要とされる。ここで説明した方法は、ヒトα-シヌクレインを発現するヒト化酵母サッカロミセス・セレビシエにおける抗凝集表現型をモニターおよび分析するために使用されました。このプロトコルは、α-シヌクレイン誘発性細胞毒性、および細胞内でのα-シヌクレイン凝集体の形成をモニタリングするために使用できるin vivoツールを実証します。

Introduction

パーキンソン病(PD)は、世界中の高齢化社会にとって深刻な問題です。α-シヌクレインの凝集はPDと密接に関連しており、α-シヌクレインのタンパク質凝集体は疾患を診断するための分子バイオマーカーとして広く用いられている¹。α-シヌクレインは、N末端脂質結合αヘリックス、アミロイド結合中心ドメイン(NAC)、C末端酸性テール²の3つのドメインを持つ小さな酸性タンパク質(長さ140アミノ酸)です。α-シヌクレインのミスフォールディングは自発的に起こり、最終的にはレビー小体³と呼ばれるアミロイド凝集体の形成につながります。α-シヌクレインは、いくつかの方法でPDの病因に寄与する可能性があります。一般に、プロトフィブリルと呼ばれるその異常で可溶性オリゴマー型は、シナプス機能を含むさまざまな細胞標的に影響を与えることによって神経細胞死を引き起こす有毒種であると考えられています³。

神経変性疾患の研究に使用される生物学的モデルは、そのゲノムおよび細胞生物学に関してヒトに関連している必要があります。最良のモデルはヒト神経細胞株でしょう。しかし、これらの細胞株は、培養の維持の難しさ、トランスフェクションの効率の低さ、高額な費用など、いくつかの技術的問題と関連して....

Protocol

1.培地と溶液の準備

1. メディアの準備
   1. YPD培地を調製するには、50 gのYPD粉末をdH₂Oに溶解して、最終容量1 Lの滅菌用オートクレーブを作ります。室温(RT)で保管してください。
   2. YPD寒天培地を作るには、YPD粉末50gと寒天20gを1LのdH₂O.オートクレーブに溶解して滅菌します。冷やした後、ペトリ皿に注ぎます。4°Cで保存してください。
   3. ラフィノース(SRd)-Ura培地でSCを作るには、6.7 gの酵母窒素塩基を硫酸アンモニウムで、アミノ酸を含まない795 mLのdH₂O.オートクレーブに溶解して滅菌します。使用前に100 mLの20%ラフィノース、5 mLの20%グルコース、および100 mLの10x -Uraドロップアウトを追加します。.
   4. SD-Ura寒天培地を作るには、6.7 gの酵母窒素塩基を硫酸アンモニウムでアミノ酸なしで溶解し、20 gの寒天を800 mLのdH 2 Oに溶解します。 オートクレーブを₂Lを超える容量のフラスコに入れ、100 mLの20%グルコースと100 mLの10x -Uraドロップアウトを追加します。よく混ぜてペトリ皿に注ぎます。4°Cで保存してください。
   5. ガラクトース(SG)-Ura寒天培地でSCを作るには、6.7 gの酵母窒素塩基を硫酸....

Results

α-シヌクレインの高発現は、PDのモデル系における神経細胞死およびPDに関連していることが知られている。この研究では、酵母におけるα-シヌクレインの細胞毒性と凝集α-シヌクレインの病巣形成を監視する3つの方法について説明しています。ここでは、酵母でα-シヌクレインの過剰発現を行い、野生型α-シヌクレインの表現型とPDの家族性変異体として知られるα-シヌクレインの3つの変異体を調べました(図1 および 資料表)。

pRS426ベクターの GAL1 プロモーター下でのα-シヌクレインの発現は、ガラクトースを誘導物質として含む寒天プレート上で有意な増殖遅延を示しました(図2)。α-シヌクレインの発現による増殖の違いは、液体培養でも観察されました(図3)。いずれの培養条件においても,野生型α-シヌクレインおよびE46KまたはA53T変異を有する変異体はα-シヌク.......

Discussion

ヒトにおける様々な細胞系の複雑さを考えると、ヒトの神経変性疾患を研究するためのモデルとして酵母を使用することは有利である。酵母を用いてヒトの脳の複雑な細胞間相互作用を調べることはほぼ不可能ですが、単一細胞の観点からは、酵母細胞はゲノム配列の相同性および基本的な真核細胞プロセスの点でヒト細胞と高いレベルの類似性を持っています^8,13。さらに、遺伝子操作の容易さを考えると、酵母は複雑で要求の厳しい人間のシステムの研究を容易にすることができます。したがって、酵母は真核生物の細胞プロセスとさまざまな病気の病因を理解するためのモデルシステムとして広く使用されています^14,15,16。特に、インシリコ、インビトロ、およびαシヌクレイン¹⁷を含むアミロイド形成タンパク質のインビ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96ウェルプレート	SPL	30096
アガロース	TAESHIN	0158
バクト寒天	BD Difco	214010
呼吸が容易な	多様化バイオテクノロジー	BEM-1	マイクロタイタープレート用ガス透過性シーリング膜
カバーガラス	マリエンフェルド		24 x 60 mm
培養チューブ	SPL	40014
キュベット	レシオラボ	2712120
D-(+)-ガラクトース	シグマ	G0625
D-(+)-グルコース	シグマ	G8270
D-(+)-ラフィノース五水和物	大中	6638-4105
インキュベーター(振とう)	ラブトロン		モデル:SHI1
インキュベーター(静止)	ビジョンサイエンティフィック		モデル:VS-1203PV-O
LiAc	グマ	L6883
マイクロプレートリーダーTecan		30050303 01	モデル:Infinite 200 pro
マルチチャンネルピペット20-200 µL	gilson	FA10011
マルチチャンネルピペット 2-20 & マイクロ;L	gilson	FA10009
オリンパスの顕微鏡	オリンパス	IX-53
PEG	sigma	P4338	平均分子重量 3,350
Petridish	SPL	10090
pRS426			Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. &Hieter、P.多機能酵母高コピー数シャトルベクトル。遺伝子。110(1)、119-122(1992)。
pRS426 GAL1 プロモーター &-シヌクレインA30P			Outeiro, T. F. &Lindquist, S. 酵母細胞は、α-シヌクレインの生物学と病理生物学に関する洞察を提供します。科学。302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 プロモーター &α;-シヌクレインA53T			Outeiro, T. F. &Lindquist, S. 酵母細胞は、α-シヌクレインの生物学と病理生物学に関する洞察を提供します。科学。302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 プロモーター &α;-synuclein E46K			Outeiro, T. F. &Lindquist, S. 酵母細胞は、α-シヌクレインの生物学と病理生物学に関する洞察を提供します。科学。302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 プロモーター &α;-シヌクレインWT			Outeiro, T. F. &Lindquist, S. 酵母細胞は、α-シヌクレインの生物学と病理生物学に関する洞察を提供します。科学。302 (5651), 1772-1775 (2003)
Reservoir	SPL	23050
Spectrophotometer	eppendorf	6131 05560
W303a			Present from James Bardwell
酵母窒素塩基 w/o アミノ酸	Difco	291940
シグマ	Y1501
YPD	コンダラブ	1547.00