脱細胞化気管移植片のための低線量ガンマ線滅菌

サマリー

気管組織移植には滅菌が不可欠です。ここでは、臓器に完全に耐えられる低線量ガンマ線照射を使用した滅菌プロトコルを提示します。

要約

移植が正しく進化することを確実にするための主な重要な側面の1つは、培地の無菌性です。脱細胞化気管移植では、もともと環境と接触していた臓器を移植するため、最初から無菌ではありません。脱細胞化プロトコル(洗剤博覧会[2%ドデシル硫酸ナトリウム]、連続攪拌、浸透圧ショックによる)は無菌対策に沿って実施されますが、滅菌は提供されません。したがって、主な課題の1つは、 in vivo 移植前の無菌性を確保することです。無機材料には確立されたガンマ線滅菌プロトコルがありますが、有機材料にはそのような対策はありません。さらに、確立された放射線量(25 kGy)はインプラントを完全に破壊するため、無機材料に対して実施されているプロトコルを有機材料に適用することはできません。この論文は、脱細胞化ウサギ気管における放射線量の増加の影響を研究しています。用量範囲(kGy)を維持し、滅菌が達成される最小用量が見つかるまで、漸増用量をテストしました。用量を決定した後、組織学的および生体力学的に臓器への影響を研究しました。0.5 kGyは無菌性を達成しなかったが、1 kGyと2 kGyの両方の用量は無菌性を達成し、したがって1 kGyが滅菌を達成するために必要な最小用量であると判断した。顕微鏡研究では、滅菌されていない臓器と比較して関連する変化は示されませんでした。軸方向の生体力学的特性はまったく変化せず、臓器が放射状に耐えることができる単位長さあたりの力のわずかな減少のみが観察されました。したがって、1 kGyは、臓器への影響が最小限であるとしても、脱細胞化ウサギ気管の完全な滅菌を達成すると結論付けることができます。

概要

インプラントの滅菌は、その実行可能性の基本的な必要条件です。実際、成功していることが証明されているプロテーゼは、無菌領域(血管、心臓、骨など)に埋め込まれたものです。¹.気管には、外部環境と接触する表面(したがって無菌ではない)と縦隔に向かう表面(無菌)の2つの表面があります。したがって、気管が抜去された瞬間から、それは無菌臓器ではありません。その後の脱細胞化プロセスが最大の無菌条件下で行われているにもかかわらず、それは滅菌工程²ではない。異物の移植自体は、^{それが生成する}細菌微小環境による感染のリスクを伴います3 そして、材料が滅菌されていても、ドナーからレシピエントへの病気の伝染のリスクは最大0.014%^です4。気管の正しい血管新生を確実にするために、ほとんどすべての実験的移植プロトコルにおいて、それは最初に無菌領域(筋肉、筋膜、大網、皮下など)に異所性インプラント^5,6,7を受ける。これは、この培地に非滅菌要素を移植すると、領域³の感染につながるためです。

滅菌インプラントを得るための可能な戦略の範囲があります。超臨界_CO2を用いて、^{最終滅菌8,9}を達成した。紫外線照射や過酢酸、エタノール、過酸化酸素、電解水などの物質による処理などの他の方法は、ほとんどの場合、投与量に応じて滅菌の成功率が異なりますが、インプラントの生体力学的特性に影響を与えることが示されています。実際、エチレンオキシドなどのいくつかの物質は、移植されたマトリックスの構造を実質的に変化させる可能性があり、望ましくない免疫原性効果を引き起こす可能性さえあります。このため、これらの戦略の多くは、生物学的モデル²、¹⁰、¹¹、^12、13には適用できない。

最も広く研究され受け入れられている滅菌戦略は、ガンマ線量25 kGyのヒトに埋め込まれた医療機器の滅菌に関するISO 11737-1:2006規格によって確立されたものです。しかしながら、この規制は、不活性な非生物学的要素の滅菌にのみ焦点を当てている^14,15。さらに、癌腫の根治的治療における放射線療法の線量は、医療機器の滅菌に使用される線量よりも3桁低くなっています¹。これを念頭に置いて、上記の用量は微生物叢を殺すだけでなく、インプラントの生物学的構造を破壊し、根本的に変えると結論付けることができます。また、分解時に残留脂質を生成する可能性があり、これは細胞毒性があり、1.9 kGyという低い線量を使用し、受けた放射線量に正比例する損傷を伴う場合でも、足場13,14,15,16,17の酵素分解を加速する可能性があります¹⁷。

したがって、この論文の目的は、照射によって引き起こされる有害な影響を最小限に抑えて滅菌インプラントを得ることを可能にする放射線量を特定しようとすることです2,18,19。私たちが従った戦略は、負の培養を達成するまで、キログレイの範囲(0.5、1、2、3 kGyなど)内の異なるエスカレート線量で脱細胞化および照射された気管の照射を含みました。滅菌を確認するために、陰性培養を達成した用量について追加の試験を行った。滅菌を得るための最小線量を決定した後、気管に対する照射の構造的および生体力学的影響をチェックした。すべての測定基準を対照のネイティブウサギ気管と比較した。次に、構築物の滅菌を、気管をニュージーランドの白ウサギに移植することによってin vivoでテストしました。

プロトコル

実験動物の世話と使用に関する欧州指令20170/63 / EUが遵守され、研究プロトコルはバレンシア大学の倫理委員会によって承認されました(スペインのバレンシア政府の法律86/609 / EECおよび214/1997およびコード2018 / VSC / PEA / 0122タイプ2)。

1.気管脱細胞化

注:脱細胞化法は他の場所で報告されている²⁰。

1. 辺縁耳静脈からの200 mg / mL注射を使用して、体重3.5〜4.1 kg、133 mg / kgのペントバルビタールナトリウムでドナーのオスの成体ニュージーランド白ウサギ(Oryctolagus cuniculus)を安楽死させます。
2. 無菌状態を確保しながら、中央縦頸部切開を行い、頸部筋を解剖し、気管にアプローチします。臓器を円周方向および縦方向に解剖します。最後に、最初のリングの下とカリーナのすぐ上を通過します。
3. メスで、気管を2 cmの小片に分割します。ハサミで周囲の結合組織と粘膜内層⁶を取り除く。
4. 2%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、5%ペニシリン-ストレプトマイシン、および5%アムホテリシンBを含む12mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液に検体を沈めます。
5. 気管をマグネチックスターラーで400rpmで室温で5週間絶えず攪拌します。気管を蒸留水に浸すことによって、2時間の浸透圧ショックの後、毎週脱細胞化溶液を交換してください。
6. -80°Cの凍結容器で、80%ウシ胎児血清(FBS)と20%ジメチルスルホキシド(DMSO)の12 mL混合物を使用して検体を凍結します。
7. 気管を使用する場合(13〜15日後)、37°Cの水浴で解凍し、解凍が完了したらPBSに浸して洗浄します。

2.滅菌

1. 照射
   1. PBSで満たされたT25培養フラスコに、それぞれ2cmの4つの気管片のバッチを、総容量30mLに達するまでPBSで満たされた20 mLのメタクリレートに入れます。気液界面でのエネルギー拡散を引き起こす可能性のある気泡の形成を防ぐように注意してください。
   2. 線形加速器を使用して、公称エネルギー10 MVの光子を平坦化フィルターフリービームで照射します。等心に毎分2,400モニター単位の線量率を適用し、照射する光源表面距離100cm、放射線場10cm×10cmの被写界深度2.5cmで気管を配置し、容器全体を覆うようにし、24Gy/minの線量に対応する。
   3. 各4ピースバッチで用量をエスカレートします。滅菌に達するまで、4個は0.5 kGy、4〜1 kGy、4〜2 kGなどにさらされます。
2. 文化
   1. 抗生物質や抗真菌剤を含まない不活化10%FBSを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)30 mLに小片を導入します。
   2. 標準的な組織インキュベーターで37°C、5%_CO2で2週間培養し、24時間ごとに検査します。
      注:汚染パラメータは、培地のpHの変化であり、したがって、培地の色と濁度の変化です。気管は無菌のウサギ目から採取されたが、これは病気ではなく、気管内に嫌気性細菌がないと予想される。

3.組織学的分析

注:ヘマトキシリンとエオジン²¹、マッソンのトリクローム、およびオルセイン²²を使用してピースを染色します。

1. ダピ染色
   1. DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)を使用して組織の生存率を決定します。この青色蛍光染色は、DNA配列のアデニンおよびチミンに富む領域に強く結合するため、蛍光顕微鏡 で DNAを見ることができます。
   2. 組織サンプルを最適な切断温度(OCT)コンパウンドに埋め込みます。
   3. クライオスタットを使用してサンプルを切断します。
   4. 染色するサンプルを蒸留水で3回洗浄してOCTを除去し、DAPIの30 nM溶液を含む封入剤に入れます。
   5. 蛍光顕微鏡を使用して蛍光を可視化します。
2. DNA含量解析
   1. メスを使用して長さ約3 mmの気管のセグメントを切り取ります。
   2. プロテイナーゼK(材料表)中で2時間インキュベートします。
   3. 製造元の指示に従って、DNA抽出キットでDNAを抽出します。
   4. 分光光度法により、分光光度計を使用して260/280の吸光度を測定することにより、DNAの濃度を決定します。
   5. 抽出したDNAサンプルのサイズを、バイオアナライザー付きキャピラリークロマトグラフィーを用いて測定します。

4.生体力学的研究

注意: 縦方向および横方向の力に対する気管の抵抗は、軸方向の引張および半径方向の圧縮試験²³によって測定されます。

1. 気管測定
   1. 気管の長さ、肉厚、外径をノギスで測定します。
   2. 各変数の3つのランダム測定値から平均値を計算します。
   3. ラジアル圧縮試験では、プレートが試験片と接触する点を検出して前後直径を計算します。
   4. すべてのテストを室温で実行します。
2. 引張試験
   1. 100 Nの荷重(0.1 Nの力分解能、0.001 mmの位置、0.1 s)を備えたトラクションデスクトップ万能試験機(UTM)変位制御で引張試験を実施します。試験機には力センサと位置センサが装備されており、メーカ²³によって特別に設計されたソフトウェアを備えたコンピュータに接続されている。
   2. 0.4秒ごとにデータを記録し、スプレッドシートにエクスポートします。
   3. 外径1 cm、壁厚1.5 mmの純粋な単層無毒結晶ポリ塩化ビニル(PVC)中空チューブから、ウサギ気管の平均口径に適合した引張ジョーを構築します。
   4. 伝導を3 cmの長さのセグメントに分割します。
   5. 縫合糸による偏りを防ぐために、顎の端から2 mm、2.5 mmの距離だけ離された、末端縫合糸用の12個の事前に形成された穴を開けます。
   6. 気管の端から2 mm離れた交互の事前に形成された穴(5 mmごと)を通して連続縫合糸を使用し、6-0ナイロンモノフィラメント縫合糸を使用して、末端吻合によってPVCガラス管をウサギの気管に取り付けます。
   7. 5.0 mm/minの変位速度ですべてのピースを引き伸ばします。
   8. 最大応力(最大σ、N / mm²)およびひずみ(_ε最大、単位なし)を、気管容積の単位あたりに蓄えられたエネルギー(W / Vol、mJ / mm)、およびヤング率(E、MPa)とともに記録します。
3. ラジアル圧縮試験
   1. 15 Nロードセル(力分解能0.001 N、位置0.001 mm、時間0.1秒)を備えた圧縮デスクトップUTMでラジアル圧縮試験を行い、力データ(N)、位置(mm)、および時間を取得します。データを記録し、0.5秒間隔でスプレッドシートにエクスポートします。
   2. 膜領域を下のプレートに置いて気管を置きます。プレートは5mm/minの一定速度で天板に向かって徐々に上昇します。
   3. 気管を完全に閉塞させるために必要なサンプルの単位長さ(N / mmのf )、剛性(Mpa・mmのR)、および表面積の単位あたりのエネルギー(m J / mm²のW / S)のすべての単位を計算します。

5.手術手技

注:外科的手法は他の場所で広く報告されています²⁰。

1. サイズ14 Fr(壁を圧縮せずに自由にスライドできる)の滅菌管腔内PVCステントを、両端に3〜4 mmのマージンを置いて配置します。
2. 最初の軟骨の軟骨間空間を通して単一の6-0ナイロンモノフィラメントステッチでステントを固定します。
3. ウサギの麻酔に進みます。
   1. 鎮静剤、筋弛緩剤、鎮痛剤(2.5 mg / kgキシラジン)を含む筋肉内鎮痛薬(35 mg / kgケタミン)で被験者(3.65-4.05 kgのオスのニュージーランド白ウサギ)を事前に投与します。.
   2. 手術領域から切開領域を剃り、手術領域をきれいにして脱毛します。
   3. 鎮痛薬と抗生物質予防を投与します:0.05 mg / kg筋肉内ブプレノルフィンおよび10 mg / kgエンロフロキサシン。.
   4. 各ウサギの辺縁耳静脈に静脈カテーテルを入れます。
   5. プロポフォールの静脈内10 mg / kgボーラスによる誘導麻酔。
   6. 3誘導心電図、パルスオキシメトリ、および非侵襲的圧力測定を使用して、動物のバイタルサインを監視します。30分ごとに生理的血清を目に塗り、麻酔下での乾燥を防ぎます。
   7. つま先ピンチ法を使用して麻酔面を確認します。
   8. 自発換気を失うことなく、吸入イソフルランによる麻酔を最小肺胞濃度の1.5%〜2%に維持し、加熱パッドでウサギに熱サポートを提供します。
4. ヨウ素ベースのスクラブで円を描くように切開ゾーンを数回消毒します。常に無菌条件下で、無菌材料を使用して、縦方向に3 cmの中央胸部切開を行い、胸筋膜と筋肉成分で構成される両側の有茎フラップを収穫します。
5. 気管をフラップで包み、各半胸部に1匹ずつ、4匹のウサギを巻きます(したがって、合計8匹の気管)。
6. 手術が完了したら、イソフルラン投与を中断して麻酔を逆にします。
7. 術後期間
   1. 麻酔から完全に回復するまで、動物を手術室に保管してください。彼らが完全に回復したら、他のウサギと一緒に彼らの環境に戻します。
   2. ウサギを抗生物質(0.5 mL / kgの2.5%エンロフロキサシン)と鎮痛薬(5 mg / mLメロキシカム、0.05 mL / kgメタカム)で24時間ごとに5日間治療します。.
   3. インプラントを希望の時間 その場に置いて おきます。
   4. 安楽死の前に、筋肉内鎮痛薬(35 mg / kgケタミン)と鎮静剤、筋弛緩薬、鎮痛薬(2.5 mg / kgキシラジン)をウサギに事前に投与します。.次に、辺縁耳静脈から200 mg / mLの注射を使用して、133 mg / kgのペントバルビタールナトリウムでウサギを安楽死させ、気管を採取します。.
   5. 気管の生体力学的および組織学的検査を行います。

6. 統計解析

1. R ソフトウェア、バージョン 3.5.3 R Core (R Foundation for Statistical Computing. 2019) でベイズ法ですべてのモデルを調整します。
2. 多重線形回帰モデルを使用して、 f と R を除くスタディ変数を分析します。
3. f 変数と R 変数には、混合線形回帰モデルを適用します。これらのモデルでは、各気管の治療と状態に関連する関心のある変数に加えて、単調効果として閉塞の割合を導入し、変量因子として気管あたりの独立項を導入します。

結果

脱細胞化
DAPI染色はDNAの不在を示し、電気泳動によっていずれの気管においても50ngを超えるDNA値は検出されず、すべての断片が200bp^{未満であった20}。

微生物培養
0.5 kGyに供した8個のうち2個は1週間以内に色変化を示した。1 kGyと2 kGyで照射された破片はいずれも色の変化を示さなかった(図1)。

組織学的解析
コラーゲンまたは弾性線維の分布パターンの変化は、分析されたどの標本でも検出されませんでした(図2)。

放射線量の決定
以上の結果から、0.5 kGyでの照射では検体の滅菌が保証されないのに対し、1 kGyと2 kGyの...

ディスカッション

存在するいくつかの滅菌戦略があります。超臨界_CO2は組織に完全に浸透し、培地を酸性化し、インプラント^の減圧による単純な除去で細胞リン脂質二重層を分解する8、^14、25。紫外線も使用されており、げっ歯類の気管におけるその有効性は発表されているが、文献¹⁰には少数の報告しかない。使用される他の方法には、過酢酸、エタノール、過酸化酸素、または電解水などの物質の適用が含まれ、これらは不規則な結果をもたらし、組織に大きな影響を与えることが示されています^11,12。前述の戦略とは対照的に、ガンマ線照射は滅菌の面で完全に効果的であることが示されているだけでなく、その線量と滅菌効果の両方に関して徹底的かつ豊富に研究されています。実際、滅菌におけるガンマ線の使用に関するISO規格があり...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
6-0ナイロンモノフィラメント縫合糸	モノソフト。コヴィディエン;マンスフィールド、マサチューセッツ州、米国	SN-5698G
アンホテリシン B 5%	Gibco Thermo Fisher Scientific;米国マサチューセッツ州ウォルサム	15290018
バイオアナライザー	Agilent, Santa Clara, CA, USA	G2939BA
Buprenorphine	Buprex.レキットベンキーザーヘルスケア;Hull, Reino Unido	N02AE01
Compression desktop UTM	Microtest, Madrid, Spain	EM1/10/FR
Cryostate	Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania	CM3059
ジメチルスルホキシド (DMSO)	Sigma-Aldrich;ミズーリ州、米国	D2650
DMEM	サーモフィッシャーサイエンティフィック;米国マサチューセッツ州ウォルサム	11965084
DNA抽出キット	DNeasy抽出キット Quiagen, Hilden, Germany	4368814
Enrofloxacin, 2.5%	Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany	0035-0002
ウシ胎児血清 (FBS)	GE Healthcare Hyclone;スペイン・マドリード	SH20898.03IR
蛍光顕微鏡	Leyca DM2500 (ドイツ・ライカ)	DM2500??
冷凍コンテナ	フロスティさん。サーモフィッシャー;スペイン、マドリード	5100-0001
イソフルオラン	イソフロ;プロイマ・ガナデラ;シウダー・レアル(スペイン)	8.43603E + 12
ケタミン	イマルゲン。メリアル;トゥールーズ、フランシアBOE127823
線形加速器	「トゥルービーム」。米国カリフォルニア州パロアルト、バリアン	H191001
マグネチックスターラー	オービタルシェーカー PSU-10i.バイオサン;リガ、レトニア	BS-010144-AAN
メロキシカム 5 mg/ml	ベーリンガーインゲルハイム、インゲルハイム アム ライン、ドイツ	6283-MV
ペニシリン-ストレプトマイシン 5%	Gibco サーモフィッシャーサイエンティフィック;ウォルサム、マサチューセッツ	米国 15140122
ペントバルビタールナトリウム	ドレタール。ベトキノール;マドリード、エスパña	3.60587E+12
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	Sigma-Aldrich;ミズーリ州、米国	P2272
Propofol	Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG;メルスンゲン、アレマニア	G 151030
プロテイナーゼK	Gibco サーモフィッシャーサイエンティフィック;米国マサチューセッツ州ウォルサム	S3020
PVC中空管	Cristallo Extra;FITT、サンドリーゴ、イタリア	hhdddyyZ
PVCステント	アーガイルTMメドトロニック;イスタンブール、トルコ	019 5305 1
R ソフトウェア、バージョン 3.5.3 R コア	R 統計計算財団	R 3.5.3
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)	Sigma-Aldrich;ミズーリ州、米国	8,17,034
分光光度計	Nanodrop, Life Technologies;アイソジェンライフサイエンス。ユトレック、オランダ	ND-ONEC-W
スプレッドシート	Microsoft Excel for Mac、バージョン 16.23、ワシントン州レドモンド、米国	2864993241
Traction Universal Testing Machine	Testing Machines, Veenendaal, Netherlands	84-01
UTM Software	TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA	100-093-627 F
ベクタシールド 取付用ミディアム	ベクターラボ、バーリンゲーム;カリフォルニア州;アメリカ	H-1000-10
キシラシン	キシラジシック。カリエ;バルセロナ、エスパñ	20102-003