トマトの種子発育の研究のための効率的な清算プロトコル(Solanum lycopersicum L.)

Summary

トマトの種子は、植物の繁殖中の遺伝学と発生生物学を研究するための重要なモデルです。このプロトコルは、さまざまな発生段階でトマトの種子をきれいにして、より細かい胚構造を観察するのに役立ちます。

Abstract

トマト(Solanum lycopersicum L.)は、世界中の主要な換金作物の1つです。トマトの種子は、植物の繁殖中の遺伝学と発生生物学を研究するための重要なモデルです。トマト種子内のより微細な胚構造の可視化は、種皮粘液、多細胞層外皮、および厚肉胚乳によって妨げられることが多く、これは面倒な埋め込み切片によって解決する必要があります。より簡単な代替案は、化学薬品を使用して種子をほぼ透明にする組織透明化技術を採用することです。従来のクリアリング手順では、より薄い種皮で小さな種子を深く洞察することができますが、トマトの種子のクリアは、特に発育後期段階では、技術的に引き続き困難です。

ここに提示されているのは、胚の形態がほぼ完了する開花後3日から23日までのトマト種子の発達を観察するための迅速で省力化のクリアリングプロトコルです。この方法は、 シロイヌナ ズナで広く用いられている抱水クロラール系清澄液に、ホルマリン-アセト-アルコール(FAA)固定の省略、種子の次亜塩素酸ナトリウム処理の添加、軟化した種皮粘液の除去、洗浄・減圧処理などの改良を加えたものです。この方法は、さまざまな発生段階でトマト種子を効率的に除去するために適用でき、良好な空間分解能で変異種子の発生過程を完全に監視するのに役立ちます。このクリアリングプロトコルは、ナス科の他の商業的に重要な種のディープイメージングにも適用できます。

Introduction

トマト(S. lycopersicum L.)は、世界で最も重要な野菜作物の1つであり、2020年には510万ヘクタールから1億8,680万トンの肉質の果物が生産されています¹。ナス、ピーマン、ジャガイモ、タバコなどの多くの商業的に重要な作物を含む、約2,716種²の大きなナス科に属しています。栽培トマトは二倍体種(2n = 2x = 24)で、ゲノムサイズは約900 Mb³です。長い間、野生のナス属から望ましい形質を選択することにより、トマトの家畜化と育種に多大な努力が払われてきました。トマト遺伝学リソースセンターには5,000を超えるトマトのアクセッションがリストされており、世界中で80,000を超えるトマトの生殖質が保管されています⁴。トマト植物は温室内で多年生であり、種子によって繁殖します。成熟したトマト種子は、完全に成長した胚、残留細胞型胚乳、および硬い種皮の3つの主要な区画で構成されています^5,6(図1A)。二重受精後、細胞型胚乳の発生は接合子の発生に先行する。開花後~5~6日(DAF)に、胚乳が6〜8個の核

Protocol

1.溶液の調製

1. 50 mLの遠沈管に2.5 mLの37%ホルムアルデヒド、2.5 mLの氷酢酸、および45 mLの70%エタノールを加えて、FAA固定液を調製します。ボルテックスし、4°Cで保存します。 使用直前にFAA固定液を新たに調製してください。
   注意: 37%ホルムアルデヒドは腐食性であり、暴露または吸入すると発がん性がある可能性があります。固定剤は、適切な個人用保護具を着用しながら、ヒュームフード内で実行する必要があります。
2. スズ箔で包んだ100 mLのガラス瓶に5 mLの100%グリセロール、40 gの抱水抱き水、および10 mLの蒸留水を加えて、透明溶液を調製します。マグネチックスターラーを用いて室温で一晩溶解する。調製した溶液は、4°Cで最大6ヶ月間保存できます。
   注意: 抱水クロラールは発がん性があり、刺激臭があります。ドラフトで実験を行い、適切な個人用保護具を着用してください。抱水クロラールは空気中で潮解しやすく、大量に保管しないでください。透明溶液は光にさらされると分解する可能性があるため、光から遠ざける必要があります。
3. 50 mLの遠沈管に10 mLの6%次亜塩素酸ナトリウム、40 mLの蒸留水、および50 μLのTween-20を加えて消毒液を調製します。渦巻き、室温で保管します。使用直前に消毒液を新たに調製してください。
   注:長期間配置された次亜塩素酸ナトリウムの有効塩素含有量は減少し、実際の....

Results

シロイヌナズナのように従来の方法でトマトの種子を駆除すると、密な胚乳細胞が3DAFと6DAFで初期トマト胚の可視化を妨げました(図3A、B)。胚の総体積が増加するにつれて、球状胚は9DAFでほとんど区別できませんでした(図3C)。しかし、種子のサイズが大きくなり続けるにつれて、その透過性は減少し、12 DAFでぼやけた心臓胚が生じました(図3D)。13 DAF以降、種子粘液と種皮は徐々に密度が高くなり、透明化剤の浸透が妨げられました。14-19 DAF種子内の胚の輪郭は、処理時間を7日間に延長しても非常にぼやけていました(図3E-G)。22個のDAFシードでは、シードの内部構造は完全に見えませんでした(図3H)。

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Discussion

機械的切片化と比較して、透明化技術は、植物組織または器官の完全性を保持するので、三次元イメージングにとってより有利である¹⁶。従来の清澄処理プロトコルは、化学溶液の浸透が容易であるため、小さなサンプルに限定されることがよくあります。トマト種子は、シロイヌナズナの種子の約70倍の大きさで、透過性障壁が高いため、組織透明化に問題のあるサンプルです。シロイヌナズナの種皮は、外皮と内外皮²⁴に由来する4〜5個の生細胞層で構成されています。しかし、シロイヌナズナと比較して、トマト^種皮6には22〜27個の実質細胞層(球状胚の段階)があります。トマト種皮の最内層はスベリンで構成されており、半透層として知られており、水溶性化合物の移動に対する障壁であることが示されている³⁸。さらに、多糖類に富む種子粘液は、高い粘度および著しく低い透過性を示し、それが透明化溶液の浸透を妨げた。トマトの色素が豊富な種皮も画質を低下.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,000 & マイクロ;Lピペット	GILSON	FA10006M
1,000 µLピペットチップ	コーニング	T-1000-B
2 ml遠心分離管	Axygen	MCT-200-C
37%ホルムアルデヒド	DAMAO	685-2013
5,000 & マイクロ;Lピペット	Eppendorf	3120000275
5,000 µLピペットチップ	バイオシャープ	BS-5000-TL
50ml遠心分離管	コーニング	430829
無水エタノール	BOYUAN	678-2002
ボトルガラス	フィ	ッシャーFB800-100
クロラール水和物	メ	イヤーM13315-100G
カバースリップ	ライカ	384200
DIC顕微鏡	ツァイス	アクシオ イメージャー A1	10x、20x、40x 倍率
消毒剤	QIKELONGAN	17-9185
解剖針	Bioroyee	17-9140
花 栄養土壌	FANGJIE
鉗子	HAIOU	4-94
氷酢酸	BOYUAN	676-2007
グリセロール	Solarbio	G8190
マグネチックスターラー	IKA	RET basic
Micro-Tom	Tomato Genetics Resource Center	LA3911
オービタルシェーカー	QILINBEIER	QB-206
播種基質	PINDSTRUP	LV713/018-LV252	スクリーニング:0-10 mm
シングルコンケーブスライド	HUABODEYI
スライド	ライカ	3800381
実体顕微鏡	ライカ	S8 APO	1倍から4倍の倍率
錫箔	ZAOWUFANG	613
Tween 20	Sigma	P1379
真空ポンプ	SHIDING	SHB-III
渦計	Silogex	MX-S