ウサギの開放内側大腿骨顆衝撃モデルは、心的外傷後変形性関節症(PTOA)およびPTOAの進行を緩和するための新しい治療戦略を研究するために信頼できます。このプロトコルは、インパクターヘッドを備えたキャリッジベースのドロップタワーを使用して、ウサギの後部内側大腿骨顆の孤立した軟骨欠損を生成します。
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方法論記事
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ウサギの開放内側大腿骨顆衝撃モデルは、心的外傷後変形性関節症(PTOA)およびPTOAの進行を緩和するための新しい治療戦略を研究するために信頼できます。このプロトコルは、インパクターヘッドを備えたキャリッジベースのドロップタワーを使用して、ウサギの後部内側大腿骨顆の孤立した軟骨欠損を生成します。
心的外傷後変形性関節症(PTOA)は、米国における変形性関節症の全症例の12%を占めています。PTOAは、関節軟骨に作用する強い衝撃荷重などの単一の外傷性イベント、または前十字靭帯断裂で発生する関節の不安定性によって開始される可能性があります。現在、PTOAを予防する効果的な治療法はありません。軟骨損傷が進行するメカニズムをよりよく理解し、PTOAの進行を緩和または予防するための新しい治療戦略を調査するには、PTOAの信頼性の高い動物モデルを開発する必要があります。このプロトコルでは、軟骨の損傷を誘発するオープンドロップタワーベースのウサギ大腿骨顆衝撃モデルについて説明します。このモデルは、579.1 ± 71.1 N のピーク負荷と 81.9 ± 10.1 MPa のピーク応力、2.4 ± 0.5 ミリ秒のピーク負荷を実現しました。埋伏した内側大腿骨顆(MFC)の関節軟骨は、アポトーシス細胞の割合が高く(p = 0.0058)、非埋伏した反対側MFC(0.56±0.42)および埋伏した膝の他の軟骨表面(p < 0.0001)と比較して、3.38±1.43の変形性関節症研究協会(OARSI)スコアが高かった。非衝撃関節面ではOARSIスコアに差は検出されなかった(p > 0.05)。
心的外傷後変形性関節症(PTOA)は、世界中の障害の主な原因であり、症候性変形性関節症(OA)の12%〜16%を占めています1。末期OA管理の現在のゴールドスタンダードは、末期の脛距骨または距骨下関節炎の場合と同様に、膝関節および股関節全置換術2または関節固定術です。関節形成術はおおむね成功していますが、費用がかかり、病的な合併症を引き起こす可能性があります3。さらに、関節形成術は、77%〜83%の低修正無修正インプラント生存率を考えると、50歳未満の患者ではあまり望ましくありません4,5。現在、PTOAの進行を予防または軽減するためのFDA承認の治療法はありません。
PTOAは、滑膜組織、軟骨下骨、関節軟骨を含む関節全体に影響を及ぼします。関節軟骨の変性、滑膜の炎症、軟骨下骨のリモデリング、骨棘の形成を特徴としています6,7。PTOAの表現型は、軟骨、滑膜、および軟骨下骨の間の相互作用の複雑なプロセスを介して発生します。現在の理解では、軟骨損傷は2型コラーゲン(COL2)やアグリカン(ACAN)などの細胞外マトリックス(ECM)成分の遊離につながるとされています。これらのECM成分フラグメントは炎症誘発性であり、IL-6、IL-1β、および活性酸素種の産生を増加させます。これらのメディエーターは軟骨細胞に作用し、MMP-13などのマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)のアップレギュレーションを引き起こし、関節軟骨を分解すると同時にマトリックス合成を減少させ、関節軟骨の全体的な異化環境を引き起こします8。さらに、原発性変形性関節症およびPTOAにおける軟骨細胞アポトーシスの増加の証拠があります9,10。ミトコンドリアの機能不全は、軟骨の超生理学的負荷後に発生し11,12,13,14、軟骨細胞のアポトーシスの増加につながる可能性があります12,15。軟骨細胞のアポトーシスの亢進は、プロテオグリカンの枯渇と軟骨異化の増加と関連しており、軟骨と軟骨下骨のリモデリングの変化に先行することが示されています16,17,18。
ほとんどのヒト疾患と同様に、疾患の病態生理学をさらに理解し、新しい治療法をテストするには、PTOAの信頼性の高いトランスレーショナルモデルが必要です。豚や犬などの大型動物は、PTOA17,19の関節内骨折および衝撃モデルで使用されてきましたが、コストがかかります。マウス、ラット、ウサギなどの小動物モデルは安価であり、関節の不安定化によって生成されるPTOAを研究するために使用されます、これは通常、前十字靭帯(ACL)の外科的離断および/または内側半月板の破壊を伴う20、21、22、23、24、25。関節の外傷は、靭帯損傷26を含むさまざまな結果につながる可能性がありますが、軟骨の機械的過負荷はほとんどすべてのケースで発生します。
靭帯不安定性(ACL離断など)および急性軟骨損傷後のPTOAの発症の背後にある病理学は、異なるメカニズムによるものであるという新たな証拠があります27。したがって、軟骨への直接的な損傷のモデルを開発することが重要です。現在、ラットおよびマウスに骨軟骨または軟骨損傷を引き起こす衝撃モデルの数は限られています28,29。しかし、マウス軟骨は孤立した軟骨欠損の生成にはあまり適していません。これは、マウスの関節軟骨の厚さがわずか3〜5細胞層であり、組織化された表在軟骨、放射状軟骨、および移行軟骨ゾーン、およびヒトおよび大型動物に見られる厚い石灰化軟骨層を欠いているためです。マウスモデルでは、軟骨部分欠損の自発的な解消も示される30,31。したがって、軟骨の厚さと組織がヒトに似ており、PTOAをもたらす一貫した軟骨衝撃を送達できる最小の動物モデルであるため、この衝撃モデルにウサギを選択しました。ウサギにおける大腿骨顆衝撃の以前の開腹手術モデルは、振り子32、手持ち型のバネ仕掛け軟骨埋伏装置33、およびウサギ特異的なインパクター作成を可能にするドロップタワー34を採用してきた。しかし、これらの研究にはin vivoデータが不足していた。また、振り子ベースの衝撃装置35、空気圧式36、およびバネ仕掛けの衝撃装置37を使用したin vivoデータ10を報告する研究もあり、これらの研究は、方法間のピーク応力と負荷率の変動率が高いことを示しています。しかし、この分野では、in vivoで急性軟骨外傷を確実にモデル化するための一貫したアプローチが欠けています。
現在のプロトコルは、ウサギの膝の後内側顆に一貫した衝撃を与えるために、ドロップタワーベースのシステムを採用しています。膝への後方アプローチは、後内側大腿骨顆を露出させるために採用されます。次に、スタインマンピンを大腿骨顆を横切って内側から外側に関節面に沿って配置し、プラットフォームに固定します。固定されると、荷重は後内側大腿骨顆に送られます。この方法により、ウサギの大腿骨遠位部の体重を支える面に一貫した軟骨損傷を与えることができます。
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以下の手順は、インディアナ大学医学部の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)の承認を得て実施されました。すべての生存手術は、NIHガイドラインで概説されているように、無菌条件下で実施されました。疼痛と感染のリスクは、適切な鎮痛薬と抗生物質で管理され、成功した結果を最適化しました。骨格的に成熟したオスのニュージーランド白ウサギ(体重3.0〜4.0 kg)を本研究に使用しました。
1. 落錘塔製作
2.動物の調製
3.外科的曝露
注:手術と衝撃の前に、軟骨下骨折を伴わずに目に見える軟骨損傷をもたらす体重と落下高さは、ウサギの特定の緊張、年齢、および性別について経験的に決定する必要があります。
4.大腿骨顆の影響



5.手術部位の閉鎖
6.術後の管理
7.組織学的評価
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この手術の成功は、衝撃直後に外科医による顆の視覚化(図4A)とX線撮影によって監視され、骨折が発生していないことを確認しました(図4B)。顆の術中骨折につながる衝撃障害のリスクがあります。これは通常、Steinmanピンの配置が不適切であることが原因です(図5)。このモデルを用いた術中骨折に続発する骨折失敗率は9.0%(手術67件中6件)であった。平均ピーク衝撃応力は81.9±10.1MPa(CV=12.3%)、平均負荷率は36.6±11.0MPa/ms(CV=30.1%)であった。他のパラメータも一貫しており、CVは5%〜23.5%の範囲でした(表1)。
n = 8匹のウサギの膝関節のサフラニンO-fast緑色染色組織学的切片を、国際変形性関節症研究協会(OARSI)スコアリングシステム43を使用して軟骨...
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この外科的処置は、PTOAのモデルでウサギの内側大腿骨顆の体重を支える表面に一貫した軟骨損傷を引き起こすことを目的としています。この手順の利点は、膝への後方アプローチにより、完全な後内側大腿骨顆を直接視覚化でき、約37分で実行できることです(表2)。また、これは開放的な傷害モデルであり、滑膜および関節包への潜在的な損傷による衝撃だけでなく、急性炎症性変化をもたらす可能性があることにも注意すべきである17,44。このモデルの長所と短所を表 3 にまとめます。関節の安定性を確保するために、靭帯および半月板構造を損傷しないように注意が払われました。その結果、衝撃ゾーン外の関節区画(内側および外側脛骨プラトーおよび外側大腿骨顆)の対側対照肢と衝撃肢の間に差は検出されませんでした。
このプロトコルの最も重要な面は、大腿骨顆における孤立した軟骨病変の発生です。スタインマンピンの軌跡は、この方法の成功に大きく影響...
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Roman Natoliは、AO Trauma North Americaで講演を行い、 Current Osteoporosis Reportsのセクションエディターであり、MorganとClaypoolから教科書の印税を受け取っています。トッド・マッキンリーはイノムドからロイヤリティを受け取る。残りの著者は何も開示していません。
この研究は、米国陸軍医学研究取得活動の国防総省査読付き医学研究プログラム-医師主導研究賞W81XWH-20-1-0304、NIH NIAMS R01AR076477、およびNIH(AR065971)およびNIH NIAMS助成金R01 AR069657による包括的な筋骨格系T32トレーニングプログラムによって支援されました。著者らは、このプロジェクトに機械加工と製造の専門知識を提供してくれたKevin Carr氏と、組織学を支援してくれたDrew Brown氏とIndiana Center for Musculoskeletal Health Bone Histology Coreに感謝します。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 皿ネジ | McMaster-Carr | 92210A194 | ステンレス製六角ドライブ皿ネジ、8-32、1/2" |
| #15 メスブレード | McKesson | 1029066 | Scalpel McKesson No. 15 ステンレススチール/プラスチック クラシック グリップ ハンドル 滅菌済み 使い捨て |
| 1/2"-20 ネジ付きロッド | McMaster-Carr | 99065A120 | 1/2"-20 ネジ付きロッド |
| 10 mL シリンジ | マッケソン | 1031801 | 灌漑用。汎用シリンジ マッケッソン 10 mL ブリスターパック ルアーロックチップ 安全なし |
| 3 mL シリンジ | マッケソン | 1031804 | リドカイン/ブピビアカイン注射用;汎用シリンジ McKesson 3 mL ブリスターパック ルアーロックチップ 安全性なし。 |
| 3-0 polysorb | Ethicon | J332H | 3-0 Vircryl, CT-2, 1/2 円, 26 mm, テーパー |
| 4-0 モノソルブ | Ethicon | Z397H | 4-0 PDS 2, FS-2, 3/8 円, 19mm, カッティングエッジ |
| 5-0 polysorb | Med Vet International | NC9335902 | Med Vet International 5-0 ETHICON COATED VICRYL C-3 |
| 加速度計 | Kistler | 8743A5 | 加速度計 |
| Adson-Browns鉗子 | ワールド精密ツール | 500177 | アドソンブラウン鉗子、12 cm、ストレート、TC ジョーズ、7 x 7 歯 |
| アルファキサロン | ジュロックス | 49480-002-01 | アルファキサン ジュロックスによる複数回投与 : 10 mg/mL |
| ブプレノルフィン | パー ファーマシューティカル | 42023-0179-05 | ブプレノルフィン HCL 注射剤: 0.3 mg/mL |
| ブトルファノール | Zoetis | 54771-2033 | 石酸ブトルファノール 10mg/ml by Zoetis |
| クロルヘキシジンハンドスクラブ | BD | 371073 | BD E-Zスクラブ107外科用スクラブブラシ/スポンジ、4%CHG、レッド |
| コレット | STRYKER | 14023 | Stryker 4100-62 ワイヤーコレット 0.28-0.71'' |
| コードレスドライバーハンドピース | STRYKER | OR-S4300 | Stryker 4300 CD3 コードレスドライバー3ハンドピース |
| クリケットリトラクター | Novosurgical | G3510 21 | 2x ハイス(ホルツハイマー)クロスアクションリトラクター |
| ディセクタはさみ | Jorvet labs | J0662 | Aesculap AG、Metzenbaum、はさみ、ストレート5 3/4&プライム; |
| エリザベスカラー | ElizaSoft | 62054 | ElizaSoftエリザベス朝回復カラー |
| エンロフロキサシン | カスタムメッド | エンロフロキサシン カスタムメ | |
| 軟膏 | Pivetal | 46066-753-55 | Pivetal Articifical Tears- 最近リコールされた |
| フェイスマウントシャフトカラー | McMaster-Carr | 5631T11 | フェイスマウントシャフトカラー |
| ファストグリーン | ミリポアシグマ | F7258 | ファストグリーン |
| フリーア | ジョーベットラボ | J0226Q | フリーアエレベーター |
| ヘッドスクリュー -1 | マクマスターカー91251A197 | 酸化物合金鋼ソケットヘッドスクリュー、8-32、3/4 " | |
| ヘッドスクリュー -2 | McMaster-Carr | 92196A194 | ステンレス製ソケットヘッドネジ、8-32、1/2 " |
| ヘッドネジ -3 | McMaster-Carr | 92196A146 | ステンレス製ソケットヘッドネジ、8-32、1/2 " |
| ヘッドネジ -4 | McMaster-Carr | 92196A151 | ステンレス製ソケットヘッドネジ、6-32、3/4 " |
| ヘマトキシリン溶液、ギルNo.1 | ミリポアシグマ | GHS132-1L | ヘマトキシリン溶液、ギル No. 1 |
| 六角ナット | McMaster-Carr | 91841A007 | ステンレス鋼六角ナット、6-32 |
| ホールドダウン トグル クランプ | McMaster-Carr | 5126A71 | ホールドダウン トグル |
| クランプ インパクト デバイス | n/a | /a | カスタムメイド |
| インパクト プラットフォーム | n/ | a n/a | カスタムメイド |
| K-wires | Jorvet Labs | J0250A | JorVet 髄内スタインマン ピン、トロカール-トロカール 1/16" x 7" |
| ラボ View | ナショナルインスツルメンツ | 該当なし | 該当なし ロード |
| セル | キスラー | 9712B5000 | ロードセル |
| MATLAB | The MathWorks Inc. | n/a | n/a |
| 顕微鏡 | ライカ | DMi-8 | ライカ DMi8 顕微鏡 LAS-X ソフトウェア付き |
| ミダゾラム | アルマジェクト | 72611-749-10 | ミダゾラム 塩酸塩注射: アルマジェクト フライス盤による 5mg/ml |
| 深さは | McMaster-Carr | 2949A71 | クランプオン フライス盤の深さは |
| モバイル C アーム | フィリップス | 718095 | BV Pulsera、モバイルCアーム |
| マウントリニアボールベアリング | McMaster-Carr | 9338T7 | マウントリニアボールベアリング |
| ニードル | ドライバーA2Z Scilab | A2ZTCIN39 | TCウェブスターニードルホルダースムースジョーズ5インチ、プレミアム |
| ペントバルビタール | Vortech | 0298-9373-68 | Pentobarbital 390 mg / mL by Vortech |
| Safranin O | Millipore Sigma | HT90432 | Safranin O |
| 小型バッテリーパック | STRYKER | NS014036 | 6212 小型バッテリーパック - 9.6 V |
| スチールロッド、2' | McMaster-Carr | 89535K25 | 鋼棒、2フィート |
| 滅菌生理食塩水 | ICU Medical | 6139-22 | AquaLite Solution Pour Bottles, 250 mL |
| Stryker 6110-120 System 6 Battery Charger | STRYKER | OR-S6110-120 | |
| 手術用手袋 | McKesson | 1044729 | 手術用手袋 McKesson Perry サイズ 6.5 滅菌ペア ラテックス 延長 袖口の長さ スムース ブラウン 化学療法なし |
| 手術用ガウン | McKesson | 1104452 | タオル付き非強化外科用ガウン マッケソンラージブルー滅菌AAMIレベル3使い捨て |
| 縫合はさみ | Jorvet Labs | J0910SA | スーパーカットはさみ、メイヨー、ストレート、5 1/2&プライム; |
| TUNEL染色キット | ABP Bioscience | A049 | TUNEL 発色性アポトーシス検出キット |
| Weitlaner Retractors | Fine Science Tools | 17012-11 | 2x Weitlaner-Locktite Retractors |
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