方法論記事

リッサウイルスの検出、診断、研究におけるメソッドコレクション

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DOI：

10.3791/64453

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2022年7月12日

1College of Forestry, Wildlife and Environment, Auburn University

この記事について

要約

議論された記事:

Berentsen, A. R. et al. 経口狂犬病ワクチン接種生物学的マーカーとして使用するための小さなインドマングース(Herpestes auropunctatus)血清におけるイオフェノキシン酸類似体の分析。視覚化された実験のジャーナル。(147)、E59373(2019)。

Hsu, W. C. et al. 台湾のコウモリ個体群のリッサウイルス監視のための標準操作手順.視覚化された実験のジャーナル。(150)、E59421(2019)。

Jallet, C., Tordo, N.狂犬病ワクチンの効力を評価するためのin vitro ELISA試験。視覚化された実験のジャーナル。(159)、E59641(2020)。

ジャービス、JA、ブラウン、KT、アップル、KA、フィッツジェラルド、DP、デイビス、AD大小の動物における狂犬病剖検技術。視覚化された実験のジャーナル。(149)、E59574(2019)。

Marston, D. A. et al. 狂犬病診断のための汎リッサウイルスリアルタイムRT-PCR.視覚化された実験のジャーナル。(149)、E59709(2019)。

Mauti, S. et al. リソース制限のある設定のための野外狂犬病迅速免疫クロマトグラフィー診断テストとさらなる分子応用。視覚化された実験のジャーナル。(160)、E60008(2020)。

Patrick, E. M. et al. 直接迅速免疫組織化学検査を用いた狂犬病サーベイランスの強化。視覚化された実験のジャーナル。(146)、E59416(2019)。

Wang, Y. et al. リッサウイルス検出のためのユニバーサルネステッド逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の評価.視覚化された実験のジャーナル。(147)、E59428(2019)。

Zaeck, L., Potratz, M., Freuling, C. M., Müller, T., Finke, S. 溶媒除去された脳組織における狂犬病ウイルス感染の高解像度3Dイメージング.視覚化された実験のジャーナル。(146)、E59402(2019)。

編集記事

狂犬病は、急性の進行性のウイルス性脳炎です。弾丸状の病原体は リッサウイルス属に属し、そのうち少なくとも17が世界中で狂犬病を引き起こしています(南極大陸を除く)。狂犬病ウイルスは、これらの多様なRNAウイルスの中で最も重要なメンバーです。すべての哺乳類は影響を受けやすく、コウモリと中肉食動物は重要な貯蔵庫です。感染は主に咬傷後に起こります。典型的な神経向性薬剤として、ビリオンは軸索 を介して 末梢から中枢神経系(CNS)に複製され、その後唾液腺に沈着した後、求心的に進行し、唾液中に排泄されます。世界的に、犬は狂犬病による人間の死亡者数が最も多く、年間数万人が死亡しています。人獣共通感染症の側面を考慮すると、実験室の方法は、人間、家畜、野生生物の応用研究と病気の通知、予防、および制御に不可欠です。この9つの相互に関連する論文の背後にある目的は、狂犬病の発生、検出、病態生物学、疫学、管理、および生物学的製剤の改善を内省する方法を紹介することです。

狂犬病はどのように評価されますか?狂犬病は、データの適切な収集、分析、疫学的解釈を伴う、届出対象の疾患である必要があります。今日、ほとんどの症例は、人々を暴露する動物に基づく受動的監視から報告されています。臨床的容疑者(つまり、狂犬病の診断のために噛む犬)を安全に捕獲、拘束、鎮静、安楽死させることを想像するのはかなり簡単そうに思えるかもしれませんが、一部の野生動物にとってはそれほど簡単ではありません。たとえば、台湾は狂犬病が「ない」と考えられていた地域であり、元々は家畜の広範な監視に基づいていました。しかし、他の動物保護区の重要性を認識した島の捜査官は野生生物に注意を向けました。Hsuらが説明しているように、瀕死のコウモリと死んだコウモリの標的収集は、台湾でユニークなリッサウイルス種を検出する機会を提供します1。このような努力は、このウイルス属の分類学的幅を拡大し、アジアでの他の評価に合理的なスキームを提供しました。

リッサウイルスの診断にはどのような組織が必要ですか?関連する監視方法の導出と正しい種の同定に加えて、狂犬病の高感度で特異的な診断には、安全で適切な組織の選択が最も重要です。19世紀以来 、中枢神経系(CNS)は一次組織として評価されていました。動物は安楽死させられ、死骸は研究室に送られ、頭蓋骨は開かれ、脳は摘出され、一部はウイルス封入体がないか顕微鏡で検査されました。しかし、特に家畜などの大型哺乳類の場合、動物全体の輸送は現実的ではありません。さらに、脳のすべての領域が診断に等しく役立つわけではありません。Jarvisらは、曝露リスクを最小限に抑え、処理時間を短縮する、小型哺乳類と大型哺乳類の両方に対する安全で実用的な剖検方法を説明しています2。このようなバイオセーフティの推奨事項の適用と脳幹と小脳への集中は、動物狂犬病の最新の実験室ベースの監視の実践を改善するでしょう。

ウイルス抗原検出にはどのようなオプションが使用されますか?日常的なリッサウイルス診断には、20世紀半 ばからCNS組織内のウイルス封入体を観察するための直接蛍光抗体(DFA)検査が使用されてきました。DFAテストは感度が高く特異的ですが、蛍光顕微鏡が必要であり、組織固定剤としてアセトンを使用します。Patrickらは、脳幹の収集、組織印象のホルマリン固定、ビオチンに結合したモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用、および光学顕微鏡によるウイルス封入体の検出に依存する直接的迅速免疫組織化学検査(DRIT)の使用を1時間以内に報告しています3。このDRITは、DFAテストと同様の感度と特異性を持ち、現場条件下での分散型で強化された実験室ベースの監視に適しています。Mauti らが報告しているように、リソースが限られた設定では、リニア フロー アッセイ (LFA) は、最小限の技術的専門知識を必要とする迅速な診断のための別の方法です。現場からの陽性テストストリップは、確認のために中央検査室に送ることができます4.

抗原検出以外に、リッサウイルスの診断には他の方法が適していますか?DFA、drit、およびLFAテストは、死後のCNS組織におけるウイルス抗原の検出に役立ちます。ただし、脳組織が分解される可能性があります。さらに、ヒトが疑われる症例では、生前検査がより望ましく、CSF などの代替臨床サンプルを含めることができます。そのため、分子アッセイは少量のウイルス核酸を検出するのに非常に役立ちます。Marston et al. and Wang et al. は、それぞれリアルタイムおよびネストされたポリメラーゼ連鎖反応技術を、それぞれ迅速で高感度で特異的な 5,6 について説明しています。サンプルの汚染を最小限に抑えるための細部への細心の注意と適切なプライマー設計により、多様なリッサウイルスのスペクトル全体にわたる一次診断が可能になります。

診断されたら、従来の顕微鏡検査はリッサウイルスの病態生物学に関する最新の洞察に十分ですか?2次元顕微鏡法のみを使用すると、コンテキストと複雑さにおいて重要なin vivo要素が欠落する可能性があります。しかし、Zaeckらが詳述しているように、長い自由作動距離対物レンズを使用すると、ウイルス感染組織を従来の共焦点レーザー走査顕微鏡で高解像度で画像化して、病原体の分布を視覚化し、ウイルスの病因、拡散、向性、および神経浸潤に関する細かい詳細をよりよく理解することができます7。

狂犬病ワクチンの効力を測定するための代替手段はありますか?狂犬病ワクチンの効力を測定する現在の方法では、多数の実験用げっ歯類が必要です。ただし、コスト、信頼区間、福祉の問題により、代替手段が必要です。狂犬病ウイルス糖タンパク質は、ワクチン接種後にウイルス中和抗体を誘発します。JalletとTordoが伝えたように、動物の代わりにin vitro ELISA試験を使用して、非常に特異的なモノクローナル抗体を使用して、狂犬病ウイルスワクチンの相対的な含有量を測定することができます8。

バイオマーカーを使用して、野生生物による経口ワクチン餌の消費に関する推論は達成できますか?ヒトや家畜の非経口ワクチン接種のほか、野生の中肉食動物の経口ワクチン接種は1970年代から実施されています。バイオマーカーは、ワクチンの免疫原性や、キツネ、アライグマ、スカンクなどの個体群における有効性を症例検出によって測定するだけでなく、ワクチンを含んだ餌の接触と消費を推測するために使用できます。歴史的に、餌から組み込まれたテトラサイクリンの検出は、動物の骨や歯で行われていました。このような硬組織の収集に代わる方法は、イオフェノキシ酸などの別のバイオマーカーの血清学的測定です。Berentsenらは、カリブ海地域に導入されたアジアの重要な天然貯水池であるマングースの血清におけるそのような誘導体の分析について報告しています9。飼育下のマングースがこのバイオマーカーを含む餌を摂取した後、彼らはイオフェノキシ酸をアセトニトリルに抽出し、液体クロマトグラフィー-質量分析によって動物血清を分析しました。餌の摂取後数週間は適切なマーキングが検出され、そのような誘導体は、放し飼いの動物におけるワクチンを含んだ餌の取り込みの現場評価に適している可能性があります。

現在進行中の新型コロナウイルス感染症(COVID-19)のパンデミックもあって、リッサウイルスの監視、病原体発見、確認診断、変異体特性評価の強化におけるウイルス学的方法の改善が期待されています。査読付き文献のさまざまな手法について読むことは、通常、関心のある個人にとって最初のステップです。ただし、一連のステップを直接観察し、経験豊富なオペレーターからコンテキストを聞くことで、ニュアンスや誤解が取り除かれます。OIEとWHOが推奨しているように、狂犬病に関連する現在および将来の実験室および現場プロトコルは、特に発展途上国内の新しい研究者を支援するために、追加の視覚的手法コレクションの恩恵を受ける可能性があります。

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

このコレクションに貢献してくださったすべての著者と、この分野での継続的な進歩に対して同僚に感謝します。

参考文献

  1. Hsu, W. C., et al. Standard operating procedure for lyssavirus surveillance of the bat population in Taiwan. Journal of Visualized Experiments. (150), e59421(2019).
  2. Jarvis, J. A., Brown, K. T., Appler, K. A., Fitzgerald, D. P., Davis, A. D. Rabies necropsy techniques in large and small animals. Journal of Visualized Experiments. (149), e59574(2019).
  3. Patrick, E. M., et al. Enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test. Journal of Visualized Experiments. (146), e59416(2019).
  4. Mauti, S., et al. Field postmortem rabies rapid immunochromatographic diagnostic test for resource-limited settings with further molecular applications. Journal of Visualized Experiments. (160), e60008(2020).
  5. Marston, D. A., et al. Pan-lyssavirus real time RT-PCR for rabies diagnosis. Journal of Visualized Experiments. (149), e59709(2019).
  6. Wang, Y., et al. Evaluation of a universal nested reverse transcription polymerase chain reaction for the detection of lyssaviruses. Journal of Visualized Experiments. (147), e59428(2019).
  7. Zaeck, L., Potratz, M., Freuling, C. M., Müller, T., Finke, S. High-resolution 3D imaging of rabies virus infection in solvent-cleared brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (146), e59402(2019).
  8. Jallet, C., Tordo, N. In vitro ELISA test to evaluate rabies vaccine potency. Journal of Visualized Experiments. (159), e59641(2020).
  9. Berentsen, A. R., et al. Analysis of iophenoxic acid analogues in small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) sera for use as an oral rabies vaccination biological marker. Journal of Visualized Experiments. (147), e59373(2019).

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