Method Article

Ube3a変異体の機能評価のためのスケーラブルな細胞ベースの方法

DOI:

10.3791/64454

⸱

October 10th, 2022

 , 
1Department of Neuroscience, Washington University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

機能の喪失と獲得がアンジェルマン症候群と自閉症スペクトラム障害の両方に関連している 遺伝子であるUbe3aのミスセンスバリアントの機能的重要性を評価するために、簡単でスケーラブルな方法が開発されました。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

医学におけるシーケンシングの使用の増加により、ヒトゲノムに何百万ものコーディングバリアントが特定されました。これらの変異体の多くは神経発達障害に関連する遺伝子に存在しますが、大多数の変異体の機能的重要性は不明のままです。本プロトコルは、自閉症およびアンジェルマン症候群の両方に関連するE3ユビキチンリガーゼをコードする遺伝子である Ube3aの変異体の研究を記載している。 Ube3a の重複または三重化は自閉症と強く関連していますが、その欠失はアンジェルマン症候群を引き起こします。したがって、UBE3Aタンパク質活性の変化の価数を理解することは、臨床転帰にとって重要です。ここでは、 Ube3a 変異体とWnt経路レポーターをペアにする迅速な細胞ベースの方法について説明する。この単純なアッセイはスケーラブルであり、任意の Ube3a 変異体の活性変化の価数と大きさを決定するために使用できます。さらに、本手法の設備により、豊富な構造機能情報の生成が可能となり、UBE3Aの酵素機構を深く理解することができます。

Introduction

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最近の技術の進歩により、臨床現場ではエクソームとゲノムの配列決定が日常的になっています1,2。これにより、タンパク質中の1つのアミノ酸を通常変化させる数百万のミスセンス変異を含む、多数の遺伝的変異が発見されました。これらの変異体の機能的意義を理解することは依然として課題であり、既知のミスセンス変異体のごく一部(~2%)のみが臨床的解釈を持っています1,3。

この問題の顕著な例は、分解のために基質タンパク質を標的とするE3ユビキチンリガーゼをコードする遺伝子であるUbe3aです4。Ube3aは染色体15q11-13内に存在し、母性遺伝対立遺伝子5,6,7からのみ発現します。疾患遺伝学からの観察は、UBE3A酵素の不十分または過剰な活性が明確な神経発達障害を引き起こすことを強く示唆しています。母体の染色体15q11-13の欠失は、重度の知的障害、運動障害、発作、頻繁な笑顔を伴う幸せな態度、および異形性顔の特徴を特徴とする障害であるアンジェルマン症候群(AS)8を引き起こします8,9,10。対照的に、母体の染色体15q11-13の重複または三重化は、自閉症の最も一般的な症候群形態の1つとして認識されている不均一な状態であるDup15q症候群を引き起こします11,12,13。さらに、Ube3aでは何百ものミスセンスバリアントが特定されており、その大部分は機能的および臨床的意義が不明であるため、重要性が不確実なバリアント(VUS)と見なされます。したがって、Ube3a変異体を経験的に評価して、それらが神経発達疾患に寄与するかどうかを判断する方法の開発には大きな関心が寄せられています。

UBE3A酵素は、E3ユビキチンリガーゼのHECT(E6-AP C末端に相同)ドメインファミリーに属し、すべてがE2酵素から活性化されたユビキチンを受け入れて基質タンパク質に転移するために必要な生化学的機構を含む同名のHECTドメインを有する14。歴史的に、E3酵素の特性評価は、精製タンパク質のアンサンブルを必要とする再構成されたin vitroシステムに依存してきました4,15,16。そのような方法は遅くそして労働集約的でありそして多数の変種の活性を評価するのには適していない。以前の研究では、UBE3Aは、プロテアソームの機能を調節してβ-カテニン17の分解を遅らせることにより、HEK293T細胞のWnt経路を活性化することが特定されました。この洞察により、Ube3a18の機能喪失変異体と機能獲得変異体の両方を特定するための効率的かつ迅速な方法としてWnt経路レポーターを使用できます。以下のプロトコルは、Ube3a変異体を生成する方法、ならびにUbe3a変異体の活性の変化を評価するためのルシフェラーゼベースのレポーターについて詳細に説明している。

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Protocol

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1. Ube3a 変異株を作製するための変異クローニング

  1. すべての Ube3a 変異体を、ニワトリβアクチンプロモーターとEGFP発現のための内部リボソームエントリーサイト(IRES)を含むバイシストロニックベクターであるpCIG2プラスミド(図1A)にクローニングします19。完全長 Ube3a コンストラクトは、N末端Mycタグ配列を含み、5'SacIサイトおよび3'XmaIサイトを使用してpCIG2にクローニングされます。さらに、 Ube3a コード配列内の天然に存在するEcoRI、EcoRV、およびPstIサイトもフラグメントのサブクローニングに使用されます。
    注: Ube3a の匿名化されたバリアントは、文献およびClinVarデータベース1などの一般にアクセス可能なリポジトリで入手できます。追加の報告されていない亜種は、医療センターとの個人的なコミュニケーションを通じて入手できます。
  2. 適合した2段階メガプライマー突然変異誘発法20 を使用して、 Ube3a 読み取りフレームに変異を導入する。第1のステップでは、変異に対する相同性5'および3'の少なくとも30塩基対(bp)によって挟まれた所望の変異(このプロトコルに示される例はUBE3A Q588E変異体を生成することである)を含む変異原性オリゴヌクレオチドを設計する(図1B および 表1)。
  3. 変異原性オリゴヌクレオチドを最初のラウンドPCRに相補的オリゴヌクレオチドとともに使用して、変異を含む200〜400 bpのメガプライマーを生成します(図1C;表2および表3)。1%ゲルを用いたアガロースゲル電気泳動およびその後のゲル精製には、PCR反応容量50 μL全体を使用してください(材料表)。以下の第2ラウンドPCRステップで使用するために、PCR産物を30 μLの脱イオンH2O(diH2O)で溶出します。
  4. 示されているように2回目のPCRを設定します(図1C;表 2 および 表3)。このステップでは、サブクローニングに適した変異部位と末端制限部位を含む、より大きなDNA断片(通常、長さが~1~1.5 kb)が生成されます(図1C)。
  5. PCR反応終了後、得られた生成物をPCR精製キットを用いて精製する(材料表)。30 μLで溶出し、すべての精製生成物およびpCIG2 Ube3a WTコンストラクトを適切な制限酵素で消化します(この例はEcoRIおよびXmaIによる消化を示しています)。
  6. 37°Cで2時間消化した後、アガロースゲル電気泳動(1%ゲル)で消化生成物を分離し、適切な生成物をゲル精製します。メーカーのプロトコル(材料表)に従ってライゲーションをセットアップし、ライゲーション製品をDH10B細菌株に変換し(材料表)、アンピシリン(100 μg/mL)を選択してプレートします。
  7. 翌日、2〜4つのコロニーを選び、ルリアブロス(LB)と100 μg/mLアンピシリンを含む3 mLの培養液を接種します。培養物を振とう(225rpm)しながら軌道インキュベーター内で37°Cで一晩増殖させます。
  8. 翌日、1〜1.5 mLの細菌培養物を使用してプラスミドDNAをミニプレップします(材料表)。残りの培養液を4°Cに置いて保存します。 目的の変異から~200 bpに結合するオリゴヌクレオチドを使用したサンガーシーケンシングにより、ミニプレップされたプラスミドをスクリーニングします。
  9. 4°Cで保存した細菌培養物を使用して、50 mL培養物を再接種し、正しいプラスミドをmidiprepに投与します(材料表)。 Ube3a コード配列を完全に配列決定して、DNAの正しい配列を検証します。
  10. Ube3a変異体プラスミド、β-カテニン活性化レポーター(BAR)21、TK-レニラルシフェラーゼ、リガーゼ死Ube3a(UBE3A C820A変異)、およびpCIG2空のベクターのワーキングストックを、その後のトランスフェクションステップに滅菌H2Oを使用して100 ng/μLの濃度で作成します。

2. ヒト胚性腎臓293T(HEK293T)細胞の調製とトランスフェクション

  1. グルタミン、10%ウシ胎児血清(FBS)、および抗生物質抗真菌剤を予め補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で増殖させたHEK293T細胞でアッセイを実行します17。滅菌した加湿インキュベーター内で細胞を増殖させ、5%CO2を含む37°Cで増殖させる。
  2. バイオセーフティキャビネットを使用して、まず、100 μLの培地中で、1ウェルあたり2.2 ×10 4 細胞の密度で組織培養処理された96ウェル平底プレートに懸濁したHEK293T細胞をプレートし、一晩増殖させます。
  3. 2日目に、バイオセーフティキャビネット内の細胞に、ホタルおよびシミウシイの木のレポータープラスミド(表4)とUbe3aプラスミドをトリプリケートでトランスフェクトします。前述のように、10:1:8の比率のプラスミド(ウェルあたりそれぞれ50 ngのBAR、5 ngのTK-Renilla、および40 ngのUbe3aプラスミド)と0.4 μLのトランスフェクション試薬を使用して、ウェルあたり10 μLの総容量でトランスフェクションを実行します(表4)。
    注:各実験について、空のベクター(GFPのみ)およびリガーゼ死 Ube3a をコードするプラスミドも、ネガティブコントロールとして機能するようにトランスフェクトされます。
  4. 各バリアントのトランスフェクションのマスターミックスを1.5 mLマイクロ遠心チューブ(表4)で作成し、室温(RT)で15分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを軽くたたいてトランスフェクション混合物を穏やかに攪拌し、10 μLのトランスフェクション混合物をウェル内の既存の増殖培地に直接加えます。
  5. その後、細胞をインキュベーターに戻し、プラスミドを48時間発現させます。成長培地の交換は必要ありません。
  6. 蛍光顕微鏡を用いたGFP蛍光によるトランスフェクション効率をモニターします。HEK293T細胞はこの方法で効率的にトランスフェクトされ、細胞の>80%が48時間後にGFPを発現するはずです。

3. ルシフェラーゼ活性の測定

注:ルシフェラーゼ活性は、製造元のプロトコルに従ってホタルと レニラル シフェラーゼの両方をアッセイする市販のシステムを使用して評価されます(材料表)。

  1. トランスフェクトしたHEK293T細胞から培養液を注意深く吸引し、冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄します。PBSを吸引し、25 μLの非変性溶解バッファーを加えて細胞を溶解し、氷上で穏やかに揺り動かしながら15分間インキュベートします。
  2. その後、得られたライセート20 μL(遠心分離は不要)を、100 μLのホタルルシフェラーゼ基質試薬を含む新しい96ウェルアッセイプレートに加えます。軽くたたいてプレートをやさしく混ぜます。
  3. プレートをプレートリーダーにロードし、読み取り高さ1mm、積分時間1秒のトップ検出器を使用して発光を測定します。
    注意: 検出器のゲインは、信号の強度に基づいて調整する必要がある場合があります。
  4. ホタルルシフェラーゼ発光を読んだ直後に、100 μLのレニラ・ルシフェラーゼ基質をウェルに加えます。このステップでは、ホタルルシフェラーゼ活性を同時にクエンチしながら、レニヤのルシフェラーゼ活性を評価します。プレートを穏やかに攪拌してサンプルを混合し、発光を再度測定して、 Renilla ルシフェラーゼ活性を評価します。
    注:このアッセイには他のプレートも使用できますが、黒いフレームと白いウェルを備えたプレートを使用すると、ノイズを最小限に抑えながらルシフェラーゼシグナルを増幅するため、最も感度の高い結果が得られます。
  5. レポーターの反応をホタルルシフェラーゼとレ ニヤ ルシフェラーゼの比率(ホタル/レニラ)として定量化し、三重測定値の値を平均します。その後、各変異体のホタル/レニラ の値を野生型(WT) Ube3a 発現細胞の値に対して正規化して、変異体タンパク質の相対活性を比較します。

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Results

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Ube3aミスセンス変異体の大規模な機能スクリーニングにより、機能喪失および機能獲得変異の幅広い状況を特定
Ube3a変異体を用いた以前の研究は、Wnt応答が細胞UBE3Aタンパク質活性のレポーターとして役立つことを示唆した。これらの観察結果を拡張して、BARアッセイが細胞内のUBE3A活性の範囲を報告するのに適しているかどうかを調査するために、追加の検証実験を実施しました。まず、HEK293T細胞に、ヒトWT Ube3aをコードする様々な量のプラスミドDNAをトランスフェクトした。この実験は、BAR応答が細胞にトランスフェクトされたUbe3aの量に比例して変化することを実証しました(図2A)。第二に、BARアッセイを、文献22で以前に特徴付けられた疾患関連変異体をコードするプラスミドDNAを用いて試験した。これらの中には、良性変異体(R39HおよびA178T)、1つの自閉症関連機能獲得変異体(T458A)、およびさまざ...

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Discussion

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ここで説明するプロトコルは、Ube3a変異体の酵素活性を評価するための効率的でスケーラブルな方法を提供します。このアッセイを使用する際には、慎重な検討を必要とするいくつかの技術的な詳細があります。1つの考慮事項は、このアッセイで使用されるWntレポータープラスミドの選択です。ここで説明するプロトコルは、組換えとTCF結合部位の喪失を最小限に抑えるために特別に設計されたリンカー配列によって分離された12個のT細胞因子(TCF)応答要素の連結体を含むレポーターであるβ-カテニン活性化レポーター(BAR)21を特に使用します。文献23に記載されている追加のルシフェラーゼベースのWntレポータープラスミドがあり、以前の研究はUBE3A活性を評価するために使用できるものがあることを示していますが、BARプラスミドはこの目的のために最も徹底的に特徴付けられています17,18。第二に、レニラ・ルシフェラー...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は開示するものは何もありません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作品は、サイモンズ財団の独立への橋渡し賞(SFARI賞#387972;J.J.Y.)、脳と行動研究財団(JJY)からのNARSAD若手研究者賞、アルフレッドP.スローン財団(JJY)からの研究フェローシップ、およびアンジェルマン症候群財団(J.J.Y)、ホワイトホール財団(J.J.Y.)、およびNIMH(R01MH122786;J.J.Y.)。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% トリプシン-EDTA (1x)、フェノールレッドGibco25300-054
1 Kb DNA ラダーLambda BiotechM108-S
100 bp DNA ラダーLambda BiotechM107
T4 DNA リガーゼ用バッファー 10 mM ATPNew England BioLabsB0202A
5x Phusion HF Reaction Buffer NewEngland BioLabsB0518S
抗生物質-抗真菌剤溶液コーニング30004CI
ブラック/ホワイト アイソプレート-96 ブラック フレーム ホワイト ウェル プレートパーキンエルマー6005030
カルベニシリン 二ナトリウム塩中西部科学KCC46000-5
カウントス 細胞計数チャンバー  スライドサーモフィッシャーサイエンティフィックC10283
カウントス II自動セルカウンター セルカウンティングマシン
カスタムDNAオリゴ統合DNAテクノロジーズ (IDT)
デオキシヌクレオチド (dNTP) 溶液ミックスニューイングランドバイオラボN0447S
DMEM、高グルコース、GlutaMAX サプリメント、ピルビン酸Gibco10569044HEK293T細胞株DPBSの増殖をサポートするための基礎培地
(1x)Gibco14190-136
デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムPromegaE1910
EcoRI-HF New England BioLabsR3101S制限酵素
ウシ胎児血清、認定、熱不活化Gibco16140071ウシ胎児血清
フィッシャーブランド 表面処理 組織培養皿フィッシャーブランドFB012924
FuGENE 6 トランスフェクション試薬PromegaE2691
ゲルローディング 染料 パープル (6x)New England BioLabsB7024A
HEK293T細胞ATCCCRL-3216
高効率 ig 10B 化学的にコンピテントな細胞インタクト ゲノミクス1011-12大腸菌 DH10B 細胞
HiSpeed プラスミド ミディキットQiagen12643ミディプレップ
pCIG2 プラスミド
pGL3 BAR プラスミド
Phusion HF DNA ポリメラーゼニューイングランドバイオラボM0530LDNAポリメラーゼ
ProFlex 3 x 32ウェルPCRシステム生命技術サーモサイク
ラーpTKレニラプラスミド
QIAprepスピンミニプレップキット (250)Qiagen27106ミニプレップ
QIAquickゲル抽出キット (250)Qiagen28706ゲル精製
QIAquick PCR 精製キット (250)Qiagen28106PCR 精製
rCutSmart バッファーNew England BioLabsB6004S
SacI-HFNew England BioLabsR3156S制限酵素
Synergy HTX マルチモード リーダーBioTek プレートリーダーは Gen5 ソフトウェア v3.08 (BioTek)
T4 DNA LigaseNew England BioLabsM0202LLigase
TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, ElectrophoresisFisher ScientificBP13324
Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom FisherbrandFB012931
UltraPure Ethidium Bromide SolutionInvitrogen by Thermo Fisher Scientific
XmaINew England BioLabsR0180S制限酵素
ライフサイエンス による応用バイオシステム 15585011

References

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