羊膜からのルミカン抽出とその保管温度の決定

サマリー

本プロトコルでは、羊膜(AM)からのルミカンの抽出とその保存条件をAM抽出物(AME)として-20°C、4°C、室温(RT)で6、12、20、および32日間行い、そのタンパク質とルミカン濃度を定量します。

要約

ルミカンは、ヒト羊膜(AM)にある小さなロイシンに富むプロテオグリカンで、角膜上皮化とコラーゲン線維の組織化を促進し、角膜の透明性を維持します。本研究では、AMからタンパク質を抽出してルミカンを得る方法が提案されている。さらに、異なる温度および期間で保存されたAM抽出物(AME)中のルミカンの安定性が評価される。100mgのAMを解凍し、機械的に脱上皮化した。脱上皮化したAMを凍結し、微粉末が得られるまで粉砕し、プロテアーゼ阻害剤を含む2.5 mLの生理食塩水で可溶化し、遠心分離してタンパク質抽出しました。上清を回収し、-20°C、4°C、室温(RT)で6、12、20、32日間保存した。その後、各AMEにおいてルミカンを定量化した。この技術により、AMからのルミカン抽出のためのアクセス可能で取得可能なプロトコルが可能になります。ルミカン濃度は保存時間および温度条件に影響された。-20°Cおよび4°Cで12日間保存されたAMEにおけるルミカンは、他のAMEよりも有意に高かった。このルミカン抽出は、治療法や医薬品溶液の開発に役立つ可能性があります。再上皮化および創傷治癒プロセスにおけるAMEルミカンの使用を決定するには、さらなる研究が必要です。

概要

角膜の愛情に最もよく使用される治療法の1つは羊膜移植です。しかし、近年、羊膜組織の様々な成分を代替治療および補助治療として使用するための新しい提案が浮上している。AMの最も研究されている成分の中には、AM抽出物(AME)1,2,3,4,5,6,7から得られるものがあります。AMには、抗血管新生タンパク質、インターロイキン(IL)、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤(TIMP)、好中球細胞外トラップを阻害するTSG-6を媒介する抗炎症タンパク質、成長因子:上皮成長因子(EGF)、トランスフォーミング成長因子(TGF)(アルファおよびベータ)、ケラチノサイト成長因子(KGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、およびコラーゲン原線維形成を調節することによって角膜の透明性を維持するルミカンなどの複数の可溶性因子^{が含まれています1、} 2,3,4,5,6,7,8,9。

ルミカンは、角膜間質マトリックスの間質性コラゲナーゼの主要な細胞外成分の1つである小さなロイシンリッチプロテオグリカン(SLRP)であり、コラーゲン線維の組織化と角膜の透明性の維持に関与しています4,10,11。プロテオグリカンは細胞外マトリックス(ECM)の分子であり、細胞シグナル伝達を実行し、細胞内の恒常性を維持する上で主要な分子です¹²。ECMタンパク質は、創傷治癒中の増殖、分化、および遊走の細胞プロセスを促進することが報告されています¹¹。

証拠は、角膜再上皮化の過程におけるルミカンの参加の可能性を示している。Saikaらは、ある研究で、角膜損傷後、ルミカンが損傷後最初の8時間から最大3日の間に角膜角化細胞で検出できることを示しました。2日目と3日目に最高濃度のルミカンを示し、このプロテオグリカンはその後7日目には検出されなくなります¹³。これらのデータは、角膜再上皮化プロセスの活性化におけるルミカンの関与を示唆している。一方、別の研究では、ルミカンの欠如が再上皮化を遅らせることが報告されました。興味深いことに、ルミカンを追加すると、再上皮化プロセスが加速する可能性があります4,11,13。同様に、最近の研究では、ルミカンが角膜辺縁線維芽細胞の炎症機能を調節できることが報告され^ており14、これは、炎症、抗線維化および再上皮化応答のモジュレーターとしてのルミカンの役割を示唆している。同様に、ルミカンは、Fas-FasLなどのシグナル伝達分子と相互作用することによって角膜応答を調節することができる。また、ノックアウトLum-^/-マウスモデルにルミカンが存在しないことは、ルミカンシグナル伝達の欠如が適切な角膜修復を妨げることを示した¹⁵。

主に、この方法は、AMからルミカンを抽出するための実行可能で親しみやすい方法を実証することを目的としています。この有利なルミカン抽出方法では、同様の濃度のタンパク質を得ることができ、処理時間が短縮され、以前の研究と比較して研究者にとってより便利になります¹⁶。さらに、このAMEルミカンは、角膜修復および再上皮化プロセスのアジュバントとして使用できます。

プロトコル

すべての実験手順は、治験審査委員会によって承認されました(プロジェクト番号CEI-2020/06/04)。AMは、Chávez-Garcíaら¹⁷によって記述されているように準備されたInstituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank(匿名化されたヒト被験者から)から得られた。

1.羊膜抽出物の調製

1. 羊膜バンクから100 mgのAMを入手します。
   注:以前の報告によると、50 mgのAMは合計10 ng / mLのルミカン¹⁴を分泌します。より高い濃度のルミカンを得るには、総面積32cm²に相当する100mgのAMを使用する。
2. AMが凍結している場合は、室温で解凍してください。
   メモ: 層流フードクラス II B で次の手順を実行します。
3. 10 mLの滅菌平衡塩溶液(BSS、 材料表を参照)を含むペトリ皿でAMを2分間洗浄します。
   1. BSSをビーカーに注ぎます。
   2. ステップ3を繰り返し、グリセロール培地がシャーレBSSに存在しないことを目視で確認します。
      メモ: 手順 3 を繰り返します。グリセロール培地がシャーレBSSに存在しないまで必要に応じて。
4. AMを10 mLのディスパーゼII(1.7 IU / mL、 材料表を参照)とともに37°C、5%_CO2 で30分間インキュベートします。
   注:ディスパーゼIIは、上皮細胞に対して穏やかな活性を持つ中性プロテアーゼです。この酵素は、無傷の表皮を真皮から効果的に分離し、無傷の上皮シート¹⁸を単離する。
5. ディスパーゼインキュベーション後、ゴム製の警官を用いて機械的脱上皮^化14 を行う( 材料の表を参照)。顕微鏡による脱上皮化の確認 可視化。
   注:脱上皮化のプロセスは、4倍および20倍の対物レンズを使用した倒立顕微鏡で裏付けられています。細胞層の存在を排除するために組織を視覚化します。
6. AMを10mLのBSSを含むペトリ皿で2分間洗浄します。BSSをビーカーに注ぎます。
7. 脱上皮化AM(dAM)を2 mLの微量遠心チューブに入れます。dAMを液体窒素に40分間浸します。
8. 凍結したdAMを、微粉末が得られるまで-85°Cの予冷乳鉢で2〜3分間手動で粉砕します。
9. 乳鉢で、dAM粉末を2.5 mLのプロテアーゼ阻害剤溶液(プロテアーゼ阻害剤を含むBSS)で可溶化します。
   注:プロテアーゼ阻害剤のすべての錠剤は、次の酵素の混合物で構成されています:膵臓抽出物(0.02 mg / mL)、サーモリシン(メタロプロテアーゼ)(0.0005 mg / mL)、キモトリプシン(0.002 mg / mL)、トリプシン(0.02 mg / mL)、およびパパイン(0.33 mg / mL)( 材料の表を参照)。
10. マイクロピペットで混合物を集め、メスナイフを使ってモルタルの壁をきれいにします。混合物を5 mLチューブに入れます。
11. 30秒間渦とよく混ぜます。
12. 34 x gで4°Cで20分間遠心分離し、直ちに3360 x gで4°Cで20分間遠心分離することにより、組織混合物を均質化します。
13. 収集された上清はAMEです(図1)。各 AME 0.7 mL を異なる 2 mL マイクロ遠心チューブに -20 °C、4 °C、室温 (RT) の異なる温度条件で 6 日間、12 日間、20 日間、33 日間保管します。

図1:AME調製とルミカン濃度測定のプロセス 。 100 mgのAMをディスパーゼIIとともに37°Cで30分間インキュベートし、機械的に脱上皮しました。脱上皮化したAMを洗浄し、液体窒素に40分間浸漬した後、微粉末が得られるまで粉砕し、プロテアーゼ阻害剤を含む2.5mLの生理食塩水緩衝液で可溶化し、遠心分離した。上清を回収し、-20°C、4°C、RTで6、12、20、および32日間、総タンパク質およびルミカン定量まで保存した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. AMEタンパク質定量

注:AME中の総タンパク質の定量は、観察後すぐに実行する必要があります。Lowryタンパク質アッセイを使用してタンパク質を定量し、製造元の指示に従ってください( 材料表を参照)。すべての標準物質とサンプルは三重にアッセイすることをお勧めします。

1. AMEの各サンプル40 μLを96ウェルマイクロプレートにピペットで入れます。
   1. ウシ血清アルブミン(BSA)標準物質を使用して、最終BSA濃度0〜1,500 μg/mL(0、1、5、25、125、250、500、750、1,000、および1,500 μg/mL)の標準曲線を同じマイクロプレートに調製します。
2. 200 μLの修飾ローリー試薬を各ウェルにピペットで入れます。すぐにプレートミキサーで30秒間混ぜます。
3. マイクロプレートをアルミホイルで覆い、RTで10分間インキュベートします。
4. 1xフォリン-シオカルテウ試薬20 μLを各ウェルにピペットで入れます。すぐにプレートミキサーで30秒間混ぜます。
   注:1xフォリン-シオカルテウ試薬を調製するには、2x(2N)試薬を超純水で1:1に希釈します。希釈試薬が不安定であるため、使用当日に1xフォリン-シオカルテウ試薬を調製してください。
5. マイクロプレートをアルミホイルで覆い、RTで30分間インキュベートします。
6. ELISAプレート分光計で660 nmのサンプルの吸光度を測定し ます(材料表を参照)。
   注意: 色は650nmから750nmの間の波長で測定できます。
7. 標準ブランクサンプルの660 nmの吸光度値を平均し、標準サンプルと未知サンプルの他の660 nm値から差し引きます。
   1. ELISAプレート分光計で、エンドポイントモードで10秒間低振とうして吸光度を測定します。
8. 検量線を使用して、各未知サンプルのタンパク質濃度を決定します。
9. タンパク質の計算では、各標準BSA曲線のX軸の濃度に対するY軸の吸光度の値を使用して、線形回帰グラフから濃度を決定します。
   1. 線形回帰とr値の式を取得して、タンパク質濃度を計算します。
      注:結果は、AMのmg(μg / mLタンパク質/ mg AM組織)に対する総タンパク質の正規化された相対濃度値として表されます。

3. AMEにおけるルミカンの定量化

注:ルミカンの濃度は、さまざまな保管条件と期間で保管されたAMEで測定する必要があります。.サンドイッチELISAを使用してルミカンを定量し、製造元の指示に従ってください。すべての標準物質とサンプルを二重にアッセイすることをお勧めします。

1. ヒトルミカン捕捉抗体( 材料の表を参照)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で採用濃度に希釈します。
   注:捕捉抗体バイアルには120μgの抗体が含まれています。0.5 mL の PBS で再構成した後、キャプチャー抗体を 2 μg/mL の作業溶液で希釈します。
   1. 希釈した捕捉抗体を1ウェルあたり100 μLを96ウェルマイクロプレートに即座にピペットで移します。プレートを同封し、RTで一晩インキュベートします。
2. 各ウェルを吸引し、マルチチャンネルピペッターを使用して、PBS中の0.05%ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート20、pH 7.2〜7.4( 材料の表を参照)の洗浄バッファー300 μLでピペッティングして洗浄します。3回繰り返します。
   注意: 最後の洗浄後、プレートをエバートして残っている洗浄バッファーをすべて取り除き、ペーパータオルにそっとたたきます。
3. 300 μLの試薬希釈液:PBS中の1%BSA、pH 7.2-7.4、0.2 μmろ過( 材料の表を参照)を各ウェルに添加してプレートをブロックします。RTで1時間インキュベートします。
4. 手順 2 を繰り返します。
5. 最終濃度125、250、500、1,000、2,000、4,000、8,000 pg/mLの0〜8,000 pg/mLの2倍段階希釈を使用して、96ウェルマイクロプレートに標準曲線を調製します。ELISAルミカンキットには、75 ngの組換えルミカン標準が含まれています( 材料の表を参照)。
6. 100 μLのサンプルと標準曲線をキャプチャ抗体でコーティングされた96ウェルマイクロプレートに追加します。
7. マイクロプレートを覆い、コンパクトなロッカーで2〜3rpmの速度を維持しながら、RTで2時間インキュベートします。
8. 手順 2 を繰り返します。
9. 100 μLのビオチン化検出抗体( 材料の表を参照)を各ウェルに加えます。光から覆い、2〜3rpmの速度を維持するコンパクトなロッカーで低攪拌しながらRTで2時間インキュベートします。
   注:ビオチン化検出抗体バイアルには、24μgの抗体が含まれています。1.0 mLの試薬希釈液で再構成した後、ビオチン化検出抗体を400 ng/mLの作業溶液で希釈します。
10. 手順 2 を繰り返します。
11. ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP、 材料表を参照)の作業希釈液を100 μLの各ウェルに加えます。マイクロプレートを光から覆い、RTで20分間インキュベートします。
    注:反応性ストレプトアビジン-HRPは40倍濃縮されていました。.ストレプトアビジン-HRPの作業溶液1xを試薬希釈液で作製した。
    注意: プレートを直射日光の当たる場所に置かないでください。
12. 手順 2 を繰り返します。
13. 最後に、100 μLの基質テトラメチルベンジジン(TMB、 材料表を参照)溶液を各ウェルに加えます。
    注意: キットに含まれている等量の安定化過酸化水素30%溶液を使用してTMB溶液を調製します。
    注意: 使用直前に溶液を調製し、室温に保ちます。
14. 暗所でRTで30分間インキュベートします。
    注意: プレートを直射日光の当たる場所に置かないでください。それ以上の洗浄は必要ないため、TMB溶液を吸引しないでください。
15. 50 μLの1N H₂SO₄ 停止溶液を加えて比色反応を停止します。プレートを軽くたたいて、完全に混合します。
16. ELISAプレート分光計で450 nmに設定したマイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度を直ちに決定する。
17. ELISAプレート分光計で、エンドポイントモードで10秒間低振とうして吸光度を測定します。
18. 標準ブランクサンプルの450 nmの吸光度値を平均し、標準サンプルと未知サンプルの他の450 nm値から差し引きます。
19. 検量線を使用して、各未知サンプルのルミカン濃度を決定します。
20. ルミカン濃度の計算では、各標準ルミカン曲線のX軸の濃度に対するY軸の吸光度の値(pg/mL)を使用して線形回帰グラフを作成します。
    1. 線形回帰とr値の式を取得して、ルミカン濃度を計算します。
       注:ルミカンの濃度は、抽出された組織のmgに関して正規化されました。.結果は、ルミカンとmg AM(ng / mLルミカン/ mg AM組織)の正規化された相対濃度値として表されます。

結果

結果は、標準偏差(SD)±平均値として報告されます。スチューデント のt検定と分散分析(ANOVA)を実施した。0.05< p値は統計的に有意であると考えられた。統計解析は、統計ソフトウェアを使用して実行されました( 材料表を参照)。

AME中の総タンパク質量は、時間と保管条件の影響を受けました。基礎タンパク質濃度はすべてのAMEで類似していた。総タンパク質の範囲は2.7±0.3 μg/mLで、評価したサンプル間に有意差はありませんでした。しかし、サンプルを12、20、および32日間保存した場合、基礎濃度に対するタンパク質濃度のばらつきは観察されなかった。興味深いことに、AMEのタンパク質濃度は、保存の全時間において、RTに対して4°Cおよび-20°Cで増加した。

同様に、タンパク質濃度を貯蔵時間間で比較したところ、12日、20日、および32日後に変化した。4°Cおよび-20°Cでの32日および20日のAMEでは、RT条件と比較して有意差(p<...

ディスカッション

この研究では、ルミカンの存在がAMEで分析され、さまざまな保管条件下での安定性との直接的な相関関係が分析されました。興味深いことに、AME中の総タンパク質濃度を定量すると、保存後にタンパク質濃度が増加した。証拠は、凍結貯蔵中のタンパク質濃度を変化させる可能性のある3つのメカニズムを示唆しています:低温変性、溶質の凍結濃度、およびタンパク質構造の氷誘発部分的なアンフォールディング¹⁹。凍結プロセスは、サンプル中の液相の結晶化により、保存サンプルのタンパク質濃度に影響を与える可能性があります。結果は、これが冷凍庫での保管時間の影響を受ける濃度を凍結するプロセスとして発生した可能性があることを示唆しています。より長い保存時間(32日および20日)および最も低温(4°Cおよび-20°C)で、より高い濃度のタンパク質が観察された。しかし、タンパク質の濃度が最も高い期間は、ルミカンの濃度が最高ではありませんでした。これは、ルミカンが凍結した温度と時間条件の影響を受ける可能性があることを示唆しています。

結果によると、ルミカン濃度は、4°Cおよび-...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 N H2SO4 ストップソリューション	R&Dシステム	DY994
100 μLマイクロピペット	Eppendorf
1000 μL マイクロピペット	エッペンドルフ
15 mm シャーレ	Symlaboratorios
18 G ニードル (1.2 mm x 40 mm)	BD Becton Dickinson
2 mL 微量遠心チューブ	Eppendorf	Z606340
20 mL プラスチックシリンジ	BDベクトン・ディキンソン
20 μLマイクロピペット	Eppendorf
20-200 μL マイクロピペット	エッペンドルフ
5 mL 微量遠心チューブ	エッペンドルフ	30119401
96 ウェルマイクロプレート	SARSTEDT	821581
アルミホイル	N/A	N/A
羊膜	Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana 羊膜		100 mg
バランス塩溶液	バウシュ+ロム	BSS-403802
ビーカー	該当	なし 該当
BioRender	BioRender		フィギュアデザイン
コンパクトロッカー	BioRad	970822DD	Mod. 5202SD-BIO
完全、EDTAフリー、プロテアーゼ阻害剤 カクテル錠	Roche	11 873 580 001	プロテアーゼ阻害剤
Daiggner vortex Genie 2	A.Daigger & Co. , INC	22220A
Dispase II	Gibco	17105-041
ELISA プレート分光器	Thermo Labsystems	35401106	マルチスキャン
フリーザー
GraphPad プリズム	GraphPad Software, Inc	.バージョン9	統計分析およびグラフィックプログラム
Human lumican DuoSet ELISAキット	R&D Systems	DY2846-05	には、ヒトLumican捕捉抗体
インキュベーターが含まれています	フォーマ・サイエンティフィック	3326 S / N 36481-7002
倒立光学顕微鏡	オリンパス	ための6A13921	Mod.CK2
層流フード	Forma Scientific	14753-567	Mod.1184
液体窒素	N/A	N/A
モルタル	N/A	N/A
マルチチャンネルピペッター	エッペンドルフ
窒素タンク	Thermo Scientific		Mod.Biocan 20
ペーパータオル	N/A	N/A
リン酸緩衝生理食塩水	R&D Systems	DY006
Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23240
プレートシーラー	R&Dシステム	ズDY992
試薬希釈剤	R&Dシステム	DY995	PBS中の1%BSA、pH 7.2-7.4、0.2 μm フィルター付き
冷蔵遠心分離機	centurion scientific Ltd	15877	モッズ。K2015R
	機械的な脱上皮化のための	ゴム製の警察官細胞スクレー	パーNEST
ナイフ		BB521	No. 10または21
レプトアビジン-HRP 40倍濃縮	R&Dシステム	ズパート893975
基質テトラメチルベンジジン(TMB)溶液	R&Dシステム	ズDY999
歯付きピンセットInvent	ドイツ	6b	イノックス
超純水	PISA
ウォッシュバッファーR	&Dシステム	WA126	0.05%Tween 20 in PBS、pH 7.2-7.4