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方法論記事

代謝産物生産に対するフタル酸ジ(2-エチルヘキシル)の影響を研究するためのアルファルファ根滲出液の収集

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DOI：

10.3791/64470

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2023年6月2日

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, 2College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences

この記事について

サマリー

根の滲出液の分泌は、通常、ストレス条件下での植物の外部解毒戦略です。このプロトコルでは、非標的メタボローム分析 を介して アルファルファに対する生体異物の影響を評価する方法について説明します。

要約

根の滲出液は、植物の根と周囲の環境との間の情報通信とエネルギー伝達の主要な媒体です。根の滲出液の分泌の変化は、通常、ストレス条件下での植物の外部解毒戦略です。このプロトコルは、アルファルファ根の滲出液を収集するための一般的なガイドラインを導入して、フタル酸ジ(2-エチルヘキシル)(DEHP)が代謝産物産生に与える影響を研究することを目的としています。まず、水耕栽培実験においてアルファルファ苗をDEHPストレス下で生育させる。次に、植物を50mLの滅菌超純水を含む遠沈管に6時間移し、根の滲出液を採取します。次いで、溶液を真空凍結乾燥機中で凍結乾燥する。凍結サンプルを抽出し、ビス(トリメチルシリル))トリフルオロアセトアミド(BSTFA)試薬で誘導体化します。続いて、誘導体化された抽出物は、飛行時間型質量分析計(GC-TOF-MS)と組み合わせたガスクロマトグラフシステムを使用して測定されます。取得した代謝物データは、バイオインフォマティクス手法に基づいて分析されます。根の滲出液を考慮してアルファルファに対するDEHPの影響を明らかにするために、異なる代謝産物と有意に変化した代謝経路を深く調査する必要があります。.

概要

フタル酸ジ(2-エチルヘキシル)(DEHP)は、可塑性と強度を向上させるための可塑剤としてさまざまなプラスチックやポリマーに広く使用されている合成化合物です。過去数年間で、DEHPが内分泌かく乱物質であり、人間や他の動物の呼吸器系、神経系、生殖器系に悪影響を与えることを示唆する研究が増えています1,2,3。その健康リスクを考慮して、米国環境保護庁、欧州連合、および中国環境モニタリングセンターはすべて、優先汚染物質のリストにDEHPを分類しています。土壌は、プラスチックマルチングと有機肥料の適用、廃水による灌漑、および汚泥農場の適用により、環境中のDEHPの重要なシンクと見なされてきました4。予想通り、DEHPは農地の土壌で遍在的に検出されており、その含有量は中国の一部の地域では乾燥土壌1キログラムあたり最大ミリグラムにまで達しています5,6。DEHPは主に根を介して植物に入り、土壌生態系のさまざまな栄養レベルで生物濃縮を受けることができます7。したがって、ここ数十年にわたって、植物におけるDEHP誘発ストレスについて重大な懸念が提起されてきました。

植物は通常、DEHP曝露に対して脆弱です。DEHPストレスは、種子の発芽と正常な代謝に悪影響を及ぼし、それによって植物の成長と発達を阻害することが観察されています8,9。例えば、DEHPは葉肉細胞に酸化的損傷を誘発し、クロロフィルおよび浸透圧の含有量を減少させ、抗酸化酵素活性を上昇させ、最終的には食用植物の収量および品質を低下させる可能性がある10,11。しかし、DEHPストレスに対する植物の応答に関する以前の研究のほとんどは、酸化ストレスと生理学的および生化学的特性に焦点を当ててきました。植物の代謝に関連する対応するメカニズムはあまり研究されていません。根の滲出液は、植物の根が分泌し、環境に放出する化合物を表す総称です。それらは植物と根圏土壌の間の相互作用媒体と考えられており、植物の成長と発達をサポートする上で重要な役割を果たしています12。根の滲出液がすべての光合成炭素13の約30%〜40%を占めることはよく知られています。汚染された環境では、根の滲出液は、代謝または外部排除を通じて汚染物質のストレスに対する植物の耐性を改善することに関与しています14。結果として、汚染ストレスに対する植物の根の滲出液の応答を深く理解することは、細胞の生化学および生物学的現象に関連する根本的なメカニズムを明らかにするのに役立つ可能性があります15。

メタボロミクス技術は、細胞16、17、組織18、さらには糖、有機酸、アミノ酸、脂質を含む生物19の滲出液内の多数の低分子代謝物を同時に測定するための効率的な戦略を提供します。従来または従来の化学分析法と比較して、メタボロミクスアプローチは検出可能な代謝物の数を大幅に増加させ20、これはより高いスループットの方法で代謝物を同定し、主要な代謝経路を特定するのに役立ちます。メタボロミクスは、重金属21、新興汚染物質22、ナノ粒子19などのストレス環境における生物学的応答の研究分野で広く使用されています。植物に関するこれらの研究のほとんどは、植物内部の代謝変化に焦点を当てていますが、環境ストレスに対する根の滲出液の反応について報告されたものはほとんどありません。したがって、この研究の目的は、アルファルファ根の滲出液を収集するための一般的なガイドラインを導入することです 代謝産物産生に対するDEHPの影響を研究します。この結果は、DEHPによる植物メタボロミクスの追跡調査のためのメソッドガイダンスを提供します。

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プロトコル

このプロトコルの目的は、水耕栽培実験からメタボローム分析までの一般的なパイプラインを提供し、アルファルファの根の滲出液に対するDEHPの効果を定量化することです。

1. 水耕栽培実験

注:このプロトコルは、さまざまな濃度のDEHPのストレス下でアルファルファ(メディカゴサティバ)の苗を得るために設計されたアルファルファ水耕栽培実験の例を示しています。3つの処理が設定されました:無添加のコントロール、および1 mg kg-1および10 mg kg-1のdi(DEHP)をスパイクした栄養溶液。DEHPの濃度は、土壌23中のDEHPの実際の含有量に従って設定されました。各処理には6回の反復がありました。

  1. アルファルファの種子を0.1%次亜塩素酸ナトリウムで10分間、75%エチルアルコールで30分間殺菌します。
    1. 滅菌した種子を蒸留水で数回すすぎ、暗所で30°Cの滅菌ペトリ皿で湿ったろ紙で発芽させます。
  2. 20個の均一で発芽した大きなふっくらとした種子を、(μM単位):Ca(NO 3)2、3,500で構成される栄養溶液で満たされた培養ボトルの生着バスケットに移します。NH4H2PO4, 1,000;KNO3, 6,000;MgSO4, 2,000;Na2Fe-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、75;H3 BO3, 46;MnSO4, 9.1;ZnSO4, 0.8;CuSO4, 0.3;(NH4 )6Mo7O24, 0.02.0.1 M KOHを使用して溶液のpHを7.0に調整します。すべてのソリューションを毎週更新します。
  3. すべての培養ボトルを、光強度150-180 μmol m-2 s-1、日周期16時間、日周期16時間、それぞれ昼(16時間)と夜(8時間)を表す27°Cと20°Cの制御された成長チャンバーに入れます。
  4. 15本の均一なアルファルファ苗を新しいガラス瓶に移し、2週間後に1 mg kg-1および10 mg kg-1 DEHPストレス下で培養実験を行います。ガラス瓶をアルミホイルとパラフィルムで包み、DEHPの光分解と揮発を防ぎます。同じ条件を適用するには、コントロールボトルもアルミホイルとパラフィルムで包みます。液体レベルを維持するために、毎日栄養溶液を補給します。
  5. アルファルファの苗の一貫した成長条件を確保するために、2日ごとにボトルをランダムに配置して回転させます。
  6. 7日間の栽培後、アルファルファの苗をボトルから取り出し、超純水で数回洗浄して、根の滲出液の収集を準備します。

2. 根滲出液の採取・抽出・メタボローム解析

注:このプロトコルは、収集実験、抽出実験、および根の滲出液のメタボローム分析の3つの部分に分かれています。収集実験の目的は、植物サンプルに分泌された代謝物を溶液系に移し、その後の抽出を行うことです。

  1. 収集実験
    1. 10本の均一なアルファルファ苗を50 mLの滅菌脱イオン水で満たされた遠心管に移します。根を水に浸して、根の滲出液を6時間収集します。チューブを直立させてください。処理ごとに少なくとも6回の反復を実行します。
    2. 根を光から保護するために、遠心管をアルミホイルで包みます。
    3. 植物を取り除き、代謝物プロファイリングのために集めた液体を凍結乾燥します。
  2. 抽出実験
    1. 1.8 mLの抽出溶液(メタノール:H2O = 3:1、V / V)をチューブとボルテックスに30秒間加えます。
    2. 氷水浴中で10分間チューブに超音波を当てる。
    3. サンプルを4°C、11,000 × g で15分間遠心分離します。
    4. 200 μLの上清を1.5 mLの微量遠心チューブに慎重に移します。各サンプルから45 μLの上清を採取し、最終容量270 μLの品質管理(QC)サンプルに混合し、サンプルのメタボロームデータのキャリブレーションに使用します。
    5. 抽出物を真空濃縮器で凍結乾燥します。5 μLの内部標準物質(リボヌクレオール)で乾燥を続けます。
    6. 真空濃縮器で蒸発させた後、メトキシアミノ化塩酸塩30 μL(ピリジンに20 mg mL-1の濃度で溶解)をチューブに加え、チューブを80°Cで30分間インキュベートします。次に、40 μLのビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド(BSTFA)試薬(1%トリメチルクロロシラン[TMC]、V/V)をサンプルに加え、チューブを70°Cで1.5時間置いて誘導体化します。
    7. サンプルを室温まで冷却し、5 μLの脂肪酸メチルエステル(FAME)(クロロホルム中)をQCサンプルに加えます。
  3. メタボローム解析
    1. 1.0 μLの誘導体化抽出物を飛行時間型質量分析計(GC-TOF-MS)と組み合わせたガスクロマトグラフシステムに注入し、スプリットレスモードを使用したメタボロームプロファイリング分析を行います。
      1. 根の滲出液の分離にはキャピラリーカラム(30 m x 250 μm x 0.25 μm)を使用し、ヘリウムをキャリアガスとして流速1.0 mL min-1で使用します。注入温度を280°Cに設定し、トランスファーライン温度とイオン源温度をそれぞれ280°Cと250°Cに維持します。
      2. 分離には、次のオーブンプログラムを使用します:50°Cで1分間の等温加熱、310°Cへの10°C/min-1オーブン ランプ、および310°Cで8分間の最終等温加熱。
      3. -70 eVのエネルギーで電子衝突モードを実行します。12.5スペクトル/秒の速度で50〜500 m/zのマススキャン範囲のフルスキャンモニタリングモードを使用してマススペクトルを取得します。
    2. 個々のピークをフィルタリングしてノイズを除去します。偏差値は、四分位範囲に基づいてフィルタリングされます。
    3. 欠損値を最小値の半分で埋め、データを標準化して正規化します。
    4. 最終データを.csv形式で統計解析ソフトウェアにインポートして、多変量解析を行います。
    5. 京都遺伝子ゲノム大百科事典(KEGG)データベース(生体システムの高度な機能と有用性を理解するためのデータベースリソース)で代謝物を調べ、代謝物を炭水化物、酸、脂質、アルコール、アミンなどのさまざまなカテゴリに分類します。統計分析ソフトウェアを使用して円グラフを作成し、すべての根の滲出液における各カテゴリの割合を示します。
    6. 潜在構造判別分析(OPLS-DA)に教師あり直交射影を適用して、グループ間の違いを示します。
    7. スクリーニングは、予測における可変重要度(VIP)>1および p < 0.05(スチューデント のt 検定)に基づいて、代謝物を分化代謝物として有意に変化させました。
    8. メタボロームデータを使用して統計解析ソフトウェアでヒートマップを構築し、さまざまな処理の下でのフォールド変化を使用してヒストグラムを作成します。
    9. KEGGデータベースとPubchemで代謝差を調べ、代謝差を含む代謝経路をまとめます。パスウェイ エンリッチメント解析またはトポロジー解析を実行します。

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結果

この実験では、アルファルファの根の滲出液を上記の方法に従って収集、抽出、および分析しました(図1)。対照、低濃度のDEHP(1 mg L−1)、および高濃度のDEHP(10 mg L−1)の3つの治療群が設定されました。

コントロールのクロマトグラフで合計778のピークが検出され、そのうち314の代謝産物がマススペクトルに従って識別できました。 図2に示すように、これらの代謝産物は、相対的な存在量に基づいて、炭水化物(28.6%)、酸(15.58%)、脂質(13.87%)、アルコール(3.91%)、アミン(0.92%)、その他(37.12%)の6種類に分類できます。0.5%未満の代謝産物は、他の物質としてグループ化されました(図2A)。酸はさらに脂肪酸(56.09%)、アミノ酸(26.62%)、有機酸(13.95%)、およびフェノール酸(3.34%)に細分されま...

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ディスカッション

このプロトコルは、DEHPストレス下でアルファルファの根の滲出液を収集および測定する方法、およびメタボロームデータを分析する方法に関する一般的なガイダンスを提供します。このプロトコルのいくつかの重要なステップに細心の注意を払う必要があります。水耕栽培実験では、アルファルファの苗木を、異なる濃度のDEHPを含む栄養溶液で満たされたガラス瓶で水耕栽培しました。ガラス瓶は、DEHPの光分解を防ぎ、すべての培養液中のDEHP濃度の均一性を保証するために、培養期間を通じてアルミホイルで覆うことによって光から保護する必要があります25,26。DEHP濃度は、DEHP27,28で汚染された土壌に通常見られる濃度に従って、1 mg L-1および10 mg L-1に設定されました。根の滲出液の収集中、根を光から保護するために、遠心管をアルミホイルで包む必要があります。ここで、採取...

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開示事項

著者らは、この論文で報告された研究に影響を与えたと思われる可能性のある競合する金銭的利益や個人的な関係は知られていないと宣言しています。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金会(41877139)、中国国家自然科学財団の主要プロジェクト(41991335)、中国国家重点研究開発プログラム(2016YFD0800204)、江蘇省自然科学基金会(No. BK20161616)、「135」計画、および中国科学院のフロンティアプログラム(ISSASIP1615)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アドニトールSIGMA&ge;99%
アルファルファの種子江蘇省農業科学院(中国・南京)
分析天びんSartoriusBSA124S-CW
BSTFAREGIS Technologieswith 1% TMCS, v/v
Centrifugeサーモフィッシャーサイエンティフィックヘレウス フレスコ17
クロマトグラフィーカラムAgilentDB-5MS (30 m × 250 μm ×0.25 &μ;m)
フタル酸ジ(2-エチルヘキシル)Dr. Ehrenstorfer
FAMEsDr. Ehrenstorfer
ガスクロマトグラフィー(GC)Agilent7890A
粉砕装置Shanghai Jingxin Technology Co., LtdJXFSTPRP-24
質量分析計(MS)LECOPEGASUS HT
メタノールCNW TechnologiesHPLC
キシアミナチオ塩酸塩TCIAR
マイクロ遠心チューブEppendorfEppendorf Quality1.5 mL
オーブンShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LtdDHG-9023A
PyridineAdamasHPLC
R software統計解析ソフト(Pathway Enrichment, Topology)
SIMCA16.0.2 統計解析ソフト(OPLS-DA等)
超低温冷凍庫サーモフィッシャーサイエンティフィックForma 900シリーズ
超音波深セン方曽マイクロエレクトロニクス株式会社YM-080S
真空乾燥機太倉華美生化学機器工場LNG-T98
メト

参考文献

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