根の滲出液の分泌は、通常、ストレス条件下での植物の外部解毒戦略です。このプロトコルでは、非標的メタボローム分析 を介して アルファルファに対する生体異物の影響を評価する方法について説明します。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
根の滲出液は、植物の根と周囲の環境との間の情報通信とエネルギー伝達の主要な媒体です。根の滲出液の分泌の変化は、通常、ストレス条件下での植物の外部解毒戦略です。このプロトコルは、アルファルファ根の滲出液を収集するための一般的なガイドラインを導入して、フタル酸ジ(2-エチルヘキシル)(DEHP)が代謝産物産生に与える影響を研究することを目的としています。まず、水耕栽培実験においてアルファルファ苗をDEHPストレス下で生育させる。次に、植物を50mLの滅菌超純水を含む遠沈管に6時間移し、根の滲出液を採取します。次いで、溶液を真空凍結乾燥機中で凍結乾燥する。凍結サンプルを抽出し、ビス(トリメチルシリル))トリフルオロアセトアミド(BSTFA)試薬で誘導体化します。続いて、誘導体化された抽出物は、飛行時間型質量分析計(GC-TOF-MS)と組み合わせたガスクロマトグラフシステムを使用して測定されます。取得した代謝物データは、バイオインフォマティクス手法に基づいて分析されます。根の滲出液を考慮してアルファルファに対するDEHPの影響を明らかにするために、異なる代謝産物と有意に変化した代謝経路を深く調査する必要があります。.
概要
フタル酸ジ(2-エチルヘキシル)(DEHP)は、可塑性と強度を向上させるための可塑剤としてさまざまなプラスチックやポリマーに広く使用されている合成化合物です。過去数年間で、DEHPが内分泌かく乱物質であり、人間や他の動物の呼吸器系、神経系、生殖器系に悪影響を与えることを示唆する研究が増えています1,2,3。その健康リスクを考慮して、米国環境保護庁、欧州連合、および中国環境モニタリングセンターはすべて、優先汚染物質のリストにDEHPを分類しています。土壌は、プラスチックマルチングと有機肥料の適用、廃水による灌漑、および汚泥農場の適用により、環境中のDEHPの重要なシンクと見なされてきました4。予想通り、DEHPは農地の土壌で遍在的に検出されており、その含有量は中国の一部の地域では乾燥土壌1キログラムあたり最大ミリグラムにまで達しています5,6。DEHPは主に根を介して植物に入り、土壌生態系のさまざまな栄養レベルで生物濃縮を受けることができます7。したがって、ここ数十年にわたって、植物におけるDEHP誘発ストレスについて重....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
このプロトコルの目的は、水耕栽培実験からメタボローム分析までの一般的なパイプラインを提供し、アルファルファの根の滲出液に対するDEHPの効果を定量化することです。
1. 水耕栽培実験
注:このプロトコルは、さまざまな濃度のDEHPのストレス下でアルファルファ(メディカゴサティバ)の苗を得るために設計されたアルファルファ水耕栽培実験の例を示しています。3つの処理が設定されました:無添加のコントロール、および1 mg kg-1および10 mg kg-1のdi(DEHP)をスパイクした栄養溶液。DEHPの濃度は、土壌23中のDEHPの実際の含有量に従って設定されました。各処理には6回の反復がありました。
- アルファルファの種子を0.1%次亜塩素酸ナトリウムで10分間、75%エチルアルコールで30分間殺菌します。
- 滅菌した種子を蒸留水で数回すすぎ、暗所で30°Cの滅菌ペトリ皿で湿ったろ紙で発芽させます。
- 20個の均一で発芽した大きなふっくらとした種子を、(μM単位):Ca(NO 3)2、3,500で構成される栄養溶液で満たされた培養ボトルの生着バスケットに移します。NH....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
この実験では、アルファルファの根の滲出液を上記の方法に従って収集、抽出、および分析しました(図1)。対照、低濃度のDEHP(1 mg L−1)、および高濃度のDEHP(10 mg L−1)の3つの治療群が設定されました。
コントロールのクロマトグラフで合計778のピークが検出され、そのうち314の代謝産物がマススペクトルに従って識別できました。 図2に示すように、これらの代謝産物は、相対的な存在量に基づいて、炭水化物(28.6%)、酸(15.58%)、脂質(13.87%)、アルコール(3.91%)、アミン(0.92%)、その他(37.12%)の6種類に分類できます。0.5%未満の代謝産物は、他の物質としてグループ化されました(図2A)。酸はさらに脂肪酸(56.09%)、アミノ酸(26.62%)、有機酸(13.95%)、およびフェノール酸(3.34%)に細分されま.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
このプロトコルは、DEHPストレス下でアルファルファの根の滲出液を収集および測定する方法、およびメタボロームデータを分析する方法に関する一般的なガイダンスを提供します。このプロトコルのいくつかの重要なステップに細心の注意を払う必要があります。水耕栽培実験では、アルファルファの苗木を、異なる濃度のDEHPを含む栄養溶液で満たされたガラス瓶で水耕栽培しました。ガラス瓶は、DEHPの光分解を防ぎ、すべての培養液中のDEHP濃度の均一性を保証するために、培養期間を通じてアルミホイルで覆うことによって光から保護する必要があります25,26。DEHP濃度は、DEHP27,28で汚染された土壌に通常見られる濃度に従って、1 mg L-1および10 mg L-1に設定されました。根の滲出液の収集中、根を光から保護するために、遠心管をアルミホイルで包む必要があります。ここで、採取.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者らは、この論文で報告された研究に影響を与えたと思われる可能性のある競合する金銭的利益や個人的な関係は知られていないと宣言しています。
謝辞
この研究は、中国国家自然科学基金会(41877139)、中国国家自然科学財団の主要プロジェクト(41991335)、中国国家重点研究開発プログラム(2016YFD0800204)、江蘇省自然科学基金会(No. BK20161616)、「135」計画、および中国科学院のフロンティアプログラム(ISSASIP1615)。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アドニトール | SIGMA& | ge;99% | |
| アルファルファの種子 | 江蘇省農業科学院(中国・南京) | ||
| 分析天びん | Sartorius | BSA124S-CW | |
| BSTFA | REGIS Technologies | with 1% TMCS, v/v | |
| Centrifuge | サーモフィッシャーサイエンティフィック | ヘレウス フレスコ17 | |
| クロマトグラフィーカラム | Agilent | DB-5MS (30 m × 250 μm ×0.25 &μ;m) | |
| フタル酸ジ(2-エチルヘキシル) | Dr. Ehrenstorfer | ||
| FAMEs | Dr. Ehrenstorfer | ||
| ガスクロマトグラフィー(GC) | Agilent | 7890A | |
| 粉砕装置 | Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd | JXFSTPRP-24 | |
| 質量分析計(MS) | LECO | PEGASUS HT | |
| メタノール | CNW Technologies | HPLC | |
| キシアミナチオ塩酸塩 | TCI | AR | |
| マイクロ遠心チューブ | Eppendorf | Eppendorf Quality | 1.5 mL |
| オーブン | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd | DHG-9023A | |
| Pyridine | Adamas | HPLC | |
| R software | 統計解析ソフト(Pathway Enrichment, Topology) | ||
| SIMCA16.0.2 | 統計解析ソフト(OPLS-DA等) | ||
| 超低温冷凍庫 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | Forma 900シリーズ | |
| 超音波 | 深セン方曽マイクロエレクトロニクス株式会社 | YM-080S | |
| 真空乾燥機 | 太倉華美生化学機器工場 | LNG-T98 |
参考文献
- Yin, X. H., Zeb, R., Wei, H., Cai, L. Acute exposure of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) induces immune signal regulation and ferroptosis in oryzias melastigma. Chemosphere. 265, 129053(2021).
- Seyoum, A., Pradhan, A.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
タグ
