低存在量タンパク質の標的質量分析ベースのタンパク質分析におけるマイクロサンプリング(英語)

サマリー

バイオマーカープロガストリン放出ペプチド(ProGRP)で例示された乾燥血清サンプルからの低存在量のバイオマーカーを決定するためのプロトコルが提示されます。抗体コーティングされた磁気ビーズは、プロテオタイプProGRPペプチドの選択的クリーンアップと濃縮に使用されます。捕捉されたペプチドは、続いて液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析によって分析される。

要約

この論文では、乾燥サンプルからの低存在量タンパク質の効率的なサンプルクリーンアップのための詳細な説明を含むプロトコルを提示します。これは、プロテオタイプペプチドアフィニティーキャプチャーおよび液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)測定の前に、ビーズベースのタンパク質分解を使用して実行されます。この手順は、紙カードを使用した従来の乾燥サンプル(乾燥血液スポット[DBS]や乾燥血清スポット[DSS]など)と、体積吸収マイクロサンプリング(VAMS)などの新しいサンプリング方法で収集されたサンプルの両方に適用できます。この手順を説明することに加えて、トリプシンビーズおよび抗体被覆ビーズの両方の調製が、この研究において段階的な方法で提示される。提示された手順の利点は、ビーズを使用した時間効率の高いタンパク質分解と、ペプチドアフィニティーキャプチャーを使用した選択的で堅牢なクリーンアップです。現在の手順では、乾燥血清(DSSとVAMSの両方)中の低存在量の小細胞肺がん(SCLC)バイオマーカーであるプロガストリン放出ペプチド(ProGRP)の決定について説明しています。ビーズ調製の詳細な手順により、新しいアプリケーションや他のラボでのワークフローの実装が容易になります。結果がサンプリング材料に依存する可能性があることが実証されています。本プロジェクトでは、DSSと比較してVAMSを使用して収集されたサンプルでより高い信号強度が見られました。

概要

マイクロサンプリングは、Ivar Bangが1913年にDBSからのグルコースモニタリングを記述して以来、100年以上前から存在^{しています1。}ガスリーとスージーが1963年に新生児2のフェニルアラニンを測定するためにDBS^{を導入した後、}この技術はますます普及しています。タンパク質のサンプリングと保存に関するDBSの最初の報告は1970年代初頭に行われ^3,4、10年後の¹⁹⁸⁰年代に、^DBS5からタンパク質を測定するための質量分析(MS)の最初の報告が見つかりました。この初期の導入にもかかわらず、DBSやその他のマイクロサンプリング技術からのタンパク質のMS測定がより普及したのは世紀の変わり目以降でした。

臨床の文脈では、疾患の診断およびフォローアップ、ならびに治療モニタリングおよびドーピングの目的でタンパク質を決定することが興味深い。少量の乾燥サンプルからのMSによるタンパク質分析物のこの標的測定は依然として困難であり、多くの場合、分析前に広範なサンプル調製が必要です。

MSによるタンパク質の標的定量は、通常、ボトムアップアプローチを適用し、分析前にタンパク質をペプチドに消化することによって行われます。この手順では無数のペプチドが生成されるため、消化された生物学的サンプルの直接分析が困難になります。これを回避する方法は、消化の前または後にMS分析の前もって選択的アフィニティークリーンアップステップを適用する^{ことです6、7、8}。このようにして、目的のタンパク質(またはそのプロテオタイプペプチド、アフィニティーキャプチャーステップが消化後に行われる場合)は、分析前にサンプルマトリックスから選択的に単離され、より低い検出限界⁹を提供する。

DBSカードを使用したマイクロサンプリングには、従来の血液サンプルと比較して、サンプル量が少ない、侵襲性が低いサンプリング、保存安定性の向上など、特定の利点があります。ただし、サンプルマトリックスは異なり、分析に他の課題をもたらす可能性があります(例:乾燥サンプルマトリックスと液体サンプルマトリックス、毛細血管血と血清または血漿)^10,11。DBSで観察される別の課題は、いわゆるヘマトクリット効果であり、血液ヘマトクリット値は、分析のためにさらに処理されるサンプル量に影響を及ぼし、したがって、分析に個人間変動性を導入する¹²。2014¹³で導入されたVAMSなどの新しいマイクロサンプリングユニットは、血液滴の代わりに一定量の血液を収集することでこの問題に対処します。

このプロトコルは、乾燥したマイクロサンプルからの低存在量のバイオマーカーの分析のためのセットアップを記述します。溶出後、乾燥したサンプルを消化し、続いてペプチドアフィニティーキャプチャーによってプロテオタイプペプチドを単離します。モデル分析物はSCLCバイオマーカーProGRPです。ProGRPは全血から確実に測定できないため、サンプルマトリックスとして血清を使用しました。VAMSを使用して収集されたDSSおよび血清サンプルの両方からの代表的な結果が示されています。

プロトコル

健康な献血者からの血清を標準溶液の調製に使用した。健康な献血者からの血清の使用は、ノルウェーの法律に厳密に従って行われた。インフォームドコンセントはすべての被験者から得られた。血清サンプルは、関連するガイドラインおよび規制に従った方法を使用して分析されました。記載されたプロトコルは、前の作業¹⁴で記述された方法の修正版である。バッファーと溶液の組成の概要とそれらの調製方法は 補足表S1に記載されていますが、材料表にはこのプロトコルで使用される 材料 、機器、および試薬が含まれています。

1. 抗体コート磁気ビーズの作製

1. 所望の数のビーズを調製するのに必要な抗体の量を計算する。磁気ビーズ50 mgあたり1 mgの抗体を使用してください。
   注:通常、後続の実験では、サンプルあたり20 μLの20 mg/mLビーズ懸濁液が使用されます(ステップ5.1を参照)。
2. 所望の数のビーズを調製するために必要な抗体量を計算する。
   注:抗体量は抗体濃度に依存し、抗体ごとに計算する必要があります。
3. 希望する量の抗体溶液を5 mLの低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移します。例として、抗体溶液に1 mg/mLの抗体が含まれている場合、0.4 mLを使用して1.0 mLのビーズ懸濁液を調製します(1 mgの抗体/50 mgビーズを含む20 mgビーズ/mL)。
   注:抗体はアミンフリーのバッファーに入っている必要があります。吸着による分析物の損失を避けるために、タンパク質を含むすべての溶液に低タンパク質結合マイクロ遠心チューブを使用してください。
4. 抗体溶液に小さな磁気攪拌棒を加え、連続攪拌下でpHを2.5に調整します。微小電極を備えたpHメーターを使用してpHを測定し、1.0 M HClの規定容量を段階的に添加してpHを調整します(1.0 M HClを10 μLずつ添加することから始め、pHが2.5に近づくにつれて容量を減らします)。pHを2.5に調整するために必要な1.0 M HClの総量を記録します。
5. マイクロ電極を取り外し、酸性化抗体をマグネチックスターラー上で氷上で1時間インキュベートします。
   注:抗体の酸処理は、ビーズ上の抗体の正しい配向を促進するために行われます。HClの濃度は、抗体溶液中の緩衝液濃度に応じて、0.5 Mまたは0.2 M HClに低下させることができます。
6. 抗体溶液を中和します。微小電極を備えたpHメーターを使用してpHを測定し、規定容量の1.0 M NaOHを段階的に添加してpHを7に調整します(10 μLの部分から始めて、pHが7に近づくにつれて容量を減らします)。添加した1.0 M NaOHの総体積を記録します。
   注:NaOHの濃度は、ステップ1.4で使用したHCl濃度と同じである必要があります。NaOHは非常に腐食性があります。手袋や適切な目の保護具などの保護具を使用してください。
7. 使用するトシル活性化磁気ビーズの希望体積を計算します。
   注:通常、小規模カップリングを行う場合は、20 mgビーズ/ mLを使用することをお勧めします。最低5mgのビーズを使用する必要があります。
8. 磁気ビーズ懸濁液をボルテックスミキサーで完全に混合し、所望の量のビーズ懸濁液を含む容量を引き出します。例として、1 mLのビーズ懸濁液を調製するには、20 mgのビーズを含む容量を取り出します(ビーズの濃度が30 mg/mLの場合は667 μL)。
9. ビーズ懸濁液を磁気ラックに1分間置き、上清を取り除きます。等量のタイプ1 H 2 O(30 mg/mLビーズ溶液を使用して20 mg/mL抗体コーティングビーズ1 mLを調製した場合は667 μL)でビーズを₂倍洗浄します。洗浄液を加えるたびにボルテックスミキサーを使用して混合し、上清を除去する前に磁気ラックに1分間置きます。
10. 酸処理抗体、0.5 Mホウ酸緩衝液(pH 9.5)(最終濃度は0.1 Mであるため総容量の1/5、ビーズ懸濁液1 mLを調製するには0.2 mLに相当)、および抗体カップリング用カップリングバッファー(抗体コーティング磁気ビーズ1 mLを調製するには、カップリングバッファーの容量を1 mL - 酸処理抗体の容量 - 0.2 mLのホウ酸塩バッファー)と等しくする必要があります。ボルテックスミキサーを使用して混合します。
    注:酸処理された抗体の容量は、抗体溶液の容量(1 mg/mLの抗体溶液を使用して1 mLのビーズ懸濁液を調製する場合は0.4 mL)+pHを2.5に調整するために使用した1.0 M HClの容量+pHを7に調整するために使用した1.0 M NaOHの容量に等しくなります。
    注:抗体カップリング用の0.5 Mホウ酸緩衝液(pH 9.5)およびカップリング緩衝液の組成は、 補足表S1に記載されています。
11. エンドオーバーエンドのサンプルミキサーを使用して、できれば往復回転と振動で周囲温度で一晩回転させます。
12. 239 × gで10分間遠心分離します。チューブを磁石の上に2分間置き、上清を取り除きます。
13. エンドオーバーエンドサンプルミキサーを使用して、周囲温度で抗体ビーズの保存バッファー中で回転させることにより、ビーズを2 x 2時間、一晩1回洗浄します。手順 1.10 の合計ボリュームと同じボリュームを使用します。チューブを磁石に1分間置き、各洗浄の間に上清を取り除きます。
    注:抗体ビーズの保存バッファーの組成は、 補足表S1に記載されています。
14. 所望のストック濃度のビーズ(典型的には20mg/mL)を用いて所望の緩衝液(例えば、ステップ1.13と同じ緩衝液)に保存する。冷蔵庫に保管してください。

2. トリプシン固定化ビーズ2mL(ビーズ20mg/mL)の調製

1. 20 mLの1 mM HClを2 mLのNHS活性化アガロースビーズに加え、ビーズを洗浄します。
2. 混合し、2,655 × g で5分間遠心分離します。上清を取り除きます。
3. 20 mLの0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.8)を加えます。ボルテックスミキサーと遠心分離機を使用して、2,655 × g で5分間混合します。上清を取り除きます。
   注:0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.8)の組成は、 補足表S1に記載されています。
4. 2 mLの20 mg/mLトリプシン(トリプシンカップリング用の冷カップリングバッファーに溶解)を2 mL加えます。
   注:トリプシンカップリング用のカップリングバッファーの組成は、 補足表S1に記載されています。バッファーを冷蔵庫に保管します。
5. 温度制御ミキサーを使用して、22°Cおよび1,100rpmで25分間インキュベートします。2,655 × g で5分間遠心分離します。上清を取り除きます。
6. トリプシンビーズ調製用の修飾バッファー2 mLを加え、温度制御ミキサーを使用して22°Cおよび1,100 rpmで20分間インキュベートします。2,655 × g で5分間遠心分離します。上清を取り除きます。
   注:トリプシンビーズを調製するための修飾バッファーの組成は、 補足表S1に記載されています。バッファーを冷蔵庫に保管します。
7. トリプシンビーズ調製用のブロッキングバッファー10 mLを加え、温度制御ミキサーを使用して22°Cおよび1,100 rpmで10分間インキュベートします。2,655 × g で5分間遠心分離します。上清を取り除きます。
   注:トリプシンビーズを調製するためのブロッキングバッファーの組成は、 補足表S1に記載されています。バッファーを冷蔵庫に保管します。
8. 2 mLの保存バッファーを加え、ボルテックスミキサーを使用して混合し、使用するまで冷蔵庫に保存します。
   注:トリプシンビーズの保存バッファーの組成は、 補足表S1に記載されています。バッファーを冷蔵庫に保管します。

3. DSS/VAMSサンプリングとその後の乾燥血清抽出

1. 血清をProGRP(または目的のタンパク質)で適切なレベルでスパイクして、標準物質を準備します。スパイク量を総体積の1%≤保ちます。
   注:ここでは、水中の295 μg/mL ProGRPのストック溶液を、添加血清標準物質の調製に使用しました。
2. ボルテックスミキサーで標準を混合します。
3. 10 μLの血清(スパイクスタンダード)をDBSカードに塗布するか、メーカーのガイドラインを使用して10 μLの血清をVAMS(10 μL)で収集します。DSS の場合は、スポットが点線の円内にあることを確認します。
4. 周囲温度で少なくとも2時間風乾させます。
5. スポット全体を切り取り、2 mLの低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移すか、VAMSをホルダーから取り外して2 mLの低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに入れます。
6. 1,000 μLの100 mM重炭酸アンモニウム(ABC)溶液を加えます。乾燥した血清をスポット/VAMSから1,000 rpmの温度制御ミキサーを使用して22°Cで1時間抽出します。
7. 抽出液を新しい1.5 mL低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移し、トリプシンタンパク質分解を行います。

4. DSS/VAMS抽出物の消化

1. サンプルあたり30 μLのトリプシンビーズ(セクション2で調製)を使用します。すべてのサンプルのトリプシンビーズを含むボリュームを新しい1.5 mL低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移し、2,655 × g で5分間遠心分離し、上清を除去します。
2. トリプシンビーズを1 mLの冷50 mM ABCで2回洗浄してから、ピペットで取り出したのと同じ容量に再懸濁します。2,655 × g で5分間遠心分離し、ステップ間で上清を除去します。
3. 洗浄したトリプシンビーズ30 μLを各DSS/VAMS抽出物に加え、消化を開始します。
4. 温度制御ミキサーなどを使用して、37°Cおよび1,000rpmで2時間インキュベートします。2,655 × g で5分間遠心分離し、上清(ビーズではない)を新しい2.0 mL低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移します。
5. 安定同位体標識(SIL)ペプチドALGNQQPSWDSEDSSNF[K_¹³C₆_15 N₂]を含む14 ng/mL内部標準(IS)溶液を100 mM ABC溶液に²⁵μL加えます。

5. 抗体コート磁気ビーズを用いたプロテオタイプProGRPペプチドの捕捉

1. 抽出ごとに20 μLの抗体コーティングビーズ(セクション1で調製した20 mg/mL)を使用します。すべての抗体コーティングビーズを新しい1.5 mL低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移し、磁石の上に1分間置き、保存バッファーを除去します。
2. 磁気抗体でコーティングされたビーズを、0.05%ポリソルベート20を含む1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.4、および2 x 1 mLのPBSで洗浄してから、ピペットで取り出したのと同じ容量に再懸濁します。ボルテックスミキサーで混合し、バッファー交換の間に1分間磁石の上に置きます。
   注:PBSには、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na 2 HPO4、および1.8 mM KH₂PO₄が含まれています。安定性を高めるために、10倍の濃度で溶液を調製することをお勧めします。10x PBSの100mLの組成については、補足表S1を参照してください。10x PBS 10xの希釈は、~7.4のpHを達成します。
3. 洗浄した磁気ビーズ懸濁液20 μLを、消化されたDSS/VAMS抽出物とISを含む各低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに加えます。周囲温度でエンドオーバーエンドサンプルミキサーを使用して1時間の免疫抽出を実行します。
4. 0.05%(v/v)ポリソルベート20を含む500 μLのPBS、400 μLのPBS、300 μLの10 mMトリス塩酸塩(pH 7.4)、および300 μLの100 mM ABC溶液を使用して磁気ビーズを洗浄します。
   1. 各洗浄液を添加した後、ビーズと洗浄液が入った低タンパク質結合マイクロ遠心チューブをマグネットラックから取り出し、均一になるまで慎重に反転させます。次に、低タンパク質結合マイクロ遠心チューブを磁石に30秒間置き、30秒間反転させ、磁石に1分間置きます。洗浄液を取り除きます。
   2. マイクロ遠心分離機を使用して残りの懸濁液をスピンダウンします。磁石の上に1分間置き、残りの洗浄液を取り除きます。
5. 1 μLの1 H₂O型ギ酸を各サンプルに加え、温度制御ミキサーなどを使用して22°C、1,000 rpmで5分間インキュベートし、捕捉されたペプチドを溶出します。磁石の上に1分間置き、溶出液を新しい1.5 mL低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移します。1回繰り返し、2番目の溶出液を最初の溶出液と同じ低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移します。
6. 各溶出液に20 μLの100 mM ABCを加えます(総容量50 μL)。
7. 遠心分離機(マイクロ遠心分離機)および40 μLの溶出液を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)バイアル用のマイクロインサートに移します。

6. LC-MS/MSによる分析

1. 高い堅牢性のために、エレクトロスプレーイオン化を備えたマイクロLCトリプル四重極MSを使用してください。
2. 移動相A(H 2 OおよびMeCN中の20 mM FA、95:5 v/v)およびB(H₂OおよびMeCN中の20 mM FA、5:95 v/v)でポンプをパージすることにより、分析用のLC-MS/MSシステムを準備します。
3. 分析カラム(C18、内径50 mm x 1 mm、粒子3 μm)を挿入します。
4. 特定の機器の起動手順に従って、分析用の機器の準備を続けます。
5. 装置ソフトウェアで、カラムオーブンの温度を25°Cに、流量を50 μL/min(100%移動相A)に設定します。
6. カラムを移動相Aで少なくとも15分間平衡化します。
7. サンプルをオートサンプラーに入れます。
8. ProGRP特異的なトリプシンペプチドALGNQQPSWDSEDSSNFKおよびそのISの分析のための装置メソッドを準備します。
   注:いくつかのメソッドパラメータは機器固有であり、使用する特定の機器に合わせて最適化する必要があります。ここで使用するメソッドパラメータの詳細については、ステップ 6.9 から 6.11 で説明します。
9. LCのグラジエントプログラムでは、次の設定を使用します:流量:50μL/分;時間0.0〜3.0分:100%移動相A;時間3.0〜18.0分:0%から50%の移動相Bまでの線形勾配を実行します。時間18.0から18.1分:移動相Bを50%から100%に増やします。時間18.1から20.0分:100%移動相B;時間20.0から20.1分:移動相Bを100%から0%に減らします。時間20.1〜30分:100%移動相Aでカラムを再平衡化します(少なくとも10カラム容量を使用)。
10. MS/MS設定の場合は、効率的なイオン化を保証する機器設定を使用して、MS/MSをポジティブモードで実行します。このプロトコルに従うには、+4,000 Vのスプレー電圧、270°Cの加熱キャピラリー温度、シートガスとしての窒素(任意の5ユニット)、および衝突誘起解離(CID)フラグメンテーション用のアルゴン(2 mTorr)を使用します。機器が許す場合は、MSではなく、実行の最初の2分(0〜2分)と最後の1分(29〜30分)を無駄にするようにLCフローを指示します。
11. (A)シグネチャペプチド(ALGNQQPSWDSEDSSNFK):1,005.45→913.3、1,005.45→1,028.3、および1,005.45→1,398.5、および(B)IS SILペプチド(ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_¹³C₆_¹⁵N₂]):1,009.45→921.3、1,009.45→1,036.3、および1,009.45→1,406.5について、選択された反応モニタリング(SRM)遷移を使用します。監視対象のすべての遷移に対して最適化された衝突エネルギー(このプロトコルでは35 V)を使用します。
12. LC-MS/MSシステムで利用可能なソフトウェアを使用して実行するサンプルを含むシーケンスを準備します。注入量を10μLに設定します。
    注意: 必要に応じて、空のサンプルと品質管理サンプルを必ず追加してください。
13. 機器ソフトウェアの「シーケンスの実行」を押して、シーケンスを開始します。
14. アフィニティー捕捉されたProGRP特異的トリプシンペプチドALGNQQPSWDSEDSSNFKおよびそのIS SILペプチドのピーク面積をモニターします。
    注:シグネチャーペプチドALGNQPSWDSEDSSNFKの選択と確認は、他の場所に記載されています¹⁴。

結果

DSSサンプリングとVAMSの両方を使用した分析ワークフローの概要を 図1に示します。サンプリング方法の違いを除いて、手順は同じです。2つのサンプリング方法を使用してサンプリングされた血清の画像を 図2に示します。

両方のサンプリング形態(VAMSおよびDSS)は、ProGRP含有血清のサンプリングに適しています。これは、DSSおよびVAMSサンプリングからのプロテオタイプペプチドおよびIS SILペプチドのMSクロマトグラムが示されている 図3 から見ることができます。なお、乾燥試料と同様に処理した10μLの添加液体血清試料からなる対照試料の分析後のMSクロマトグラムが含まれる。後者は、DSS/VAMS抽出溶液の容量と同じ容量に希釈され、トリプシンビーズを使用して消化され、ペプチドアフィニティーキャプチャーを使用してクリーンアップされました。

VAMSとDSSのサンプリングを比較すると(図4)、VAMSはDSSよりも高いプロテオタイプペプチド/IS面積比を提供します。これは、DSS(純セルロース)に使用される紙に標的タンパク質ProGRPが失われている可能性があることを示しています。さらなる処理と分析の前に血清が乾燥されていない対照サンプルと比較すると(図4)、VAMSは対照サンプルと同様の面積比(両側 t検定、 p≤0.65)を提供し、サンプリング材料に損失がないことを示し、DSSは有意に低い面積比を提供します(両側 t検定、 p≤ 0.005)、サンプリング材料への損失を示します。

簡単な評価はVAMSを用いて行った。直線性は10〜1,000 ng/mL(^R2 = 0.9996)で示され、検出限界(LOD、S / N = 3)は6.7 ng / mLでした。LODは、1 mmのIDカラムを持つかなり古いトリプル四重極(2008)で分析が行われたため、満足のいくものと見なされます。S/Nが10>すべてのレベルの再現性も、IS補正を使用して7%から17%(n = 3)のRSDで満足できると見なされました。

アフィニティー捕捉は、目的のタンパク質またはそのプロテオタイプペプチドを捕捉することによって、消化工程の前後に行うことができます。現在の手順では、ペプチドアフィニティーキャプチャについて説明しています。タンパク質捕捉と比較した場合のこのアプローチの利点は、目的のペプチドのみが捕捉され、さらに効率的なサンプルクリーンアップが達成されることです。これを 図5に示し、ペプチド捕捉後と比較してタンパク質捕捉後のノイズが多い、より複雑なフルスキャンクロマトグラムを示しています。 図5 で分析されたサンプルは、DSSサンプリングまたはVAMSを使用してサンプリングされていません。しかしながら、血清もサンプルマトリックスであり、アフィニティー捕捉は、記載された手順においてペプチド捕捉に用いたのと同じ抗体を用いて行われる。

図1:DSSサンプリングとVAMSサンプリングの両方を使用した分析ワークフローの概要。 略語:DSS =乾燥血清スポット;VAMS =体積吸収マイクロサンプリング;LC-MS/MS = 液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:異なる方法でサンプリングされた血清の画像 。 (A)DBSセルロースカードおよび(B)VAMS。略語:DBS =乾燥血液スポット;VAMS =体積吸収マイクロサンプリング。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:DSSおよびVAMSサンプリング後のプロテオタイプペプチドおよびIS SILペプチドの代表的なMSクロマトグラム、ならびに抽出溶液に直接添加したスパイク血清サンプルについて。 MSクロマトグラムは、1.5 μg/mLのProGRPを添加し、(A)VAMS、(B)セルロースサンプリングカード(DSSの場合)、または(C)抽出バッファー(コントロールサンプル)に直接適用した10 μLの血清サンプルを示しています。25マイクロリットルの14 ng/mLは、ペプチドアフィニティーキャプチャーの前にすべてのサンプルに添加されたSILペプチドです。略語:DSS =乾燥血清スポット;VAMS =体積吸収マイクロサンプリング;MS =質量分析;ProGRP = プロガストリン放出ペプチド;IS = 内部標準;SIL = 安定同位体標識。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:ProGRPを添加し、VAMS、DSS、または抽出溶液(対照サンプル)に直接適用(10 μL)した血清サンプルのALGNQQPSWDSEDSSNFK/IS面積比の代表的な結果。 ProGRPの濃度は1.5μg/mLであり、各条件でn = 4である。25 μLの14 ng/mL IS SILペプチドを、ペプチドアフィニティーキャプチャーの前にすべてのサンプルに追加します。*は、面積比がVAMSに適用されたサンプルと有意に異なることを示します(両側 t検定、 p≤0.005)。エラーバーは標準偏差±。略語:DSS =乾燥血清スポット;VAMS =体積吸収マイクロサンプリング;ProGRP = プロガストリン放出ペプチド;IS = 内部標準;SIL = 安定同位体標識。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:インタクトタンパク質抽出後(青)とプロテオタイプエピトープペプチド抽出(赤)後のベースピーククロマトグラム(フルスキャンOrbitrap分析)の比較。 プロテオタイプエピトープペプチド(ALGNQQPSWDSEDSSNFK、m/z 1005.45)の抽出イオンクロマトグラムを右に示します。150 ng mL⁻¹ ProGRPを添加した血清をサンプルとして使用しました。この図は、Levernæsら¹⁴から転載されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足表S1:バッファーと溶液の組成の概要とそれらの調製方法。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

記載されたプロトコルには、トリプシンビーズおよび抗体被覆磁気ビーズの調製を含む、乾燥したマイクロサンプル(DSSおよびVAMS)からの低存在量のバイオマーカーの分析においていくつかの重要なステップを実施する方法に関する情報が含まれています。以前の経験に基づいて、抗体¹⁵の配向を改善するために、ビーズ固定化の前に常に抗体を酸で処理します。

この手順の重要なステップの1つは、最適なマイクロサンプリング形式の選択です。まず、問題の分析物が全血から決定できるかどうか、または濃度が血球の影響を受け、血清または血漿で決定する必要があるかどうかを検討する必要があります(モデル分析物、ProGRPの場合)。

紙ベースのアプローチとポリマーベースのアプローチの両方に利点と制限があります。ProGRPの場合、VAMSはサンプラーからの抽出後の分析物回収に関して明確な利点を提供します。ただし、これはおそらく、DSSサンプル用に別の抽出ソリューションを使用して最適化できます。それにもかかわらず、分析対象物とサンプリング材料の間のこの潜在的な相互作用は、分析のばらつきが増加し、検出限界が高くなる可能性があるため、考慮することが重要です。使用されるISはSILペプチドであり、消化後に最初に添加されるため、ISは消化後のステップ(アフィニティー抽出やLC-MS/MS分析など)を修正します。DSS/VAMSからの抽出および消化ステップでは、IS補正はできません。

この手順では、サンプラーから血清サンプルを抽出した後の消化用のトリプシンビーズと、消化後のプロテオタイプペプチドを捕捉するための抗体コーティング磁気ビーズの2種類のビーズが使用されます。トリプシンビーズを使用する主な理由は、消化をスピードアップすることに加えて、アフィニティーキャプチャ中のサンプル中の残留トリプシン活性を最小限に抑えることです。これは、アフィニティーキャプチャ中のモノクローナル抗体のトリプシンタンパク質分解を回避するために重要です。

トリプシンビーズの調製にはアガロースビーズを使用し、抗体被覆ビーズの調製には磁気ビーズを使用しました。アガロースビーズは磁気ビーズよりも安価ですが、溶液からビーズを分離するには遠心分離が必要であるという制限があります。これにより、ビーズと上澄み液の分離は、磁気ビーズを使用する場合よりも効率が低下します。さらに、アガロースビーズを使用したワークフローの自動化は困難です。ただし、NHS活性化磁気ビーズは入手可能であり、より合理化された自動化可能なサンプル調製ワークフローに使用できます。

マイクロサンプリングは、薬物とバイオマーカーの両方のバイオアナリシスにおける重要なトレンドです。現在のアプローチの課題の1つは、サンプル量(10 μL)が限られていることであり、ProGRP(pg/mL-低ng/mLレベル)などの非常に少量の分析物を測定する際に特に重要になる可能性があります。ただし、この課題は、最先端の分析機器を使用して回避できます。これらの低存在量の分析種では、サンプル調製の選択が非常に重要であり、抗体ベースのアフィニティーキャプチャによる選択的なサンプルクリーンアップが最も頻繁に必要です。ペプチド捕捉は、タンパク質捕捉(同じ抗体を使用)よりもクリーンな抽出物と低い検出限界を提供することが示されている^ため14、本方法はマイクロサンプリングと組み合わせてこのアプローチに焦点を当てています。ペプチド捕捉アプローチの別の利点は、IS SILペプチドがアフィニティー捕捉ステップに対しても補正することである。

この研究では、タンパク質を標的とする抗体をペプチド捕捉に使用しました。これは、タンパク質を標的とする既製の抗体の可用性が、プロテオタイプペプチドを標的とする既製の抗体よりも高いため、利点です。しかし、抗タンパク質抗体がプロテオタイプペプチドを効率的に捕捉するためには、タンパク質消化後にエピトープが無傷である必要があります。さらに、多くの抗体では、正確なエピトープが不明であるため、抗タンパク質抗体の検索は面倒です。これにより、ペプチド捕捉に適用可能な抗タンパク質抗体の数が制限されます。記載された手順は、マトリックスとして血清を使用し、標的分析物としてProGRPを使用して実証される。この手順は、他のマトリックスおよび他の標的分析物にも適用できることを目的としています。プロテオタイプペプチドのアフィニティーキャプチャーのために市販の抗タンパク質抗体を用いる代わりに、カスタムメイドの抗ペプチド抗体を用いることもできる。タンパク質捕捉と比較したペプチド捕捉のクリーンアップ効率を 図5に示します。トリプシンビーズの調製に使用されるアガロースビーズを磁気ビーズと交換することにより、この手順は市場に出回っているロボットサンプル調製ワークステーションとも互換性があるはずです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
酢酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル	カルボシント(シュタード、スイス)		FA33719-20°C未満の冷凍庫で保存します。C
ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6 _15N2] (≥ 95%)	Innovagen (Lund, Sweden)	該当なし	-20°C未満の冷凍庫に保管してください。C
重炭酸アンモニウム BioUltra (≥ 99.5%) Sigma	Aldrich (米国ミズーリ州セントルイス)	09830-500G
Aquasil C18 カラム、3 µm、50 mm x 1 mm	Thermo scientific (Waltham, MA, USA)	77503-051030	100% 水性移動相ベン
ザミジン (≥ 95.0%)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	12072	冷蔵庫で 2-6 °C で保存してください。C
塩化カルシウム二水和物 (≥ 99%)	Sigma Aldrich (米国ミズーリ州セントルイス)	223506-500G
遠心分離機 5804	エッペンドルフ (ハンブルク、ティスクランド)	5804000010
クローン ProGRP アイソフォーム 1	ラジウム病院、オスロ大学病院 (ノルウェー、オスロ)	該当なし	-20°C未満の冷凍庫に保管してください。C
リン酸水素二ナトリウム二水和物(プロ分析)	Sigma Aldrich(米国ミズーリ州セントルイス)	30435-500G
リン酸二ナトリウム十二水和物(プロ分析)	Merck (Darmstadt, Tyskland)	1.06579.0500
Dynabeads M-280 tosylactivated 10 mL	Invitrogen (Carlsbad, USA)	14204	冷蔵庫で2-6°Cで保存してください。C
DynaMag-2	Invitrogen (Carlsbad, USA)	123-21D
Ethanolamine (pro analysis, ≥ 99%)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	#02400
ギ酸 (≥ 99%) for LC-MS	VWR International (Radnor, PA, USA)	84865.260
FTA DMPK-C セルロースカード	Whatman (Kent, UK)	WB129243	DBS カード
HPLCバイアル、透明ガラス、1.5 mL、32 x 11.6 mm、クリーンパック	Nerliens Meszansky(オスロ、ノルウェー)	LPP 11 09 0519
Hulamixerサンプルミキサー	Invitrogen(カールスバッド、米国)	101561503016	エンドオーバーエンドミキシングと相互回転および振動を備えたサンプルミキサー
健康な献血者からのヒト血清	Bloodbank、Ullevål、オスロ大学病院(オスロ、ノルウェー)	該当なし	20°C未満の冷凍庫に保管してください。C
塩酸発煙 37% (分析用エミュア)	メルク (ダルムシュタット、テスクランド)	1.00317.1000
LC-MS/MS システム: Ultimate 3000 システム (オートサンプラー、WPS-3000TRS;マイクロポンプ、LPG-3400M;Flow Manager、FLM-3300、MIC、1X2P-10P)およびTSQ Quantumアクセス。Xcalibur 2.2 SP1.48	Thermo scientific(Waltham、MA、USA)	によって
LC-MS	Merck(Darmstadt、Tyskland)	1.00029.2500
LLバイオトロード、複合ガラス電極	Metrohm(Herisau、Sveits)	6.0224.100
マグネチックスターラー、タイプM10	Franz Morat KG(Eisenbach、ドイツ)	10236
マイクロインサート、ガラス(31 x 6 mm、0.1 mL)	VWR International(Radnor、PA、USA)	548-0006
MilliQ integral 3 with Q-POD	Merck Millipore(Molsheim、France)	ZRXQ003T0	タイプ1
モノクローナル抗体M18	ジウム病院、オスロ大学病院(オスロ、ノルウェー)	の製造には該当しません	2-6°Cで冷蔵庫に保管してください。C
Neoteryx Mitra マイクロサンプラー (10 μL)4サンプラークラムシェル	フィッシャーサイエンティフィック(ウォルサム、マサチューセッツ州、米国)	NC1382947
NHS活性化セファロースビーズ4高速フロー	シグマアルドリッチ(セントルイス、ミズーリ州、米国)	GE17-0906-01	アガロースビーズ、2-6°Cで冷蔵庫に保管。C
Optifit, リフィルピペットチップ, 10 mL	Sartorius Biohit (Helsinki, Finland)	613-2911
Optifit, リフィルピペットチップ, 10 μL	Sartorius Biohit (フィンランド、ヘルシンキ	790012
Optifit, リフィルピペットチップ, 1,000 μL	Sartorius Biohit (フィンランド、ヘルシンキ)	791002
Optifit, リフィルピペットチップ, 200 μL	Sartorius Biohit (ヘルシンキ、フィンランド)	790202
pHガラス電極	Metrohm (Herisau, Sveits)	6.0233.100
pH meter 744	Metrohm (Herisau, Sveits)	8.744.1003
Pipet 10 mL	Sartorius Biohit (Helsinki, Finland)	725090
Pipet m10 µL	ザルトリウスバイオヒット(ヘルシンキ、フィンランド)	725020
ピペットm100µL	Sartorius Biohit (ヘルシンキ、フィンランド)	725050
Pipet m1,000 µL	Sartorius Biohit (ヘルシンキ、フィンランド)	725070
Pipet m20 µL	Sartorius Biohit (ヘルシンキ、フィンランド)	725030
塩化カリウム (KCl ≥ 99.9%)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	P-3911
リン酸二水素カリウム (プロ分析)	Merck (Darmstadt, Tyskland)	1.04873.0250
Protein LoBind Eppendorf tube 0.5 mL	Eppendorf (Hamburg, Tyskland)	525-0133 (0030 108.094)
Protein LoBind Eppendorf tube 1.5 mL	Eppendorf (Hamburg, Tyskland)	525-0132 (0030 108.116)
Protein LoBind Eppendorf tube 2.0 mL	Eppendorf (Hamburg, Tyskland)	525-0134 (0030 108.450)
Protein LoBind Eppendorf tube 5.0 mL	Eppendorf (Hamburg, Tyskland)	525-0792 (0030108.302)
はさみ	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	Z186716-1EA
アジ化ナトリウム (BioUltra; ≥ 99.5%)	Sigma Aldrich (米国ミズーリ州セントルイス)	71289-5G
塩化ナトリウム (分析用)	メルク (ダルムシュタット、タイスクランド)	1.06404.1000
リン酸二水素ナトリウム一水和物 (プロ分析)	メルク (ダルムシュタット、タイスクランド)	1.06346.0500
水酸化ナトリウム (AnalaR NORMAPUR)	VWR International (ペンシルベニア州ラドナー、米国)	28244.295
四ホウ酸ナトリウム十水和物(≥99. %)	Sigma Aldrich (米国ミズーリ州セントルイス)	S9640-500G
Spectrafuge Mini Centrifuge	LABNET International (米国ニュージャージー州エジソン)	C1301
攪拌磁石、25 mm x 6 mm 「Oslash;」、円形	Leybold (ドイツ、ケルン)	666 851
スチュアート Scientific SA8 ボルテックスミキサー	スチュアート (英国スタッフォードシャー州)	Z648531-1EA
スーパークリア遠心分離管 (15 mL)	VWR International (ペンシルベニア州ラドナー、米国)	525-0150
SuperClear 遠心分離管 (50 mL)	VWR International (ペンシルベニア州ラドナー、米国)	525-0155
サーモミキサーコンフォート 1.5 mL	エッペンドルフ (ハンブルク、タイスクランド)	53,55,27,831	温度制御ミキサー
Trizma塩基(試薬グレード、≥ 99.0 %)	Sigma Aldrich(米国ミズーリ州セントルイス)	T6066	Tris(hydroxymethyl)aminometan (tris)
Trizma HCl (試薬グレード、≥ 99.0%)	Sigma Aldrich (米国ミズーリ州セントルイス)	T3253-100G	Tris(ヒドロキシメチル)アミノメタンHCl (トリス HCl)
トリプシン (ウシ膵臓からTCPK処理、10,000-15,000 BAEE単位/mgタンパク質)	Sigma Aldrich (米国ミズーリ州セントルイス)	T8802	-20°C未満の冷凍庫で保存;C
Tween 20	Sigma Aldrich (米国ミズーリ州セントルイス)	P7949-500ML	ポリソルベート 20
ピンセット	Sigma Aldrich (米国ミズーリ州セントルイス)	TEM-78511-27
バイアルキャップ、白、9 mm	Nerliens Meszansky (オスロ、ノルウェー)	LPP 09 15 0981
VAMS (Volumetric adsorptive microsampling) technology, 10 & micro;L、4サンプラークラムシェル	Neoteryx(トーランス、カリフォルニア州、米国)