原子間力顕微鏡(AFM)プローブチップが試料表面に与える接触面積と力を定量化することで、ナノスケールの機械的特性測定が可能になります。弾性率やその他のナノ機械的特性を測定するために、柔らかいサンプルと硬いサンプルの空気または流体にAFMカンチレバーベースのナノインデンテーションを実装するためのベストプラクティスについて説明します。
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この記事について
サマリー
要約
原子間力顕微鏡(AFM)は、ナノスケールのAFMプローブ先端とサンプル表面との相互作用を根本的に測定します。プローブ先端によって加えられる力とそのサンプルとの接触面積を定量化できれば、プローブされる表面のナノスケールの機械的特性(弾性率やヤング率など)を決定することができます。ここでは、定量的AFMカンチレバーベースのナノインデンテーション実験を実行するための詳細な手順を、kPaからGPaまでのさまざまなサンプルタイプの弾性率を決定するためにこの手法を適用する方法の代表的な例とともに提供します。これらには、生きた間葉系幹細胞(MSC)と生理学的バッファー中の核、樹脂が埋め込まれた脱水ロブロリーパイン断面、およびさまざまな組成のバッケン頁岩が含まれます。
さらに、AFMカンチレバーベースのナノインデンテーションを使用して、リン脂質二重層の破断強度(すなわち、突破力)を調査します。メソッドの選択と開発、プローブの選択とキャリブレーション、関心領域の識別、サンプルの不均一性、フィーチャーサイズとアスペクト比、チップの摩耗、表面粗さ、データ分析と測定統計などの重要な実用的な考慮事項について説明し、テクニックの適切な実装を支援します。最後に、AFM由来のナノメカニカルマップと、元素組成に関する追加情報を提供する電子顕微鏡技術との共局在化が実証されます。
概要
材料の機械的特性を理解することは、工学における最も基本的で不可欠なタスクの1つです。バルク材料特性の解析には、引張試験1、圧縮試験2、3点または4点曲げ(曲げ)試験3など、材料システムの機械的特性を特徴付けるために利用できる多数の方法があります。これらのマイクロスケール試験は、バルク材料特性に関する貴重な情報を提供できますが、一般的に故障するために実施されるため、破壊的です。さらに、薄膜、生体材料、ナノコンポジットなど、今日注目されている多くの材料システムのマイクロおよびナノスケールの特性を正確に調査するために必要な空間分解能が不足しています。大規模な機械的試験、主にその破壊的な性質のいくつかの問題に対処し始めるために、鉱物学から微小硬度試験が採用されました。硬度は、特定の条件下での塑性変形に対する材料の耐性の尺度です。一般に、微小硬さ試験では、通常は硬化鋼またはダイヤモンドで作られた硬いプローブを使用して、材料にインデントします。結果として生じるくぼみの深さおよび/または面積を使用して、硬度を決定することができます。ビッカース4、ヌープ5、ブリネル6 硬度など、いくつかの方法が開発されています。それぞれがマイクロスケールの材料硬度の尺度を提供しま....
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プロトコル
注:市販のAFMは多種多様であり、カンチレバーベースのナノインデンテーションにはサンプルタイプと用途が多様であるため、以下のプロトコルは、機器やメーカーに関係なく、すべてのカンチレバーベースのナノインデンテーション実験に必要な共有ステップに焦点を当てて、本質的に比較的一般的になるように意図的に設計されています。このため、著者らは、読者がカンチレバーベースのナノインデンテーションを実行するために選択された特定の機器の操作に少なくとも基本的な知識を持っていると想定しています。ただし、以下に概説する一般的なプロトコルに加えて、流体中のサンプルのカンチレバーベースのナノインデンテーションに焦点を当てた、ここで使用するAFMとソフトウェアに固有の詳細なステップバイステップの標準操作手順(SOP)( 材料表を参照)が 補足資料として含まれています。
1. サンプル調製と装置のセットアップ
- 表面粗さ(理想的にはナノメートルスケール、意図したくぼみ深さの~10倍小さい)と汚染の両方を最小限に抑える方法で、目的の領域の機械的特性を変更することなくサンプルを準備します。
- 媒体(空気または流体など)、予想される弾性率、サンプルのトポグラフィー、および関連する特徴サイズに基づいて、目的のサンプルのナノインデンテーションに適したAFMプローブを選択します(説明の....
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結果
力-変位曲線
図7は、樹脂が埋め込まれたロブロリーマツサンプル(図7A)および間葉系幹細胞(MSC)核上の流体(リン酸緩衝生理食塩水[PBS])(図7B)で空気中で行われたナノインデンテーション実験から得られた代表的なほぼ理想的なF-D曲線を示しています。接触力学モデルの使用は、最初のチップとサンプルの接触点の正確で信頼性の高い決定に依存します。したがって、図7に示すF-D曲線の初期接触点に先行する比較的平坦で低ノイズのベースラインと接触部分の滑らかな傾きは、差し込み図のアプローチ曲線(青色のトレース)と対応する適合(緑色のトレース)の間の優れた一致によって証明されるように、機械的特性を抽出するための解析に最適です。
逆に、カンチレバーベースのナノインデンテーションを実行しているときにユーザーが遭遇する可能.......
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ディスカッション
サンプル調製
空気中のナノインデンテーションの場合、一般的な調製方法には、凍結切片(例えば、組織サンプル)、粉砕および/または研磨とそれに続くウルトラミクロトミング(例えば、樹脂包埋生物学的サンプル)、イオンミリングまたは集束イオンビーム調製(例えば、研磨に適さない半導体、多孔質、または混合硬度サンプル)、機械的または電気化学的研磨(例えば、金属合金)、または薄膜堆積(例えば、原子層または化学蒸着、 分子線エピタキシー)。目標は、最小限の表面粗さ(理想的にはnmスケール、意図したくぼみ深さの≤0.1倍)のサンプルを作成することです。前述の方法の多くでは、サンプルを高純度のろ過(HPLCグレードなど)溶媒ですすぎ、および/または超音波処理し、超高純度(99.999%)窒素(N2)ガスで乾燥させて粒子状破片を除去する必要があります。あるいは、フレーク(例えば、2D材料)または粒子(例えば、ナノ粒子またはマイクロカプセル)は、高純度の濾過溶媒を用いて調製された溶液からスピンコーティングまたはドロップキャストされ得る。この場合の目標は、サンプル上のランダムに選択された領域の視野内に複.......
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開示事項
著者は、開示すべき利益相反はありません。
謝辞
すべてのAFM実験は、ボイシ州立大学表面科学研究所(SSL)で実施されました。SEMの特性評価は、ボイシ州立材料特性評価センター(BSCMC)で実施されました。バイオ燃料原料に関するこの出版物で報告された研究は、原料変換インターフェースコンソーシアム(FCIC)の一部として、米国エネルギー省、エネルギー効率および再生可能エネルギー局、バイオエネルギー技術局、およびDOEアイダホオペレーションオフィス契約DE-AC07-051ID14517。細胞力学研究は、米国国立衛生研究所(米国)の助成金AG059923、AR075803、P20GM109095、および国立科学財団(米国)の助成金1929188および2025505によって支援されました。モデル脂質二重層システムの研究は、助成金R01 EY030067の下で国立衛生研究所(米国)によってサポートされました。著者らは、 図11に示す合成画像を作成したElton Graugnard博士に感謝する。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 原子間力顕微鏡 | Bruker | Dimension Icon | PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping(PF-QNM)、FastForce Volume(FFV)、Point-and-Shoot Ramping実験ワークスペースなどのナノスコープ制御ソフトウェアを使用 |
| AtomicJ | American Institute of Physics | https://doi.org/10.1063/1.4881683 | 柔軟で強力な、無料のオープンソースJavaベースの力曲線解析ソフトウェアパッケージ。Hertz、Sneddon DMT、JKR、Maugis、円錐形またはピラミッド(鈍器および切り捨てられたものを含む)など、多数の接触メカニックモデルをサポートします。また、さまざまな初期接触点推定方法から選択することもできます。データのバッチ処理とその後の統計分析(平均、標準偏差、ヒストグラム、適合度など)をサポートします。文献の引用は: P. Hermanowicz, M. Sarna, K. Burda, and H. Gabry , “AtomicJ:力曲線の解析のためのオープンソースソフトウェア」Rev. Sci. Instrum. 85: 063703 (2014), https://doi.org/10.1063/1.4881683 |
| 緩衝液 (PBS) | Fisher Chemical (NaCl), Sigma Aldrich (KCl), Fisher BioReagents (Na2HPO4 and KH2PO4) | S271(>99%純度NaCl)、P9541(>99%純度KCl)、BP332(>99%純度Na2HPO4)、BP362(>99%純度KH2PO4) | リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を実験室で調製しました。 超純水に溶解した2.7mMのKCl、10mMのNa2HPO4、1.8mMのKH2PO4を溶解。試薬は分析天びんを使用して測定し、ガラス器具を石鹸と水で洗浄した後、使用直前にオートクレーブしました。 |
| クロロホルム | |||
| ダイヤモンドチップAFMプローブ | ブル | カーPDNISP | プリマウント工場校正済みキューブコーナーダイヤモンド(E = 1140 GPa)チップAFMプローブ(公称R = 40 nm)とステンレス鋼カンチレバー(公称k = 225 N/m、f0 = 50 kHz)。ばね定数は工場で測定され(プローブ、シリアル#13435414>の場合、k |
| ダイヤモンドウルトラミクロトームブレード | ジアトーム | ウルトラ 35° | 幅2.1mm。また、最終的な表面処理のためにダイヤモンドブレードに移行する前に、サンプル表面の初期ラフカットに標準的なガラスブレードを使用し |
| エポキシ | ゴリラ接着剤 | 26853-31-6 | エポキシ樹脂と硬化剤を1:1の比率で混合し、ステンレス製のサンプルパック(Ted Pella)に小さな滴を置き、V1グレードの白雲母マイカ(Ted Pella)を取り付けて、リン脂質膜の調製のための原子的に平らな表面を作成しました。 |
| エタノール | |||
| LR 白色樹脂、中グレード (触媒付き) | 電子顕微鏡科学 | 14381 | 500 mL ボトル、ロット #150629 |
| 間葉系幹細胞 (MSC) | N/A | N/A | ナノメカニカル研究用MSCは、Goelzer, M. et al. 「ラミンA/Cは脂肪生成の機械的抑制に不要」に記載されているように、8-10週齢の雄C57BL/6マウスから採取された初代細胞でした。「ラミンA/Cは脂肪生成の機械的抑制に不要です」 Int J MolSci 22: 6580 (2021) doi:10.3390/ijms22126580 and Peister, A. et al. "Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbered mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential" Blood 103: 1662-1668 (2004), doi:10.1182/blood-2003-09-3070. |
| 弾性率標準 | ブルカーPFQNM-SMPKIT-12M | は、HOPG(E= 18 GPa)およびPS(E= 2.7 GPa)を使用しました。また、2x PDMS (Tack 0, E = 2.5 MPa;タック4、E= 3.5 MPa)、PS-LDPE(E = 2.0/0.2 GPa)、溶融シリカ(E = 72.9 GPa)、サファイア(E-345 GPa)、およびチップ特性評価(チタン粗さ)サンプル。すべてのサンプルは、直径12mmのスチールディスク(サンプルパック)にあらかじめ取り付けられています。 | |
| 白雲母 | 雲母 テッド・ペラ | 50-12 | 直径 12 mm V1 グレード 白雲母 |
| Nanscope Analysis | Bruker | バージョン 2.0 | 無料の AFM 画像処理および分析ソフトウェア パッケージですが、Bruker AFM 用に設計されており、Bruker AFM 専用/限定されています。同様の機能は、Gwyddion、WSxM などの無料のプラットフォームに依存しない AFM 画像処理および分析ソフトウェア パッケージから利用できます。力曲線解析の機能が組み込まれていますが、AtomicJは力曲線解析のためのより柔軟でフル機能(例えば、より多くの組み込み接触力学モデルから選択可能、力曲線フィッティング結果の統計解析など)であり、力曲線のバッチ処理を処理します。 |
| リン脂質:POPC、コレステロール(ヒツジ) | Avanti Polar Lipids | POPC:CAS#26853-31-6、コレステロール:CAS#57-88-5 | クロロホルム(25mg / mL)に溶解したPOPC脂質をベンダーから入手し、さらに精製せずに使用しました。同じベンダーのコレステロール粉末をクロロホルム(20 mg / mL)に溶解しました。 |
| プローブホルダー(流体、脂質二重膜) | Bruker | MTFML-V2 | 使用する特定のAFMに特化。MTFML-V2は、マルチモードAFM上の流体中をスキャニングするためのガラス製プローブホルダーです。 |
| プローブホルダー(流体、MSC) | Bruker | FastScan Bio Z-scanner | 、Dimension FastScanヘッド(XYフレクシャースキャナー)と組み合わせて使用します。シリアル番号MXYPOM5-1B154。 |
| プローブホルダー(標準、周囲) | Bruker | DAFMCH | 使用する特定のAFMに特化。DAFMCHは、ナノインデンテーション(PF-QNM、FFV、およびポイントアンドシュートランピング)サンプルパックテッドペラ16218に適した、Dimension Icon AFM用の標準コンタクトおよびタッピングモードプローブホルダーです |
| 。また、https://www.tedpella.com/AFM_html/AFM.aspx#anchor842459 サファイア基板で直径6mm、10mm、12mm、20mm | |||
| カーPFQNM-SMPKIT-12M | プローブの偏向感度を測定するための非常に硬い表面(E = 345 GPa)です(すべてのたわみが基板ではなくプローブから来ることを望みます)。PF-QNM/弾性標準キットの一部です。 | ||
| 走査型電子顕微鏡 | Hitachi | S-3400N-II | ボイシ州立大学。積層造形(AM)Ti-6Al-4Vを除くすべてのサンプルで共局在化SEM/EDSを実行するために使用されます。 |
| シリコンAFMプローブ(標準) | NuNano | Scout 350 | 標準タッピングモードシリコンプローブ、反射性アルミニウム裏面コーティング、k = 42 N/m (公称)、f0 = 350 kHz。公称R = 5 nm。コーティングされていない、または反射性の金の裏面コーティングが施されているものもあります。同様の仕様のプローブは、他のメーカー(Bruker TESPA-V2など)から入手できます。 |
| シリコンAFMプローブ(スティッフ) | ブルカー | RTESPA-525, RTESPA-525-30 | 反射性アルミニウム裏面コーティングを施した回転チップエッチングシリコンプローブ、k = 200 N/m (公称)、f0 = 525 kHz。公称R = RTESPA-525 で 8 nm、RTESPA-525-30 で R = 30 nm。各RTESPA-525-30のばね定数はレーザードップラー振動計によって工場で個別に測定され、プローブに供給されます。 |
| 炭化ケイ素グリット紙(研磨ディスク) | Allied | 50-10005 | 120グリット |
| 化ケイ素AFMプローブ(柔らかく、大半径の半球状先端) | ブル | カーMLCT-SPH-5UM、MLCT-SPH-5UM-DC | もMLCT-SPH-1UM-DCです。工場で校正された(すべてのカンチレバーのプローブ半径とスプリング定数)、大半径(R= 1または5mm)半球チップ(長さ23mmの円筒形シャフトの端)プローブの新製品ライン。DC = ドリフト補償コーティング。6カンチレバー/プローブ(AF)。公称ばね定数:A、k = 0.07 N / m;B、k = 0.02 N/m;C、k = 0.01 N/m;D、k = 0.03 N/m;E、k = 0.1 N/m;F、k = 0.6 N/m。 |
| 窒化ケイ素AFMプローブ(ソフト、ミディアムシャープチップ) | Bruker | DNP | 4カンチレバー/プローブ(A-d)。公称ばね定数:A、k = 0.35 N / m;B、k = 0.12 N/m;C、k = 0.24 N/m;D、k = 0.06 N/m。公称曲率半径、R = 10 nm。 |
| 窒化ケイ素AFMプローブ(ソフトでシャープな先端) | Bruker | ScanAsyst-Air | 公称値:共振周波数、f0 = 70 kHz、ばね定数、k = 0.4 N/m、曲率半径、R = 2 nm。フォースカーブベースのAFMイメージング用に設計されています。 |
| 瞬間接着剤 | ヘンケル | ロックタイト495 | シアノアクリレートベースの瞬間接着剤。ほぼ同等の製品がたくさん手に入ります。 |
| シリンジポンプ | 新時代ポンプシステム | NE1000US | 輸液および回収能力を備えたワンチャンネルシリンジポンプシステム |
| チップ特性評価基準 | ブルカーPFQNM-SMPKIT-12M | チタン(Ti)粗さ基準。PF-QNM/弾性標準キットの一部です。 | |
| 超高純度窒素(UHP N2)、99.999% | Norco | SPG TUHPNI-T | Tサイズ超高純度(99.999%)窒素の圧縮ガスボンベ サンプル乾燥用 |
| ウルトラミクロトーム | ライカ | EM UC6 | ガラスブレード(標準、初期サンプル調製用)とダイヤモンドブレード(最終調製用)を装備 |
| 超純水 | サーモフィッシャー | バーンステッド ナノピュア モデル7146 | モデルは生産終了しましたが、同等の製品があります。生成する ≥18.2 MΩ*cm超純水、1-5 ppb TOC(総有機含有量)、インラインUVモニタリングあたり。0.2 µが含まれています。m微粒子フィルター、イオン交換カラム、UV酸化チャンバー。 |
| 可変速グラインダー | ビューラー | EcoMet 3000 | 手作業による研磨時に炭化ケイ素グリット紙と一緒に使用します。 |
| 防振テーブル(アクティブ) | Herzan | TS-140 | Bruker MultiMode AFMと併用。TMC 65-531防振テーブルの上に置きます。Bruker Dimension Icon AFMは、厳密にパッシブな防振を採用しています(カスタム音響フード、エアテーブル、花崗岩スラブを備えたメーカーから提供されます)。 |
| 除振テーブル(パッシブ) | TMC | 65-531 | 35インチ x 30インチ振動除振テーブル、オプションのエアダンピング付き(無効)。Bruker MultiMode AFMと併用。Herzan TS-140 "Table Stable"アクティブ制振テーブルが上部に配置されています。 |
参考文献
- Hart, E. W. Theory of the tensile test. Acta Metallurgica. 15 (2), 351-355 (1967).
- Fell, J. T., Newton, J. M. Determination of tablet strength by the diametral-compression test. Journal of Pharmaceutical Sciences. 59 (5), 688-691 (1970).
- Babiak, M., Gaff, M.,....
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