方法論記事

肝癌組織由来の微小細胞外小胞の濃縮法

DOI：

10.3791/64499

⸱

2023年2月3日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The First School of Clinical Medicine, Gannan Medical University, 2Laboratory Medicine, First Affiliated Hospital of Gannan Medical University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、最適化された差動超遠心法による肝癌組織由来の小さな細胞外小胞の濃縮について説明します。

要約

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組織由来の小さな細胞外小胞(sEV)は、ソース細胞の機能状態と組織の間質空間の特性を反映することができます。これらのsEVの効率的な濃縮は、それらの生物学的機能の研究にとって重要な前提条件であり、臨床検出技術と治療キャリア技術の開発の鍵です。sEVは通常ひどく汚染されているため、組織から分離することは困難です。この研究は、肝癌組織から高品質のsEVを迅速に濃縮する方法を提供します。この方法には、消化酵素(コラゲナーゼDおよびDNase Ι)と組織とのインキュベーション、70 μmセルストレーナーによるろ過、差動超遠心分離、および0.22 μmメンブレンフィルターによるろ過の4段階のプロセスが含まれます。差動超遠心分離ステップの最適化とろ過ステップの追加により、この方法で得られるsEVの純度は、従来の示差超遠心分離によって達成されるものよりも高くなります。これは、組織由来sEVの研究のための重要な方法論と裏付けとなるデータを提供します。

概要

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小さな細胞外小胞(sEV)は、直径が約30 nmから150 nmで、さまざまな細胞から分泌されます1。それらは組織細胞と通信し、脂質、タンパク質、DNA、RNAなどの重要な生体分子をさまざまな臓器、組織、細胞、および細胞内部分に輸送することにより、局所または遠隔の微小環境を調節することができます。したがって、それらはまた、受信者セル2、3の挙動を変えることができる。特定のsEVの単離と精製は、病気の発症および経過中の生物学的挙動を研究するための不可欠な前提条件です。ゴールドスタンダードと見なされている差動超遠心分離は、sEVを通常存在する組織から分離するために一般的に使用されます4。組織破片、細胞破片、大きな小胞、およびアポトーシス小体は、sEVのみを残してこの技術によって除去することができます。

コラゲナーゼDおよびDNaseIは、細胞または小胞の分子特性に影響を及ぼさないことが示されており、両方の酵素の特性が細胞外マトリックス5における小胞の放出に寄与する。これらの酵素は、ヒト転移性黒色腫組織、結腸癌組織、および結腸粘膜組織からsEVを抽出するために使用されています5、6、7。しかし、これらの方法におけるコラゲナーゼDとDNase Iの濃度と消化時間は異なり、一貫性のない結論につながります。他のサブタイプのsEVの共沈を避けるために、研究者はろ過および/または示差遠心分離によってより大きな細胞外小胞(直径0.1 μmまたは0.2 μm)を除去しました8。ソース組織に応じて、単離および精製の異なる方法が必要とされる場合がある9、10。

従来の差動超遠心分離法を使用して肝臓組織からsEVを抽出すると、上清の表面に白質の層が形成され、その特性を決定する方法はありません。以前の研究11では、この白質の層がsEVの純度に影響を与えることがわかりました。従来の方法で分離されたサンプルの粒子数とタンパク質濃度は現在の方法よりも高かったが、多くの汚染物質が結果の再現性を低下させる可能性があるため、変動係数は大きかった。すなわち、洗剤を用いて(すなわち、1%Triton X-100中の粒子の溶解度を検出する)と、この方法で得られたsEVの純度が高いことを見出した。そこで、この方法を用いて大腸がん組織由来のsEVを単離・精製し、プロテオミクス研究を行っています。

現在、肝臓がんにおけるsEVの研究は、主に血清、血漿、および細胞培養の上清に焦点を当てています12,13,14。しかし、肝臓がん組織由来のsEVは、肝臓がんの生理学的病理と周囲の微小環境をより正確に反映し、他のEVの劣化や汚染を効果的に回避することができます15,16。示差超遠心法を使用することで、この方法は収量を豊かにし、高品質のsEVを得ることができ、肝臓がんのさらなる研究のための重要な基礎を提供します。この方法により、肝癌組織を鋭利な分離により分離し、コラゲナーゼDおよびDNaseIによって解離させることができます。次いで、細胞破片、大きな小胞、およびアポトーシス小体は、濾過および示差超遠心分離によってさらに除去される。最後に、sEVは後の研究のために分離および精製されます。

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プロトコル

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ヒト肝癌組織は、甘南医科大学第一附属病院で肝悪性腫瘍と診断された患者から採取されました。すべての患者がインフォームドコンセントフォームに署名し、ヒト組織サンプルの収集は甘南医科大学第一付属病院の倫理委員会によって承認されました。このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、およびソフトウェアに関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。

1. 事前準備

  1. 転写脱色シェーカーをインキュベーターに入れ、温度を37°Cに設定する。 その他の必要な機器については、 図1 を参照してください。
  2. メスと鉗子に75%のアルコールをスプレーして清掃します。
  3. 6 mgのコラゲナーゼD(4 mg/mL)と24 μLのDNase Ι(80 U/mL)を測定し、1.5 mLのRPMI-1640塩基性培地に添加して消化液を調製します。添加剤が完全に溶解するまで、穏やかな反転で混合します。
  4. 事前に、70 μmおよび0.22 μmのセルストレーナーを1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で湿らせます。
  5. 100 mmの滅菌細胞培養皿をアイスボックスの上に置き、解凍後の肝臓組織を保持します。
  6. 肝細胞癌組織単離後15分以内に、組織ブロック表面の血液をPBSで洗い流し、組織を滅菌凍結チューブに移し、実験まで-80°Cで2週間以内保存します。

2.組織解離

  1. -80°Cの冷凍庫から組織サンプルを取り出し、2 mm x 2 mm x 2 mmの断片にカットした約400 mgの組織をアイスボックスの10 cm細胞培養皿に入れます。
  2. 組織を1.5 mLの消化液を含む6ウェルプレートに移動します。次に、プレートを転移脱色シェーカー(20 rpm / min)に置き、37°Cで20分間インキュベートして、肝がん組織を完全に解離させ、sEVを放出します。
  3. インキュベーターから6ウェルプレートを取り出し、アイスボックスに置きます。80 μLのホスファターゼ阻害剤と200 μLの完全プロテアーゼ阻害剤溶液を加えて、消化を停止します。
  4. 消化液を70 μmのセルストレーナーに移し、ゆっくりとろ過して大きな組織の破片を取り除きます。ろ液を集め、2 mLの遠沈管に入れます。

3.差動超遠心分離

注:すべての遠心分離ステップを4°Cで実行します。

  1. ろ液を500 × g で10分間遠心分離し、新しい2 mL遠沈チューブに上清を回収します。その後、小さな組織の破片のほとんどを取り除くことができます。
  2. 上清を3,000 × g で20分間遠心分離し、細胞残渣を除去します。ピペットの先端が表面の白い物質に触れるまで、上清を新しい遠心チューブに慎重に移します。
  3. 残りの液体を3,000 × gで3分間遠心分離します。次いで、上清を吸引して小胞の採取を容易にする。sEVの純度を確保するために、白い物質が吸引されていないことを確認してください。
  4. 採取した上清を12,000 × g で20分間遠心分離し、900 μLの上清を4.7 mLの超遠心チューブに移します。残りの液体を12,000 × g で3分間遠心分離し、両方の上清を集めて同じ超遠心チューブに混合します。チューブをPBSで完全に満たします。
  5. 上清を100,000 × g で60分間遠心分離します。上清を廃棄し、超遠心チューブにPBSを満たし、100,000 × g で60分間遠心分離してペレットを再懸濁します。ペレットを50 μLのPBSで再懸濁します。
  6. 1 mL滅菌シリンジを使用してsEV懸濁液を吸引し、0.22 μmのメンブレンフィルターでろ過します。ろ液を600 μLの遠沈管に集め、-80°Cで保存してさらに分析します。

4.濃縮品質の評価

  1. 透過型電子顕微鏡でsEVの形態を観察します。
    1. 次に、10μLのsEVサンプルを銅ネットに落とし、室温で10分間インキュベートし、無菌蒸留水で洗浄し、吸収紙を使用して余分な液体を取り除きます。
    2. 10 μLの2%酢酸ウラニルを銅ネットに滴下し、1分間陰性染色します。ろ紙を使用して銅ネットの表面の液体を吸収し、白熱灯の下で2分間乾燥させます。
    3. 銅メッシュを透過型電子顕微鏡で観察し、80kVで画像化します。
  2. ナノ粒子フローサイトメーターを使用して、sEVのサイズ分布と純度を測定します。
    1. 機械を始動する前に、200 μLの品質管理、200 μLのシリカナノスフィア、2 x 200 μLの超純水、2 x 200 μLの洗浄液、および200 μLのPBSを含むチューブを準備します。
      注:sEVサンプルをテストする前に、機器の品質管理を実行し、粒子サイズ標準をテストする必要があります(サイズ分布は、同じ検出条件下で直径の異なる複数のナノミクロスフェア[68-155 nm]で生成された標準曲線を使用して計算する必要があります)。QCビーズとシリカナノスフィアを超純水で100倍希釈し、全量200μLとした。
    2. 洗浄液の量(>10 mL)を確認し、シース液と廃液のレベル(20〜30 cm)の違いに注意してください。
    3. 機器の主電源をオフにします。20秒後、コンピューターの電源を入れ、ソフトウェアを実行するために機器が正しく接続されていることを示すビープ音が鳴るのを待ちます。
    4. [ スタートアップ ]をクリックして、カメラ、レーザー、エアポンプの電源を入れます。
    5. シースフロー-起動をクリックし、超純水をローディングプラットフォームに置きます。4分後(楽器のカウントダウン)、[サンプルブースト]をクリックします|サンプルアンロード。
    6. 30秒後、ブランクチューブをローディングプラットフォームに置き、 サンプルブースト|サンプルアンロード。次に、超純水を入れたチューブをローディングプラットフォームに置き、同時にサンプル ブースト|シースフローパージ。
    7. 手動操作をクリックし、粒子濃縮チューブをローディングプラットフォームに置きます。次に、サンプルブーストを1分間クリックし、同時に「SAMP」で250 nm標準FL SiNPsの品質管理を選択します。インフ」
    8. サンプルサンプリングをクリックし、SPCMをクリックして検出器をオンにします。
      注:この時点で、リアルタイムの信号波形を確認できます。
    9. [自動サンプリング]をクリックし、[サンプリングSETに1.0]と入力して、圧力を1KPaに固定します。ツールバーをクリックし、[大信号]を選択します。
    10. レーザーの水平位置を調整し、レーザーを 2μmに設定します。次に、 L または R をクリックして、信号が強く均一であることを確認します。
    11. [ 記録する時間 ]をクリックしてデータを収集すると、終了すると自動的に[バッファ]にジャンプします。次に、データをNafファイルに保存し、[ サンプル-アンロード]をクリックします。
    12. 洗浄液チューブをローディングプラットフォームに置き、サンプル ブーストをクリックし、1分後に サンプルアンロードをクリックします。超純水を使用して、キャピラリーチップから残留洗浄液を除去します。
    13. 粒子サイズの標準チューブをローディングプラットフォームに置き、 サンプルブースト を1分間クリックします。
    14. 68-155 nm Std FL SiNPsの品質管理を「SAMP.Inf」をクリックし、[サンプルサンプリング]をクリックします。次に、ツールバーをクリックして、[小信号]を選択します。
    15. [ 記録する時間 ]をクリックしてデータを収集すると、終了すると自動的に [バッファ ]にジャンプします。次に、データをNafファイルに保存し、[ サンプル-アンロード]をクリックします。
    16. 洗浄液チューブをローディングプラットフォームに置き、[サンプル ブースト]をクリックし、[ サンプルアンロード ]をクリックしてから1分後に配置します。超純水を使用して、キャピラリーチップから残留洗浄液を除去します。
    17. PBSチューブをローディングプラットフォームに置きます。 サンプルブースト を1分間クリックします。
    18. 68-155 nm Std FL SiNPsの品質管理を「SAMP.Inf」をクリックし、[サンプルサンプリング]をクリックします。次に、ツールバーをクリックして、[小信号]を選択します。
    19. [ 記録する時間 ]をクリックしてデータを収集すると、終了すると自動的に [バッファ ]にジャンプします。データを Naf ファイルに保存し、[ サンプル - アンロード] をクリックします。
    20. 洗浄液チューブをローディングプラットフォームに置き、1分後にサンプル ブースト と サンプルアンロード をクリックします。超純水を使用して、キャピラリーチップから残留洗浄液を除去します。
    21. 手順 4.2.17-4.2.20 で前述したサンプル情報を確認します。PBS (ステップ 4.2.17) を sEV サンプルに変更し、データを分析します。
  3. ウェスタンブロットでsEVをさらに特定します。
    1. 製造元の指示に従って、BCAタンパク質定量キットを使用して、sEVおよび組織のタンパク質濃度を測定します。
    2. これらの定量結果に基づいて、sEVの負荷量を計算します(たとえば、ウェルあたり5 μgのタンパク質の場合)。ローディングバッファーを1:4の比率で追加し、混合物をボルテックスします。
    3. 100°Cの金属浴(ドライサーモスタット)で10分間変性させた後、12%ポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を60Vで80分間分離します。
    4. 転写バッファー(25 mM Tris、192 mM グリシン、20% メタノール)を使用して、ゲルを 0.22 μm ポリビニリデンジフルオリドメンブレンに 220 mA で 2 時間移します。
    5. メンブレンをトリス緩衝生理食塩水トゥイーン(TBST)中の5%脱脂粉乳で室温で1時間ブロックし、一次抗体(ウサギモノクローナル抗ヒトCD9抗体、ウサギモノクローナル抗ヒトCD63抗体、ウサギモノクローナル抗ヒトTSG101抗体、マウスモノクローナル抗ヒトGM130抗体)とともに4°Cで一晩インキュベートします。 一次抗体を5%無脂肪乳で1:1,000で希釈します。
    6. TBSTで3回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体でメンブレンを室温で1時間インキュベートします。
    7. ECLブロッティング基質を用いてHRP結合抗体を検出し、画像を収集・解析します。

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結果

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ヒト肝がん組織由来のsEVは、肝臓がん患者の診断、治療、予後において重要な役割を果たしてきました。この方法では、一般的な実験機器を使用して、肝臓がん組織に由来するsEVを分離および精製しました。これは、sEVの研究に方法論的サポートを提供する可能性があります。図2は、肝がん組織からsEVを濃縮する一般的なプロセスを示しています。組織の細胞間空間におけるsEVは、組織の切断と酵素加水分解によって完全に放出されます。さらに、消化液を70μmのフィルターでろ過して、大きな組織片を除去します。さらに、微分遠心分離ステップ(500 × g、3,000 × g、および12,000 × g)を実行して、小さな組織破片、細胞破片、大きな小胞、およびアポトーシス体を除去しました(図3A-C)。

高純度のsEVを得るために、表面の白色物質が除去されるまで、2つの差...

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ディスカッション

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このプロトコルは、肝臓癌組織からsEVを抽出するための再現性のある方法について説明しています。高品質のsEVは、鋭い組織分離、消化酵素による処理、差動超遠心分離、および0.22μmフィルター膜ろ過および精製によって得られます。ダウンストリーム分析では、sEVの高純度を確保することが非常に重要です。差動遠心分離の過程で、上清の表面に白い物質(未知の組成)の層が現れます。この層はsEVを汚染するため、遠心分離(3,000 × g 、12,000 × g)と0.22 μmの膜ろ過を繰り返して可能な限り除去しました(補足表S1)。この白い層の干渉により、上澄みを吸引しながらsEVを失うリスクがありました。そのため、複数回の遠心分離を慎重に進め、白い物質に触れずにできるだけ慎重に上清を回収することが重要です。

このプロトコルは、高品質の肝臓組織由来sEVを精製することができますが、いくつかの制限があります。これらの実験では、組織ブロックの容量は通常~300-500 mgです。非常に小さな組織ブロックから分離されたsEVの数...

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開示事項

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著者は開示する利益相反を持っていません。

謝辞

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著者らは、この研究を支援してくれた甘南医科大学第一付属病院に感謝します。この研究は、中国国家自然科学財団(助成金番号82260422)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.22 以上m メンブレンフィルターユニットMillexSLGPR33RB
1 mL 滅菌シリンジ湖北省 Xianming Medical Instrument CompanyYL01329
2% 酢酸ウラニル電子顕微鏡 Sciences22400-2
4.7 mL 遠心チューブベックマン・コールター361621
6ウェル セルキューチャープレートLABSELECT11110
50 mLビーカー天津Kangyiheng実験器具販売会社CF2100800
70&マイクロ;m 細胞ストレーナーバイオシャープBS-70-XBS
100 mm 細胞培養皿CELL TERCS016-0128
600 µL 遠心分離チューブAxygenMCT060C
BCA タンパク質定量キットサーモフィッシャーRJ240544
ベックマン・コールター Optima-Max-TLベックマン A95761
BioRad Mini トランスブロットBio-Rad1703930
BioRad Mini-ProteanBio-Rad1645050
CD63 抗体Abcamab134045
CD9 抗体Abcamab263019
遠心分離機 5430REppendorf5428HQ527333
洗浄液NanoFCMC1801
コラゲナーゼ Dロシュ11088866001
銅ネット河南省 Zhongjingkeyi 技術会社DJZCM-15-N1
ドライ サーモスタット杭州 allsheng instruments companyAS-01030-00
FITC 抗ヒト CD9 抗体ElabscienceE-AB-F1086C
グリシンSolarbioG8200
ヤギ西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)共役二次抗マウス抗体 プロテインテックSA00001-1
ヤギワサビペルオキシダーゼ (HRP) 共役二次抗ウサギ抗体 プロテインテックSA00001-2
メタノール上海鎮興化学公司
ナノ粒子フローサイトメーターナノFCM INCFNAN30E20112368
ホスファターゼ阻害剤(PhosSTOP)ロシュ4906845001
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)ServicebioG4202
ポリフッ化ビニリデン メンブレンSolarbioISEQ00010
QC ビーズNanoFCMQS2502
RPMI-1640 基本媒体生物産業 
州KehuaトレーディングカンパニーNN-0623-1
シリカナノスフィアNanoFCMS16M-Exo
転移脱色シェーカーTS-8Kylin-BellE0018
透過型電子顕微鏡Thermo ScientificTalos L120C
TrisSolarbioT8060
TSG101抗体プロテインテック28283-1-AP
ピンセット広州Ligeテクノロジー会社LG01-105-4X
C11875500BTメス広

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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