ゼブラフィッシュの心リンパ機能研究のための心筋内注射

Summary

本プロトコルは、蛍光マイクロスフェア(MS)および量子ドット(QD)を生きた魚の心筋に効率的かつ安定的に送達することを可能にする。

Abstract

ゼブラフィッシュは、胚発生後および再生中の心血管形成および機能を研究するための重要なモデルであることが証明されています。本プロトコルは、ゼブラフィッシュの心筋に蛍光トレーサーを注入して、間質液および破片の心臓リンパ管への取り込みを研究する方法を説明しています。そのために、ミクロスフェア(直径200 nm)と量子ドット(直径< 10 nm)を生体ゼブラフィッシュの心筋に導入し、 ex vivo 共焦点顕微鏡を使用して追跡できます。次に、これらのトレーサーを数時間にわたって断続的に追跡して、心筋から心臓リンパ管へのクリアランスを追跡します。量子ドットは心臓から離れた心臓リンパ管を通って輸送されますが、より大きなマイクロスフェアは注射部位に3週間以上留まります。この心筋内注射の方法は、心臓の標的領域に局所的に細胞、タンパク質、または目的の化合物を放出するためのカプセル化されたMSまたはハイドロゲルの注射を含む、他の用途に拡張することができます。

Introduction

リンパ系は、組織と体液のバランスを維持し、損傷後の免疫応答の調節、および腸内での脂質の吸収に不可欠です¹。蓄積された証拠は、さまざまな疾患および発生状況におけるリンパ系の広範な役割を裏付けています。しかし、リンパ管は可視化しにくく、その機能が不確実なため、機構研究は妨げられています。初期のイメージング技術は、注入されたトレーサーを間質的に吸収し、リンパ管ネットワークを介して輸送するリンパ系の自然な能力に依存していました¹。この方法は、リンパ管を視覚化するために使用できるだけでなく、組織から液体や高分子を取り込みます能力を定量化するためにも使用できます。

この広大なリンパ管網は、ゼブラフィッシュの再生に不可欠な役割を果たすことが示されている心臓リンパ系も包含しています^2,3,4。異なる種間のリンパ機能の違いと類似点を理解することは、この知識を臨床的に活用するために重要です。したがって、異なるモデル生物^5,6のリンパ機能を測定および視覚化できる技術を探求する必要があります。リンパ管は^、組織7から離れて一方向に体液を輸送する鈍末の血管です。心臓組織からのリンパドレナージを観察するには、蛍光色素の心筋内注射が必要です。心筋内注射は、臨床的および前臨床の哺乳類モデルで、幹細胞や前駆細胞、またはヒドロゲルなどの外因性化合物を移植して、心筋梗塞後の心機能の改善をテストするためにも使用されています^8,9,10。ゼブラフィッシュの心筋内注射は詳細に説明されていないため、ゼブラフィッシュの心臓に対するこのような実験的アプローチの使用は限られています。

ゼブラフィッシュの心膜腔への注射と心臓の内腔内の全身血流は以前に詳細に説明されており^11,12、成体のゼブラフィッシュにおける蛍光トレーサーの心筋内注射の成功が報告されています²。本稿では、成体ゼブラフィッシュにおける心筋内注射を実施するための詳細なプロトコルを提供します。いくつかのトランスジェニックゼブラフィッシュ系統は、リンパ管を同定できます。しかし、リンパドレナージを理解するためのアプローチや、トランスジェニックマーカーがない場合のリンパ管を可視化するためのアプローチを模索する必要があります。ここでは、蛍光トレーサー、マイクロスフェア(MS)、および量子ドット(QD)を使用して、心臓リンパ管への注入部位と流体の流れを視覚化します。QDは、直径<10nmの蛍光ナノ結晶であり、その光学特性を調整し、多くの生物医学的応用に適合させることができる^13,14。QDはリンパ管に容易に取り込まれるが、間質的に注射されると血液血管系には取り込まれない^15,16。MSは、直径約200nmの蛍光被覆ポリスチレンビーズ^である15。そのため、MSはQDよりもかなり大きく、心筋に注入すると大幅に持続性が高いため、注射部位を一貫して特定できます。この方法は、心臓再生中のリンパ機能の研究に役立ちますが、コーティングされたビーズ、ハイドロゲル、または細胞調製物の安定した局所導入を使用して、心臓生物学のさまざまな側面を研究するために適用できます。

Protocol

すべての動物用処置は、ワイル・コーネル・メディスンの動物管理・使用委員会(プロトコル2020-0027)によって承認され、適切なガイドラインに従っています。以下の実験は、成体の場合は受精後14〜20か月、幼体の場合は受精後35日齢の雌のAB野生型ゼブラフィッシュで行われました。

1. 針引きと試薬調製

1. 外径1.2 mm(外径)の標準ホウケイ酸ガラスキャピラリーを、ニードルプラー(図1A、B)( 材料表を参照)を使用して、最適な設定を使用して2本の針に引っ張ります。この場合、熱525;65を引っ張ります。速度60;時間250。
2. Vortexは、MS(水中の1%固形分)およびQD(2μM、 材料の表を参照)のコロイド溶液を市販に入手しました。
   注:MSコロイド溶液は白色で、注入すると簡単に見えます。
3. 500 μLのMSストックコロイド溶液を0.45 μmシリンジフィルター( 材料表を参照)でろ過し、針の詰まりを最小限に抑えます。
4. MSのみの作業コロイド溶液を調製するには、ろ過したMSコロイド溶液100 μLを1x PBS(リン酸緩衝生理食塩水)100 μLで希釈します。
5. MSおよびQDの作業コロイド溶液を調製するには、ろ過したMSコロイド溶液100μLとQDコロイド溶液100μLを混合します。
   注:実験に応じて、MSとQDを混合または個別に注入することができます。
6. 図 1D に示すように、ステレオスコープ、ウェットスポンジ、マイクロマニピュレーター、インジェクター、20μLピペット、トリカイン溶液、ストレート虹彩切除ハサミ、鉗子、プルドニードル、マイクロローダーフェムトチップ、回収タンク、ネットなど、必要な試薬と機器を準備し、配置します( 材料の表を参照)。
7. インジェクターの空気供給をオンにし、時限注入パルスではなくゲート注入パルスを設定します。
   注:インストゥルメンタルの詳細については、 資料の表を参照してください。一部の機器では、インジェクションペダルを機器の背面にあるゲート付き入力ポートに挿入する必要があります。

2. インジェクションステーションの準備とゼブラフィッシュの準備

1. 解剖顕微鏡の電源を入れ、ピントを調整します。
2. マイクロローダーピペットチップを使用して、制御溶液(例:1x PBS中の0.05%フェノールレッド)をロードします。
3. マイクロインジェクターのニードルホルダーに針を挿入します。
4. 解剖顕微鏡下で、引っ張った針を鉗子を使用して先端から1mmで切断します。
   注:針をできるだけ細く切ることが、心筋を突き刺すのに最適です。ただし、針が細すぎると、心臓組織を貫通しようとしたときに針が曲がってしまうことがあります。
5. 適切な注入圧力を約0.50 kPa/7.3 psiに設定し、バランス圧力を約0 psiに設定して、ニードルに液体が引き込まれないようにします(図1C)。
6. 目的の圧力に達したら、注入セットアップをテストし、直径 1 mm (<0.5 μL) 未満の鉱物油に溶液のボーラスを注入するのにかかった時間を記録します。
   注:理想的には、注入で約50 nL/sで流体を放出し、5秒で約0.8mmのボーラス径を得る必要があります。針の先端径に応じて、時間と圧力を調整して、5秒の注入で1匹の魚に0.25〜0.3μLを注入することができます。注入中に高い間質組織圧を克服できるようにするためには、注入時間を長くするよりも、より高い注入圧力が望ましいです。
7. 選択した容量(例:10-15 μL、 図1B)の注射液を針にロードし、手順2.5-2.6を繰り返します。
   注:ゲート注射では、フットペダルを踏んでいる限り注射することができ、適切な組織内注射部位が見つかるまで先端位置を調整することができます。
8. 注入液をロードしたニードルをマイクロインジェクターのニードルホルダーに挿入します。

3.インジェクション

1. 真ん中に魚のような輪郭を彫って溝のあるスポンジを準備します。
2. 結晶化皿で4.2 mLの原液(4 mg / mL)を100 mLの魚施設の水( 材料の表を参照)に希釈して、トリカインの使用濃度を調製します。.
3. ゼブラフィッシュをトリカイン溶液で麻酔し、えらの動きが減少して遊泳が止まるまで麻酔します。
   注:テールをつまんで、麻酔をかけたゼブラフィッシュの応答の喪失を確認します。
4. ゼブラフィッシュの腹側を対物レンズに向けて、解剖顕微鏡下の湿らせた溝付きスポンジに置きます(図2A および 図3A)。
5. 虹彩切除ハサミを使用して、胸鰭のレベルで小さな横切開を行い、胸腔を開きます(補足ビデオ1)。
6. 鉗子を使用して、心膜をそっと剥がして心臓の頂点を露出させます(図3B)。
7. ロードされたニードルホルダーを手にして、針を体軸に対して<30°の鋭角で心室の頂点に向けます。
8. 0.1〜0.2 mmの針を心室に深く挿入しないように心臓に挿入します(図2B および 図3B)。
   注:針の先端が血液で満たされている場合は、MSとQDが心室内腔に注入されないように、針を少し引っ込めてください。.
9. 針を心臓の頂点に挿入した状態で、針先を心臓の基部に向けて動かしながら、針と体の軸の間の角度を小さくして、心室を体から少し離します(図2C および 図3C)。
   注:針は心筋壁を通してかすかに見える場合があります。
10. 針の先端が心筋表面に向かって動くように、針をさらに頭に向かって押します。
11. マイクロインジェクションデバイスのペダルを 1 ~ 5 秒間、または心臓組織内に白い斑点が見えるまで押して注入します (図 2C および 図 3C、D)。
12. 注入中に胸腔が注射液で満たされ始めた場合は、針先が心筋を完全に貫通したことを示しています(図2D)。組織内にマイクロビーズの蓄積が見えるまで、針をゆっくりと引き抜きます。
13. 液体が心室内腔に注入され、その後の心拍でクリアされる場合は、針先を再配置します(図2E)。このような状況では、針の先端を持ち上げ、注射圧力によって組織に白い斑点ができるまで針を頭の方向に押します。
14. 白い液体や斑点が見えない場合は、注射針が詰まっています。このような場合は、針を完全に引っ込めてください。実験を続けるには、針の先端を少し折るか、針を交換します。どちらの場合も、心筋を再注入する前に注入フローを確認してください。.
15. 注射が成功したら、針を心筋からゆっくりと引き抜き(図3F)、すぐにゼブラフィッシュを魚施設の水が入った回収タンクに移します。
16. 魚がトリカインから完全に回復するまで魚を監視します。
17. 回収した魚を2.8Lのタンクに移し、心臓抽出の希望の時点まで魚施設に置きます。

4.心臓の抽出とイメージング

1. 結晶化皿で4.2 mLのストック溶液(4 mg / mL)を100 mLの魚施設の水に希釈することにより、トリカインの使用濃度を調製します。.
2. ゼブラフィッシュをトリカイン溶液で終末的に麻酔し、えらの動きが止まり、反応しなくなるまで麻酔をかけます。
3. ゼブラフィッシュを、対物レンズに面した腹側に配置された解剖顕微鏡の下で湿らせた溝付きスポンジに移します。
4. 胸鰭のレベルで虹彩切除術のはさみで胸の腹壁を開きます。
5. 心嚢を開き、心臓の流出経路を見つけます。鉗子を使用して、球状動脈(BA)の前方にある大動脈をつかみ、心室の基部で慎重に引き上げます。
6. 心臓の前極を上げた状態で、腹側大動脈/静脈洞を切開して心臓を解放し、PBSを含む35mmのペトリ皿に入れます。
7. 鉗子を使用して血栓を取り除き、心臓を4%PFA(wt / vol)で15分間固定します。
8. 使用した蛍光波長を取得できる顕微鏡で心臓を画像化します。
   注:この例の日付では、405、488、567、および647レーザーラインを備えた共焦点顕微鏡を使用しました。
9. ImageJ/Fijiソフトウェア( 資料表参照)を使用して画像解析を行います。
   注:QDまたはMS濃縮の計算は、高 または低閾値 を使用して実行され、リンパ管チャネルで 選択関数を作成して 、最初にリンパ管の領域と血管信号がない領域を選択しました。次に、 Measure 関数を使用して、QDまたはMSチャネルのピクセル強度を測定し、そこから2つの選択の比率を計算しました。

Results

注射の直後に、心筋壁の小さな白い領域が見えなければなりません(図3F)。この領域は、注入されたMSおよびQDの明るい蛍光標識を示します(図4B、E)。さらに、処置後の心膜腔の任意のQDおよびMSからの心臓の外面に弱く散発的な蛍光点がある場合があります(図4B、E)。注入されたトレーサーは、時間の経過とともに追跡できます。これを行うには、魚を安楽死させ、心臓を採取し、前述の¹⁶のように共焦点顕微鏡下に置く必要がある。

MSは注射の1日後も注射部位で観察され、一部は心房と球根状動脈(BA)の外面に閉じ込められています(図4B)。MSは心筋内で3週間以上安定しており(図4C

Discussion

本稿では、ゼブラフィッシュの心筋に外因性物質を導入する方法について述べた。この技術は、QDとMSを心筋に導入して、恒常性と再生におけるリンパ機能を研究するために開発されました^2,18。同様のアプローチは、心筋梗塞後のリンパ管の存在と機能を調査するために、マウスの心筋にQDを導入するためにも使用されてきた^19,20。

心筋への針先の浸透と位置決めは、この手順の重要なステップです。ガラス毛細血管は、密集した心筋組織を貫通するのに十分な鋭さと、注射部位を配置するときに心臓を持ち上げる力で曲がらないように十分な剛性を備えている必要があります。これら2つの先端特性の最適なバランスは、鉗子で先端サイズをどれだけ縮小するかを変えることによって達成できます。鋭角注入角度は、先端を心筋壁に押し込むのに...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
結晶化皿	VWR	89000-288
剖スコープ	ツァイス	495010-0007-000魚
施設の水	N / A	N / A	RO水海塩と重炭酸ナトリウムを226uSの導電率と7.35のpHに添加
鉗子	モン	11252-20
ガラス毛細管	WPI	1B120-3	フィラメントなし
ImageJ			https://imagej.nih.gov/ij/download.html
虹彩切除術 はさみ	ファイン サイエンティフィック ツール	15000-00
マイクロインジェクター	ワーナー インスツルメンツ	64-1735
マイクロローダー フェムトチップ	エッペンドルフ	5242 956.003
マイクロピペット プーラー	Sutter Instrument	P-97	ゲートペダル入力
Microspheres	Thermo Fisher Scientific	B200	Blue
PBS	Corning	46-013-CM
量子ドット (QD)	Thermo Fisher Scientific		Q21061MP Qtracker705 血管ラベル
スポンジ	溝		付き(0.5 × 2.5 cm)
シリンジフィルター	Corning	431220
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040	濃度:4 mg/mL