このプロトコルは、接着培養システムと浮遊培養システムの両方を含む簡略化された培養条件を使用して、hiPS細胞を眼野クラスターに分化させ、神経網膜オルガノイドを生成する効率的な方法について説明しています。RPEや角膜上皮などの他の眼細胞タイプも、網膜培養の成熟眼野から単離することができます。
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方法論記事
健常および網膜疾患特異的ヒト誘起多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの作製
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
多能性幹細胞は、in vitro疾患モデリング研究や再生医療の開発に役立つ複雑な組織オルガノイドを生成することができます。このプロトコルは、網膜分化の最初の4週間から明確な自己組織化された眼野原始クラスター(EFP)の出現までの間に、付着性単層培養からなるハイブリッド培養システムで網膜オルガノイドを生成する、より簡単で堅牢かつ段階的な方法について説明しています。さらに、各EFP内のドーナツ型、円形、および半透明の神経網膜島を手作業でピックし、網膜分化培地中の非付着培養皿を使用して懸濁下で1〜2週間培養して、多層3D光学カップ(OC-1M)を生成します。これらの未熟な網膜オルガノイドには、PAX6+およびChX10+が増殖する多能性網膜前駆体が含まれています。前駆細胞はオルガノイド内で直線的に自己組織化しており、明確な放射状の縞模様として現れます。浮遊培養後4週間で、網膜前駆細胞は有糸分裂後停止および系統分化を経て、成熟網膜オルガノイド(OC-2M)を形成します。光受容体系統コミット前駆体は、網膜オルガノイドの最外層内に発達する。これらのCRX+およびRCVRN+光受容体細胞は、形態学的に成熟し、内部セグメントのような伸長を示します。この方法は、ヒト胚性幹細胞(hESC)および人工多能性幹細胞(iPSC)を用いた網膜オルガノイドの作製に採用できます。すべてのステップと手順は、再現性を確保し、基礎科学およびトランスレーショナルリサーチにおけるより広いアプリケーションのために明確に説明および実証されています。
概要
網膜は脊椎動物の目の後ろに存在する光感受性組織であり、光伝達経路として知られる生化学的現象によって光信号を神経インパルスに変換します。網膜の視細胞で生成された最初の神経インパルスは、他の網膜介在ニューロンと網膜神経節細胞(RGC)に形質導入され、脳の視覚野に到達し、画像知覚と視覚反応に役立ちます。
世界保健機関(WHO)によると、推定150万人の子供が失明しており、そのうち100万人がアジアにいます。遺伝性網膜ジストロフィー(IRD)は、世界中の4,000人に1人が罹患する主要な失明性疾患ですが1,2,3、加齢黄斑変性症(AMD)に関連する失明の有病率は、発展途上国では0.6%〜1.1%の範囲です4。IRDは、網膜の発生と機能に関与する300以上の異なる遺伝子の遺伝性遺伝的欠陥によって引き起こされます5。このような遺伝的変化は、正常な網膜機能の破壊と網膜細胞、すなわち光受容体細胞と網膜色素上皮(RPE)の段階的な変性をもたらし、したがって重度の視力喪失と失明につながります。角膜、水晶体などを含む他の失明状態では大きな進歩が見られました。しかし、網膜ジストロフィーと視神経萎縮症は、これまでに証明され....
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プロトコル
hiPS細胞を含むすべての実験は、標準的な実験室慣行、倫理的およびバイオセーフティガイドラインに準拠し、施設内倫理委員会(IEC)、幹細胞研究のための施設内委員会(IC-SCR)、および機関バイオセーフティ委員会(IBSC)などの規制機関の承認を得て、無菌的に実施されました。
1. iPS細胞培養液、網膜分化培地及び試薬の調製
- iPS細胞培養および維持培地
- マトリゲルコーティング(基底膜マトリックスコーティング;材料の表参照)培養プレート上で、正常なhiPSCライン23(hiPSC-F2-3F1)およびCRISPR編集したRB1-/-hiPSCライン(LVIP15-RB1-CS3、バイアレリック、ヒトRB1遺伝子のエクソン18内の10bpのフレームシフト欠失を伴う)をフィーダーフリー培養条件下で培養および維持する。
注:このプロトコルは、基底膜マトリックスを組換えビトロネクチン(VTN-N)コーティングに置き換えることで、完全にゼノフリーにすることができます。50xエッセンシャル8サプリメント(エッセンシャル8培地キットに付属、 材料の表を参照)と100 U / mLペニシリン-ストレプトマイシン溶液を加えて、完全なエッセンシャル8培地を準備します。あるいは、完全なm....
- マトリゲルコーティング(基底膜マトリックスコーティング;材料の表参照)培養プレート上で、正常なhiPSCライン23(hiPSC-F2-3F1)およびCRISPR編集したRB1-/-hiPSCライン(LVIP15-RB1-CS3、バイアレリック、ヒトRB1遺伝子のエクソン18内の10bpのフレームシフト欠失を伴う)をフィーダーフリー培養条件下で培養および維持する。
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結果
hiPS細胞の眼系統への分化は、図1に示すように、サプリメントと成長因子を含む培養培地の異なるカクテル中で細胞を異なる時点で順次培養することによって達成されます。このhiPSC培養物は、多能性幹細胞維持培地であるエッセンシャル8培地で維持される。70%〜80%のコンフルエンシーに達したら(図2A)、培地は0日目に分化誘導培地(DIM)に交換されます(ステップ3.2を参照)1 ng / mL bFGF、1 ng / mLノギン、および1%N2サプリメント。神経誘導N2サプリメントとともに、BMPシグナル伝達阻害剤であるNogginは、中胚葉および内胚葉の関与をブロックすることにより、細胞を神経外胚葉系譜に向ける上で重要な役割を果たします。1日目、2日目、および3日目に、Nogginの濃度が10 ng / mLに増加します(ステップ3.3および3.4を参照)。4日目から、DIMを網膜分化培地(RDM)に交換し(ステップ3.5)、培養液を.......
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ディスカッション
hiPS細胞は、in vitroで臓器や組織の発達を研究するための強力なツールです。健康なhiPS細胞と疾患特異的なhiPS細胞を網膜系統に分化させることによって疾患表現型を再現することは、さまざまな形態の遺伝性網膜ジストロフィーの病態生理学に関する新しい洞察を得るのに役立ちます。PSCの網膜細胞型へのインビトロ分化のために、いくつかのプロトコルが記載され、採用されている。それらのほとんどは、組換え成長因子、サプリメント、小分子、およびN1、N2、およびB27サプリメントなどの試薬の複雑なカクテルを含む培養培地の使用を含みます。ノギン、SB431542、LDN193189、フォリスタチンなどのBMPおよびTGFβシグナル伝達遮断薬、またはアクチビンA、レフティ、IDE1などの誘導物質。DKK1、SFRP、IWP-2、IWR-1-endoなどの標準的なWntシグナル伝達遮断薬、またはCHIR99021、SB216763、CKI-7などの誘導物質。PD0325901およびPD173074などのFGF受容体シグナル伝達遮断薬、またはbFGFなどの誘導物質;DAPTなどのノッチシグナル伝達阻害剤;インスリン様.......
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開示事項
すべての著者には、利益相反や財務開示はありません。
謝辞
著者らは、遺伝学者のチトラ・カンナビラン博士からの科学的および技術的支援を認めています。スバドラ・ジャラリ博士、網膜コンサルタント;ミリンド・ナイク博士、眼球形成外科医;ハイデラバードのLVプラサド眼科研究所の眼腫瘍医であるスワティカリキ博士は、正常および患者固有のiPS細胞株の生成に向けて取り組んでいます。著者らは、科学技術省(IM)、(SB/SO/HS/177/2013)、バイオテクノロジー省(IM)、(BT/PR32404/MED/30/2136/2019)、およびインド政府のICMR(S.M.、D.P.)、UGC(T.A.)、CSIR(V.K.P.)の上級研究員からのR&D助成金を認める。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.22 以上m シリンジフィルター | TPP | 99722 | |
| 15 mL 遠心分離チューブ | TPP | 91015 | |
| 50 mL 遠心分離チューブ | TPP | 91050 | |
| 6 ウェルプレート | TPP | 92006 | |
| 抗 Chx10 抗体;マウスモノクローナル | Santa Cruz | SC365519 | 1:50 |
| 抗CRX抗体;ウサギモノクローナル | Abcam ab140603 | 1:300 | |
| 抗MiTF抗体、マウスモノクローナル | Abcam | ab3201 | 1:250 |
| 抗回復抗体;ウサギのポリクローナル | Millipore | AB5585 | 1:300 |
| B-27サプリメント(50倍)、無血清 | サーモフィッシャー | 17504044 | |
| 塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF) | Sigma Aldrich | F0291 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Coplin Jar(50 mL) | Tarson | ||
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | ||
| CryoTubes | Thermo Fisher | V7884 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (基礎培地) | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| DreamTaq DNA polymerase | Thermo Fisher | EP0709 | |
| Dulbeco's リン酸緩衝生理食塩水 | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Essential 8 中型キット | Thermo Fisher | A1517001 | |
| エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物 (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Falcon Not TC-treated Treated Pedri Dish, 60 mm | コーニング351007 | ||
| フェタル ウシ 血清、認定済み、米国 | Gibco | 26140079 | |
| GelDocXR+ と Image ラボ ソフトウェア | BIO-RAD | Agarose Gel ドキュメンテーション システム | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1:300 希釈 |
| ヤギ抗マウス IgG (H+L), Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11030 | 1:300 希釈 |
| ヤギ抗ウサギ IgG (H+L), Alexa Fluo 546 | Invitrogen | A11035 | 1:300 希釈 |
| ヤギ抗ウサギ IgG (H+L),Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1:300 希釈 |
| HistoCore MULTICUT | Leica | 切片化ノ | |
| ックアウト用 血清 補充 | サーモフィッシャー | 10828028 | |
| L-Acsorビン酸 | Sigma Aldrich | A92902 | |
| MEM 非必須アミノ酸溶液 (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| N2サプリメント (100個) | Thermo Fisher | 17502048 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher | To quantify RNA | |
| Paraformaldehyde | Qualigens | 23995 | |
| Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged | Corning | 7095D-9 | |
| Penicillin-Streptomycin | サーモフィ | ッシャー15140-122 | |
| 組換え抗Otx2抗体、ウサギモノクローナル | Abcam | ab183951 | 1:300希釈 |
| 組換え抗PAX6抗体;ウサギモノクローナル | Abcam | ab195045 | 1:300 |
| 組換え抗RPE65抗体、ウサギモノクローナル | Abcam | ab231782 | 1:300 |
| 組換えヒトNogginタンパク質 | R&D Systems | 6057-NG | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| 血清ピペット 10 mL | TPP | 94010 | |
| 血清ピペット 5 mL | TPP | 94005 | |
| 塩化ナトリウム | Sigma Aldrich | S7653 | |
| クエン酸ナトリウム三塩基性二水和物 | Sigma Aldrich | S4641 | |
| スターフロスト (シランコーティング) 顕微鏡スライド | Knittel | ||
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18080051 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| TRIzol 試薬 | Invitrogen | 15596026 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | ベクター研究所 | H-1200 | |
| ビトロネクチン | サーモフィッシャー | A27940 | |
| Y-27632 二塩酸塩(Rhoキナーゼ阻害剤) | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Zeiss LSM 880 | Zeiss | 共焦点顕微鏡 |
参考文献
- Dandona, R., et al. Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study. British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
- Sen....
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