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方法論記事

健常および網膜疾患特異的ヒト誘起多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの作製

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DOI：

10.3791/64509

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2022年12月9日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Ocular Regeneration, Prof. Brien Holden Eye Research Centre, LV Prasad Eye Institute, 2Manipal Academy of Higher Education, 3Schepens Eye Research Institute, Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、接着培養システムと浮遊培養システムの両方を含む簡略化された培養条件を使用して、hiPS細胞を眼野クラスターに分化させ、神経網膜オルガノイドを生成する効率的な方法について説明しています。RPEや角膜上皮などの他の眼細胞タイプも、網膜培養の成熟眼野から単離することができます。

要約

多能性幹細胞は、in vitro疾患モデリング研究や再生医療の開発に役立つ複雑な組織オルガノイドを生成することができます。このプロトコルは、網膜分化の最初の4週間から明確な自己組織化された眼野原始クラスター(EFP)の出現までの間に、付着性単層培養からなるハイブリッド培養システムで網膜オルガノイドを生成する、より簡単で堅牢かつ段階的な方法について説明しています。さらに、各EFP内のドーナツ型、円形、および半透明の神経網膜島を手作業でピックし、網膜分化培地中の非付着培養皿を使用して懸濁下で1〜2週間培養して、多層3D光学カップ(OC-1M)を生成します。これらの未熟な網膜オルガノイドには、PAX6+およびChX10+が増殖する多能性網膜前駆体が含まれています。前駆細胞はオルガノイド内で直線的に自己組織化しており、明確な放射状の縞模様として現れます。浮遊培養後4週間で、網膜前駆細胞は有糸分裂後停止および系統分化を経て、成熟網膜オルガノイド(OC-2M)を形成します。光受容体系統コミット前駆体は、網膜オルガノイドの最外層内に発達する。これらのCRX+およびRCVRN+光受容体細胞は、形態学的に成熟し、内部セグメントのような伸長を示します。この方法は、ヒト胚性幹細胞(hESC)および人工多能性幹細胞(iPSC)を用いた網膜オルガノイドの作製に採用できます。すべてのステップと手順は、再現性を確保し、基礎科学およびトランスレーショナルリサーチにおけるより広いアプリケーションのために明確に説明および実証されています。

概要

網膜は脊椎動物の目の後ろに存在する光感受性組織であり、光伝達経路として知られる生化学的現象によって光信号を神経インパルスに変換します。網膜の視細胞で生成された最初の神経インパルスは、他の網膜介在ニューロンと網膜神経節細胞(RGC)に形質導入され、脳の視覚野に到達し、画像知覚と視覚反応に役立ちます。

世界保健機関(WHO)によると、推定150万人の子供が失明しており、そのうち100万人がアジアにいます。遺伝性網膜ジストロフィー(IRD)は、世界中の4,000人に1人が罹患する主要な失明性疾患ですが1,2,3、加齢黄斑変性症(AMD)に関連する失明の有病率は、発展途上国では0.6%〜1.1%の範囲です4。IRDは、網膜の発生と機能に関与する300以上の異なる遺伝子の遺伝性遺伝的欠陥によって引き起こされます5。このような遺伝的変化は、正常な網膜機能の破壊と網膜細胞、すなわち光受容体細胞と網膜色素上皮(RPE)の段階的な変性をもたらし、したがって重度の視力喪失と失明につながります。角膜、水晶体などを含む他の失明状態では大きな進歩が見られました。しかし、網膜ジストロフィーと視神経萎縮症は、これまでに証明された治療法を持っていません。成人のヒト網膜には幹細胞がないため6、胚性幹細胞(ESC)や患者由来の人工多能性幹細胞(iPSC)などの代替ソースは、目的の細胞タイプを無制限に供給でき、in vitro疾患モデリング研究や再生療法の開発に必要な複雑な組織オルガノイドの開発に大きな期待を寄せています7。8,9,10。

数年の網膜研究により、初期の網膜発生を調整する分子イベントの理解が深まりました。PSCから網膜細胞と3Dオルガノイドを生成するためのほとんどのプロトコルは、成長因子と低分子の複雑なカクテルで細胞を培養して既知の生物学的プロセスを段階的に調節することにより、これらの発生イベントをin vitroで再現することを目的としています。このようにして生成された網膜オルガノイドは、主要な網膜細胞、すなわち網膜神経節細胞(RGC)、介在ニューロン、光受容体、および網膜色素性上皮(RPE)で構成されています11,12,13,14,15,16,17,18,19.網膜オルガノイドを用いたIRDのモデリングは成功しているが、分化中の成長因子と低分子の複雑なカクテルの必要性と網膜オルガノイド生成の比較的低い効率は、ほとんどのプロトコルで大きな課題となっている。それらは主に胚様体の形成とそれに続くin vitro発生の異なる段階での複雑な培養条件を使用した網膜系統への段階的な分化を含む20,21,22。

ここでは、健常対照および網膜疾患特異的なhiPS細胞から複雑な3D神経-網膜オルガノイドを開発するための簡単で堅牢な方法が報告されています。ここで説明するプロトコルは、胚様体形成を必要とせずに、ほぼコンフルエントなhiPS細胞培養物の直接分化を利用します。また、培地の複雑さが簡素化され、新しい研究者が簡単に採用できる費用対効果と再現性の高い技術になります。これには、網膜分化の最初の4週間から明確な自己組織化された眼野原始クラスター(EFP)の出現までの付着性単層培養からなるハイブリッド培養システムが含まれます。さらに、各EFP内の円形の神経網膜島を手動でピックし、浮遊培養で1〜2週間増殖させて、PAX6+およびCHX10+増殖神経網膜前駆体からなる多層3D網膜カップまたはオルガノイドを調製します。100 μMタウリン含有培地中での網膜オルガノイドをさらに4週間延長培養すると、RCVRN+およびCRX+光受容体前駆体と、初歩的な内部セグメントのような伸長を有する成熟細胞が出現しました。

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プロトコル

hiPS細胞を含むすべての実験は、標準的な実験室慣行、倫理的およびバイオセーフティガイドラインに準拠し、施設内倫理委員会(IEC)、幹細胞研究のための施設内委員会(IC-SCR)、および機関バイオセーフティ委員会(IBSC)などの規制機関の承認を得て、無菌的に実施されました。

1. iPS細胞培養液、網膜分化培地及び試薬の調製

  1. iPS細胞培養および維持培地
    1. マトリゲルコーティング(基底膜マトリックスコーティング;材料の表参照)培養プレート上で、正常なhiPSCライン23(hiPSC-F2-3F1)およびCRISPR編集したRB1-/-hiPSCライン(LVIP15-RB1-CS3、バイアレリック、ヒトRB1遺伝子のエクソン18内の10bpのフレームシフト欠失を伴う)をフィーダーフリー培養条件下で培養および維持する。
      注:このプロトコルは、基底膜マトリックスを組換えビトロネクチン(VTN-N)コーティングに置き換えることで、完全にゼノフリーにすることができます。50xエッセンシャル8サプリメント(エッセンシャル8培地キットに付属、 材料の表を参照)と100 U / mLペニシリン-ストレプトマイシン溶液を加えて、完全なエッセンシャル8培地を準備します。あるいは、完全なmTeSR1培地を用いてヒプシア細胞を培養することもできます。
  2. 細胞解離溶液(1x CDS)
    1. ヒトiPS細胞の酵素フリー解離および継代のために、1xダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)中に0.5 mM EDTA、pH 8.0、および30 mM NaClを含むCDSを調製します(材料の表を参照)。
    2. 1x DPBSの99 mLに100 mLの0.5M EDTAと1 mLの3 M NaClストック溶液を加え、よく混合し、0.22 μmフィルターを使用してフィルター滅菌します。
  3. 分化誘導培地(DIM)
    1. 10%ノックアウト血清置換(KOSR)、1x非必須アミノ酸(NEAA)、2 mMグルタマックス、100 U / mLペニシリン-ストレプトマイシン、200 μM L-アスコルビン酸、および1%N2サプリメントを添加したDMEM-F12基礎培地を使用してDIMを調製します(材料の表を参照)。
  4. 網膜分化培地(RDM)
    1. 10%ノックアウト血清(KOSR)、1x非必須アミノ酸(NEAA)、2 mMグルタマックス、100 U / mLペニシリン-ストレプトマイシン、200 μM L-アスコルビン酸、および2%B27サプリメント(ビタミンAを含む)を添加したDMEM-F12基礎培地を使用してRDMを調製します( 材料の表を参照)。
  5. 細胞外マトリックスコーティングされた細胞培養表面
    1. hESC認定の基底膜マトリックスをアイスバケットで一晩解凍し、できれば4〜8°Cの冷蔵庫内で解凍します。 解凍した100倍マトリックスストック(5 mL)を氷冷したDMEM-F12基礎培地20 mLを加えて1:5の比率で希釈し、穏やかに旋回させて混合し、20倍のストック溶液を調製します。
      1. 事前に冷却したピペットチップと滅菌マイクロ遠心チューブを使用して、氷上で0.5 mLアリコートを調製します。バイアルに20倍のストックとしてラベルを付け、-80°Cの冷凍庫で最大6か月間冷凍して保管します。
    2. 細胞培養表面(培養皿または6ウェルプレート)をコーティングするには、氷上で20xマトリックスのアリコートを解凍し、氷冷DMEM-F12基礎培地を使用して1:20の比率で希釈して、100 mmディッシュまたは6ウェルプレート(1.5 mL/ウェル)をコーティングするのに十分な1xマトリックスコーティング溶液10 mLを調製します。
      注意: マトリックス溶液を取り扱う前に、氷冷および滅菌DPBSを吸引して、ピペット/マイクロチップをプレチルします。マトリックスの解凍とすべての取り扱いは、室温での重合とゲル化を避けるために、事前に冷却されたピペット/マイクロチップを使用して、氷上で行う必要があります。
    3. 1.5 mLの1xマトリックスコーティング溶液を6ウェルプレートの各ウェルに加え、プレートを穏やかに回転させて均一なコーティングを確保し、5%CO2 インキュベーター内でプレートを37°Cでインキュベートします。プレートを乱さずに最低1時間放置し、培養表面にマトリックスを均一にコーティングします。
    4. 細胞を播種する前に、5 mLの滅菌ピペットを使用してコーティング溶液を吸引し、廃液を廃棄します。すぐに新鮮な培養培地(6ウェルプレートの2 mL /ウェル)を追加し、150,000〜200,000細胞/ウェルの密度で細胞を播種します。取り扱い中はプレートを乾かさないでください。
      注:または、最終濃度0.5 μg/mLの組換えビトロネクチン(VTN-N)コーティングをゼノフリー培養プロトコルに使用できます。

2. ヒトiPS細胞培養の確立

  1. ヒジプロニクスの解凍と復活
    1. 6ウェルプレートの1ウェルを1xメンブレンマトリックス溶液でコーティングします。37°Cで1時間インキュベートして、培養表面の重合と均一なコーティングを可能にします。
    2. 1時間のインキュベーション後、コーティング溶液を取り出し、細胞を復活させる前に、10 μMのRho-キナーゼ阻害剤Y-27632(1 μL/mLの10 mMストック; 材料の表を参照)を含む1 mLの予熱した完全なエッセンシャル8培地を追加します。
    3. 液体窒素容器からhiPSCクライオバイアルストック(1 x 106 セル/バイアル)を取り出します。クライオバイアルを37°Cの水浴中で、穏やかに旋回しながら素早く解凍します。
      注意: バイアルを完全に解凍しないでください。通過番号を書き留め、バイアルを表面滅菌し、70%イソプロピルアルコールを含む糸くずの出ない綿棒を使用して拭いて乾かします。
    4. 滅菌済みの1 mLピペットチップを使用して、Y-27632を含まない2 mLの予熱された完全エッセンシャル8培地からなる新しい15 mLチューブにクライオバイアル内容物を吸引します。チューブを1,000 x g で室温で4分間遠心分離します。上澄み液を捨てる。
    5. 細胞ペレットを、10 μM Y-27632を含む1.0 mLの完全なエッセンシャル8培地に再懸濁します。
    6. このセル懸濁液を、壁に沿って分注することにより、マトリックスを乱すことなく、マトリックスコーティングされた表面に追加します。プレートを横方向に穏やかに揺り動かして、細胞の均一な分布を確保します。
    7. プレートを5%CO2 インキュベーター内で37°Cでインキュベートし、細胞が接着して増殖を開始できるようにします。
    8. 12〜24時間後、使用済み培地を交換し、Y-27632を含まない予熱した完全なエッセンシャル8培地で培養物を維持します。
    9. 培養液を24時間ごとに交換し、70%〜80%のコンフルエントに達したら培養液を継代します。
      注:hiPSC培養では、1:6の分割比が日常的に行われ、3〜4日の定期的な間隔で継代されます。
  2. 網膜系譜分化を開始するためのhiPS細胞の継代およびプレーティング
    1. 使用済み培地を6ウェルプレート中の70%〜80%コンフルエントなヒトiPS細胞培養から吸引します。
    2. 各ウェルに1 mLのCDSを加え(ステップ1.2)、細胞が丸くなるまで37°Cで5〜7分間インキュベートします。細胞が剥離しないように注意しながらCDSを慎重に取り出し、新鮮なエッセンシャル8培地2 mLを加え、ピペットを使用して穏やかに粉砕します。
    3. 6細胞プレートの1ウェルから細胞懸濁液を15 mL遠沈管に回収し、チューブを1,000 x g で室温で4分間回転させます。上澄み液を捨てる。
    4. ステップ1.5の説明に従って、細胞ペレットを1.2 mLのエッセンシャル8培地に再懸濁し、10 μM Y-27632を含む1.5 mLのiPS細胞培養液を含むマトリックスコーティング6ウェルプレートの各ウェルに200 μLの細胞懸濁液200 μL(1:6分割比)を分注します。
    5. 12〜24時間後、使用済み培地を交換し、Y-27632を含まない予熱した完全なエッセンシャル8培地で培養物を維持します。
    6. 培養液が70%〜80%のコンフルエントに達するまで、24時間ごとに培地を交換します。

3. hiPS細胞の眼野と網膜系譜への分化

注:差別化プロセスの概略図 を図1に示します。

  1. hiPSC培養が70%〜80%のコンフルエントに達したら、分化手順を開始します。
  2. 0日目に、hiPSC維持培地を1 ng / mL bFGFと1 ng / mLノギンを含むDIMに変更します(ステップ1.3)。6ウェルプレートのウェルあたり2.0 mLの培地を加え、5%CO2 インキュベーター内で細胞を37°Cに維持します。
    注:bFGFの段階的な離脱はPSCの分化を誘導し、初期段階でノギン(いくつかのBMPの阻害剤)の濃度の増加を加えると、外胚葉系譜の分化と神経化が誘導され11,12、中胚葉と内胚葉の関与がブロックされます。あるいは、ノギンをLDN193189に置き換えることもできます。以前に報告された二重SMAD阻害戦略とは異なり20,21、このプロトコルはアクチビンまたはSB-431542の追加を必要としません。
  3. 1日目に、使用済み培地を交換し、1 ng / mL bFGFと10 ng / mLノギンを含むDIMを追加します。6ウェルプレートのウェルあたり2.0 mLを追加します。細胞をインキュベートし、5%CO2 インキュベーター内で37°Cに維持する。
  4. 2〜3日目に、使用済みの培地を取り出し、10 ng / mLのノギンのみを含むDIMを追加します。6ウェルプレートのウェルあたり2.0 mLを追加し、24時間ごとに培地を交換します。細胞をインキュベートし、5%CO2 インキュベーター内で37°Cに維持する。
    注:使用前に、必ず培地を30〜37°Cに予熱してください。過剰な浮遊物および死細胞は、早期分化培養において観察され得る。このような条件下で、培養物を1x DPBSで1回洗浄し、網膜分化培地を追加します。使用済み培地の無菌試験は、毎週または必要に応じて行うことができます。
  5. 4日目に、使用済みの培地を取り出し、RDMを追加します(ステップ1.4)。6ウェルプレートのウェルあたり2.0 mLを加え、毎日新鮮な培地を交換しながら、5%CO2 インキュベーター内で37°CのRDMで培養を維持します。
    注:または、PSCを浮遊培養として1〜3日目から、非接着性および丸底の96ウェルプレートで、5 x 103 細胞/100 μL /ウェルの細胞密度で増殖させ、DIMで同一の培養条件下で胚様体(EB)を形成することもできます。 4日目の整形式のEBは、RDMを含むマトリックスコーティングプレートにプレーティングし、接着させることができます。 増殖し、以下のように分化する。
  6. 14〜18日目頃に、初期の眼野前駆細胞からなる神経ロゼット様ドメインの出現について、10倍の倍率で顕微鏡下で培養を観察します(図2B)。
  7. 約21〜28日目(3〜4週間)に、顕微鏡下で4倍および10倍の倍率で培養を観察し、神経上皮と眼表面上皮の連続した成長に囲まれた円形の3D神経網膜構造の中央島を持つ、自己組織化された明確なEFPの出現を観察します(図2C、D)。
    注:通常のhiPSC網膜分化培養の6ウェルプレートのウェルあたり約20〜30個のEFPを観察できます。この数は、他の疾患特異的なhiPSC株と、その遺伝的背景および網膜系譜分化能に基づいて変化し得る。

4. 網膜オルガノイドの採取

  1. 網膜カップの手動ピッキングのためのガラスパスツールピペットの火炎引き。
    注:オートクレーブ滅菌ガラスパスツールピペットを使用して、視野ピッキングを行います。
    1. ブンゼンバーナーのスイッチを入れます。滅菌パスツールピペットを取り、片手でベースを持ち、もう片方の手でキャピラリーチップを持ちます。毛細管先端の中央付近の領域を、ガラスが柔軟になるまで回転運動で火炎滅菌して加熱します。次に、炎から離れてすばやく外側に引っ張って、閉じた内腔を持つ細かい毛細管先端を作成します。
    2. 細い先端を炎の前で水平に持ち、外側にすばやく炎に通して、滑らかなフックまたはL字型の毛細管先端を作成します。
    3. キャピラリーフックの滑らかな外側曲率ゾーンを細かいスクープとして使用して、無傷の神経網膜カップをEFPクラスターから静かに持ち上げて取り外します。
      注:ガラスキャピラリーフックの滑らかな角度は、細胞に損傷を与えたり、培養表面に傷を付けたりすることはありません。このシンプルなツールは、個々のhiPSCコロニーをグリッドパターンで分割したり、クローン増殖中に小細胞クラスターとして継代したりするためにも効果的に使用できます。
  2. 3D網膜オルガノイドを生成するための網膜カップの培養と維持。
    1. 25〜30日目に、神経網膜カップの収穫の準備をする前に、4.0 mLの予熱した網膜分化培地を低付着性60 mmディッシュに追加します。
    2. 0.63倍から4.5倍の倍率の実体顕微鏡下で作業し、個々のEFPから整形式の神経網膜カップを観察し、手動で選択します。
      注:色素性RPE細胞の成長の出現は、EFPおよび中央に配置された神経網膜カップの容易な識別に役立ちます。網膜カップは、CNSニューロンまたは神経堤細胞23によって形成される密集した球状または不規則なクラスターとは対照的に、直線的に配置され自己組織化された網膜幹細胞によって形成される明確な放射状の縞模様を有するドーナツ型、円形、および半透明の3D構造として現れる。
    3. 炎で引っ張られた牧草ピペットフックを使用して、個々のEFP内の中央神経網膜島を優しく動かしてすくい取ります。
    4. 1 mLマイクロピペットをセットして100 μLを吸引し、広いボア開口部を持つ1 mLマイクロチップを使用して、浮遊網膜カップを吸引し、ステップ4.2.1で調製した新鮮で低接着性の培養皿に移します。
      注意: ボアサイズが小さく、吸引圧力が高いチップを使用すると、せん断が発生し、網膜カップの完全性に影響を与える可能性があります。網膜カップのおおよその寸法は直径約1〜2mmである。
    5. 網膜カップを非接着性浮遊培養物としてRDMに維持し、5%CO2 インキュベーター内で37°Cでインキュベートします。
    6. 30〜45日目:皿をそっと傾け、網膜カップを約30秒間落ち着かせて、培地を毎日交換します。部分的な供給方法に従い、使用済み培地の半分の量を取り除き、等量の新鮮な培地と交換します。
      注意: 網膜カップの損傷を防ぐために、繰り返しの吸引と移動は避けてください。浮遊培養の1〜2週間後、網膜カップのサイズはわずかに大きくなり(1〜3 mm)、PAX6およびCHX10を発現する線形に配置された初期神経網膜前駆細胞からなる自己組織化3D網膜オルガノイド(OC-1M)に成長します(図3Bi)。
    7. 45〜60日目:100 μMタウリンを含むRDMでさらに4週間網膜オルガノイドを培養します( 材料の表を参照)神経網膜前駆細胞のより良い生存と系統分化、および成熟網膜細胞型(OC-2M)の開発をサポートします。
      注:EFPから選択された網膜または視神経カップの約70%〜80%は無傷のままであり、それらの積層を保持し、4週間の浮遊培養(OC-2M)後に成熟網膜オルガノイドに成長します。
    8. 浮遊培養4週間の成熟網膜オルガノイドが、RCVRN+およびCRX+光受容体前駆体の出現を示し、最も外側の細胞層に初歩的な内部セグメントのような伸長を有する成熟細胞が出現し、 in vitroで 正常な網膜の発達および成熟プロセスを再現することを確認しました(図3Bii)。
      注:神経網膜カップを除去した後、分化培養はRDMで継続的に維持できます。神経網膜を取り囲む近位上皮増殖には、網膜色素性上皮(RPE)細胞前駆体が含まれており、これらはさらに膨張して成熟し、典型的な石畳形態の色素性RPE単層を形成します(図4)。遠位成長は主に、水晶体および角膜上皮に寄与する眼表面上皮からなる。 EFP増殖の異なるゾーンから所望の細胞タイプを回収し、さらに濃縮して純粋な培養を確立することができます。

5. 網膜オルガノイドの特性評価

  1. 形態学的および分子的特性評価
    1. 付着EFPと浮遊網膜オルガノイドを位相差顕微鏡で4倍および10倍の倍率で観察し、それらの形態と寸法を文書化します。
    2. 成熟のさまざまな段階(ステップ4.2.3-4.2.6)で約20個の網膜オルガノイドを、広口径1,000 μLのチップを使用して1.5 mLのマイクロ遠心チューブに収集します。オルガノイドを底部に定着させ、培地を吸引します。1x PBSでカップを洗います。
    3. 余分なPBSを取り除き、1.0 mLのTRIzol試薬を加えます(材料表を参照)。室温で5分間インキュベートします。チューブ乳棒を使用して組織を均質化し、1.0 mLピペットを使用して粉砕します。
    4. 製造元の指示に従って、RNAの単離および精製の標準的な試薬方法に従って、トータルRNAを調製します(材料の表を参照)。
    5. アガロースゲルのRNA品質を確認し、NanoDrop分光光度計を使用して定量します(材料の表を参照)。
    6. 製造元の指示に従って、逆転写酵素を使用して1〜2μgの総RNAをcDNAに変換します( 材料の表を参照)。遺伝子特異的プライマーのリストについては 表1 を参照されたい。
    7. 簡単に説明すると、 表2 に記載されているように、全量10 μLのRNAプライマーマスターミックスを調製し、サーマルサイクラーでチューブを65°Cで5分間インキュベートします。チューブをサーマルサイクラーから氷に2分間移します。
    8. 一方、 表3に記載の試薬を用いてマスターミックス2を調製する。このマスターミックスをステップ5.1.7で準備したRNA-プライマーミックスチューブに加えます。穏やかに混ぜる。
    9. サンプルを50°Cで50分間インキュベートし、次に85°Cで5分間インキュベートし、4°Cで保持して反応を停止します。
    10. 合成したcDNAをPCR反応のテンプレートとして使用して、神経網膜前駆細胞および成熟網膜細胞マーカーの発現を確認します。
    11. hE1fαやGAPDHなどのハウスキーピング遺伝子を用いた半定量的PCRにより、各サンプル、すなわちF2-UD(hiPSC-F2-3F1;未分化細胞)、OC-1M(浮遊培養では1週間齢の光学カップ)、OC-2M(浮遊培養では4週齢の光学カップ)の総cDNAテンプレートを正規化します。
    12. 表4に記載されているように、半定量PCR用のマスターミックスを準備し、増幅用のテストサンプルチューブをサーマルサイクラーに入れます。PCR増幅条件を表5に記載した。
  2. 組織学と免疫組織化学
    1. 光学カップを2.0 mLの微量遠心チューブに集め、余分な培地を吸引します(ステップ4.2.3-4.2.6)。オルガノイドを1x PBSですすぎ、洗浄して500 μLの4%パラホルムアルデヒドに懸濁し、室温で一晩固定します。
    2. 翌日、カップを脱イオン水で洗います。カップを95%アルコール(3回の交換、それぞれ15〜20分)、続いて100%アルコール(3回の交換、各15〜20分)、無水アルコールとキシレンの1:1の混合を15分間、キシレン(2回の交換、それぞれ15分)、およびパラフィン(3回の交換、各15分)。この組織を埋め込み、標準的な手順に従ってパラフィンブロックを調製します。冷まして固めます。
    3. ミクロトームを使用して薄い切片(~4-5 μmの厚さ)を準備し、標準的な組織学手順に従ってシランコーティングされた顕微鏡スライド( 材料の表を参照)に置きます。
    4. 脱パラフィンの場合は、スライドを加熱ブロック上で70°Cで15〜20分間加熱します。ワックスが溶けたら、スライドをキシレン(3回交換、それぞれ3〜4分)で洗い、パラフィンを完全に取り除きます。
      注:パラフィンの除去が不完全な場合、大量のバックグラウンドノイズを伴う切片の染色不良/斑状になります。
    5. 異なる割合のエタノール(100%、90%、80%)をそれぞれ3分間使用して、スライドを再水和します。スライドを蒸留水ですすぎ、抗原回収に進みます。
    6. 抗原賦活化を開始する前に、クエン酸塩バッファー(pH 6.0)を電子レンジを使用してコプリンジャー( 材料の表を参照)で95〜100°Cに達するまで予熱します。
    7. スライドを予熱したクエン酸塩バッファーに浸し、電子レンジでジャーを15分間加熱します。コプリンジャーをオーブンから取り出し、室温で冷まします。
    8. メタノールと過酸化水素の1:1混合物を5分間加え、続いて1x PBSで切片を3回洗浄することにより、内因性ペルオキシダーゼの切片をブロックします。
    9. 0.5%Triton-X 100を使用して15分間切片を透過処理します。スライドを1x PBSで3回洗浄します。
    10. 切片を1x PBS中の10%ウシ胎児血清(FBS)で1時間インキュベートすることにより、一次抗体の非特異的結合をブロックします。
    11. 切片を一次抗体とともに室温で1時間、または4°Cで一晩インキュベートします。 スライドを1x PBSで3〜5分間3回洗浄して、結合していない抗体を除去します。
    12. 適切な蛍光色素結合二次抗体を添加し、45分間インキュベートします。スライドを1x PBSでそれぞれ3〜5分間3回洗浄します。
      注:抗体とそれぞれの希釈液は、 材料表に記載されています。網膜オルガノイド切片は、PAX6およびCHX10を使用して免疫標識され、初期の神経網膜前駆細胞を検出し、RecoverinおよびCRXを使用してコミットされた網膜および光受容体前駆細胞を検出しました。同様に、RPE前駆体の検出には抗PAX6および抗MITFを使用し、2D単層培養の免疫細胞化学による色素性成熟RPE細胞の検出には抗CRALBPおよび抗RPE65を使用しました。
    13. DAPIまたはPIで切片を対比染色し、退色防止封入剤を使用してスライドガラスに取り付けます(材料表を参照)。
    14. 蛍光または共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して、網膜オルガノイドおよびRPE培養の免疫標識切片を画像化および文書化し、さまざまな網膜マーカーを発現するさまざまな細胞層を調べます。

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結果

hiPS細胞の眼系統への分化は、図1に示すように、サプリメントと成長因子を含む培養培地の異なるカクテル中で細胞を異なる時点で順次培養することによって達成されます。このhiPSC培養物は、多能性幹細胞維持培地であるエッセンシャル8培地で維持される。70%〜80%のコンフルエンシーに達したら(図2A)、培地は0日目に分化誘導培地(DIM)に交換されます(ステップ3.2を参照)1 ng / mL bFGF、1 ng / mLノギン、および1%N2サプリメント。神経誘導N2サプリメントとともに、BMPシグナル伝達阻害剤であるNogginは、中胚葉および内胚葉の関与をブロックすることにより、細胞を神経外胚葉系譜に向ける上で重要な役割を果たします。1日目、2日目、および3日目に、Nogginの濃度が10 ng / mLに増加します(ステップ3.3および3.4を参照)。4日目から、DIMを網膜分化培地(RDM)に交換し(ステップ3.5)、培養液を...

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ディスカッション

hiPS細胞は、in vitroで臓器や組織の発達を研究するための強力なツールです。健康なhiPS細胞と疾患特異的なhiPS細胞を網膜系統に分化させることによって疾患表現型を再現することは、さまざまな形態の遺伝性網膜ジストロフィーの病態生理学に関する新しい洞察を得るのに役立ちます。PSCの網膜細胞型へのインビトロ分化のために、いくつかのプロトコルが記載され、採用されている。それらのほとんどは、組換え成長因子、サプリメント、小分子、およびN1、N2、およびB27サプリメントなどの試薬の複雑なカクテルを含む培養培地の使用を含みます。ノギン、SB431542、LDN193189、フォリスタチンなどのBMPおよびTGFβシグナル伝達遮断薬、またはアクチビンA、レフティ、IDE1などの誘導物質。DKK1、SFRP、IWP-2、IWR-1-endoなどの標準的なWntシグナル伝達遮断薬、またはCHIR99021、SB216763、CKI-7などの誘導物質。PD0325901およびPD173074などのFGF受容体シグナル伝達遮断薬、またはbFGFなどの誘導物質;DAPTなどのノッチシグナル伝達阻害剤;インスリン様...

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開示事項

すべての著者には、利益相反や財務開示はありません。

謝辞

著者らは、遺伝学者のチトラ・カンナビラン博士からの科学的および技術的支援を認めています。スバドラ・ジャラリ博士、網膜コンサルタント;ミリンド・ナイク博士、眼球形成外科医;ハイデラバードのLVプラサド眼科研究所の眼腫瘍医であるスワティカリキ博士は、正常および患者固有のiPS細胞株の生成に向けて取り組んでいます。著者らは、科学技術省(IM)、(SB/SO/HS/177/2013)、バイオテクノロジー省(IM)、(BT/PR32404/MED/30/2136/2019)、およびインド政府のICMR(S.M.、D.P.)、UGC(T.A.)、CSIR(V.K.P.)の上級研究員からのR&D助成金を認める。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.22 以上m シリンジフィルターTPP99722 
15 mL 遠心分離チューブTPP91015
50 mL 遠心分離チューブTPP91050
6 ウェルプレートTPP92006
抗 Chx10 抗体;マウスモノクローナルSanta CruzSC3655191:50
抗CRX抗体;ウサギモノクローナルAbcam ab1406031:300
抗MiTF抗体、マウスモノクローナルAbcamab32011:250
抗回復抗体;ウサギのポリクローナル     MilliporeAB55851:300
B-27サプリメント(50倍)、無血清サーモフィッシャー17504044
塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)Sigma AldrichF0291
Centrifuge 5810REppendorf
Coplin Jar(50 mL)Tarson
Corning Matrigel hESC-Qualified MatrixCorning
CryoTubesThermo FisherV7884
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (基礎培地)Thermo Fisher10565-018
DreamTaq DNA polymeraseThermo FisherEP0709
Dulbeco's リン酸緩衝生理食塩水Thermo Fisher14190144
Essential 8 中型キットThermo FisherA1517001
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物 (EDTA)Sigma AldrichE5134
Falcon Not TC-treated Treated Pedri Dish, 60 mm コーニング351007
フェタル ウシ 血清、認定済み、米国 Gibco26140079
GelDocXR+ と Image ラボ ソフトウェアBIO-RADAgarose Gel ドキュメンテーション システム 
GlutaMAX SupplementThermo Fisher35050061
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488InvitrogenA110011:300 希釈
ヤギ抗マウス IgG (H+L), Alexa Fluor 546InvitrogenA110301:300 希釈
ヤギ抗ウサギ IgG (H+L), Alexa Fluo 546InvitrogenA110351:300 希釈
ヤギ抗ウサギ IgG (H+L),Alexa Fluor 488InvitrogenA110081:300 希釈
HistoCore MULTICUTLeica切片化ノ
ックアウト用 血清 補充サーモフィッシャー10828028
L-Acsorビン酸Sigma AldrichA92902
MEM 非必須アミノ酸溶液 (100x)Thermo Fisher11140-050
N2サプリメント (100個)Thermo Fisher17502048
NanoDrop 2000Thermo FisherTo quantify RNA
ParaformaldehydeQualigens23995
Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, UnpluggedCorning7095D-9
Penicillin-Streptomycin サーモフィッシャー15140-122
組換え抗Otx2抗体、ウサギモノクローナルAbcamab1839511:300希釈
組換え抗PAX6抗体;ウサギモノクローナルAbcamab1950451:300
組換え抗RPE65抗体、ウサギモノクローナルAbcamab2317821:300
組換えヒトNogginタンパク質R&D Systems6057-NG
SeaKem LE AgaroseLonza50004
血清ピペット 10 mLTPP94010
血清ピペット 5 mLTPP94005
塩化ナトリウムSigma AldrichS7653
クエン酸ナトリウム三塩基性二水和物Sigma AldrichS4641
スターフロスト (シランコーティング) 顕微鏡スライドKnittel
SuperScript III First-Strand Synthesis SystemThermo Fisher18080051
SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCRInvitrogen18080051
Triton X-100Sigma AldrichT8787
TRIzol 試薬Invitrogen15596026
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher15575020
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI ベクター研究所H-1200 
ビトロネクチンサーモフィッシャーA27940
Y-27632 二塩酸塩(Rhoキナーゼ阻害剤)Sigma AldrichY0503
Zeiss LSM 880Zeiss共焦点顕微鏡
希釈希釈希釈希釈354277希釈希釈

参考文献

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