新しい3Dプリントホルダーを使用した無傷の ex vivo グローブの生細胞イメージング

サマリー

本研究では、3Dプリントホルダーを利用して、除核球体の高解像度ライブセルイメージングを可能にする新しい実験プロトコルについて説明します。このプロトコルを通じて、 ex vivo グローブからの創傷角膜上皮における細胞カルシウムシグナル伝達活性をリアルタイムで観察することができる。

要約

角膜上皮創傷治癒は、上皮細胞上に発現するプリン作動性受容体の活性化によって開始される遊走過程である。この活性化は、細胞から細胞へと伝播するカルシウム動員イベントをもたらし、これは創傷床への細胞運動を開始するために不可欠であり、効率的な創傷治癒を促進する。Trinkaus-Randall研究室は、 ex vivo マウスグローブの角膜創傷治癒反応をリアルタイムでイメージングするための方法論を開発しました。このアプローチでは、確立されたプロトコルに従って安楽死させたマウスから無傷のグローブを取り出し、カルシウム指示色素でグローブを直ちにインキュベートします。細胞の他の特徴を染色する対比染色をこの段階で適用して、イメージングを支援し、細胞のランドマークを示すことができます。このプロトコルは、アクチンを染色するSiRアクチンや細胞膜を染色するための深赤色原形質膜染色など、対比染色に使用されるいくつかの異なる生細胞色素でうまく機能しました。創傷への反応を調べるために、25Gの針を使用して角膜上皮を損傷し、グローブを3Dプリントされたホルダーに入れます。3Dプリントされたホルダーの寸法は、実験期間中の地球儀の固定化を確実にするために調整され、さまざまなサイズの目に対応するように変更できます。創傷応答のライブセルイメージングは、共焦点顕微鏡を用いて経時的に組織全体の様々な深さで連続的に行われる。このプロトコルにより、共焦点顕微鏡で20倍の空気対物レンズを使用して、高解像度の出版品質の画像を生成できます。このプロトコルには、他の目的も使用できます。これは、 ex vivo マウスグローブでの生細胞イメージングの品質の大幅な改善を表し、神経と上皮の識別を可能にします。

概要

角膜
角膜は、目の前面を覆う透明な無血管構造であり、光を屈折させて視力を可能にし、目の内部を損傷から保護します。角膜は環境にさらされているため、機械的原因(引っかき傷)と感染の両方による損傷を受けやすくなります。他の点では健康な患者の角膜損傷は、通常1〜3日以内に治癒します。しかし、辺縁系幹細胞欠損症やII型糖尿病などの基礎疾患のある患者では、角膜創傷治癒プロセスを大幅に延長することができます¹。角膜は高度に神経支配されているため、これらの非治癒性の角膜潰瘍と再発性角膜びらんは非常に痛みを伴い、それらを経験している患者の生活の質を大幅に低下させます¹。

細胞シグナル伝達
他の点では健康な角膜が損傷すると、創傷に隣接する細胞内のカルシウムシグナル伝達イベントが先行し、創傷床への細胞移動を促し、そこで瘢痕化のリスクなしに損傷を閉じます^2,3。これらのシグナル伝達イベントは、ライブセルイメージングを用いた角膜上皮細胞培養モデルで十分に特徴付けられています²。予備実験は、糖尿病細胞と比較して、非糖尿病細胞における傷害後の有意に多くのカルシウムシグナル伝達を実証する。しかしながら、ex vivoグローブにおける細胞シグナル伝達事象の特性評価は、技術的な課題であることが証明されている。

ライブセルイメージング
以前の研究では、角膜創傷治癒のin vitro細胞培養モデルからのカルシウムシグナル伝達イベントを記録することに成功しています^4、5、6。ex vivo組織におけるこれらのシグナル伝達事象の高品質の画像を生成する方法論を開発することは、より複雑で現実的なシステムでこれらの事象の研究を可能にするため、非常に興味深いものである。以前のアプローチは、角膜の解剖とそれに続くUV誘発PEGゲルへの固定化を含んでいた⁷、^8、9。固定化は、実験の過程を通して生存可能で水和されたままでなければならないため、生きた組織を扱う際に不可欠でありながら困難なステップです。さらに、固定化は組織を傷つけてはならない。PEG溶液は組織を固定化しましたが、生成された画像の解像度と品質は一貫していませんでした。そのため、3Dプリントホルダーは、無傷の地球儀を固定して、組織の損傷のリスクが少なく高品質の画像を生成するために開発されました。

アプローチ
生細胞イメージングのために無傷の ex vivo グローブを固定化するために、独自の3Dプリントホルダーが開発されました。このホルダーは、角膜を解剖することなく除核球体のイメージングを可能にし、紫外線への曝露を排除するという2つの主要な光源からの損傷を防ぎます。これらの損傷源がなければ、得られた画像は、実験的に行われた引っかき傷に対する反応をより正確に表した。さらに、3Dプリントされたホルダーは、マウスアイの正確な寸法に合わせてキャリブレーションされました。これにより、PEG溶液での固定よりもはるかに優れたフィット感が得られ、組織の動きが減少するため、低出力の対物レンズでより高品質の画像が得られます。ホルダーの上部に取り付けられたカバーバーは、実験期間中、グローブが動かないままであり、水分補給と生存能力を維持するために成長培地が適用されたときにグローブが変位しないようにします。ホルダーを正確な寸法に印刷する機能により、年齢や病気の状態に応じてさまざまなサイズのマウスの目に最適なフィット感を生成することもできます。この技術は、寸法に基づいて異なる種の目のホルダーを開発するために、より広く適用することができます。

プロトコル

動物被験者を含む手順は、眼科ケアおよび視覚研究における動物の使用のための視覚眼科学研究協会およびボストン大学IACUCプロトコル(201800302)によって承認されました。

1. 3Dプリントされたホルダーとカバーバーの設計

1. マウスグローブの平均直径を考慮して3Dプリントされたホルダーとカバーバーを設計し、デザインを3Dプリントします(図1A、B)。
2. ホルダーの内壁の直径を地球の平均直径よりわずかに大きくして、個々のマウスのサイズの違いを考慮してください。ホルダーの高さを地球の直径の約半分に保ち、3Dプリントされたカバーバーで固定したときに地球儀がしっかりとフィットするようにします。
3. ホルダーカバーバーのサイズをホルダーの外径の長さに合わせ、幅はホルダー直径の1/4〜1/2にします。カバーバーは、水分補給と実験終了時の目の除去のためにホルダーに固定されたときに地球にアクセスできるようにサイズになっています。
4. ホルダーとカバーバーを印刷します。

2. サンプル収集

1. 施設のガイドラインに準拠して確立されたプロトコルを使用して、マウス(9〜12週齢および27週齢の雄C57BL / 6マウスがこの研究に使用されました)を安楽死させます。このプロトコルでは、二酸化炭素による安楽死とそれに続く斬首を行います。
2. マウスの頭を取り外し、すぐに氷の上に置いて組織の生存率を維持します。組織の損傷を防ぎながら、解剖ツールを使用して地球儀を除核します。
3. ピンセットを使用して地球を支えます。ピンセットで保持されている場所のすぐ下に解剖ハサミを使用して視神経をクリップします。
   注意: その他の予防措置については、層流フードで次の手順を実行します。
4. カルシウムインジケーターおよび/または細胞膜染色を含むp35細胞培養皿の2 mL培地でグローブを低照度条件の37°C、5%_CO2 インキュベーターで1時間インキュベートします。均一な染色のために、グローブが染色媒体に沈んでいることを確認してください。
   1. ここで実施する実験では、カルシウムインジケーターFluo4-AM(1:100)2、および細胞膜カウンター染色、深赤色原形質膜染色(1:10,000)2を使用し、最終濃度1%(v / v)DMSOおよび0.1%(w / v)プルロン酸を² mLのケラチノサイト無血清培地(KSFM)に次の成長サプリメントを含む:25 μg / mLウシ下垂体抽出物、 0.02 nMの上皮成長因子、0.3 mM CaCl₂、およびペニシリン-ストレプトマイシン(それぞれ100単位/ mLおよび100 μg / mL)。
      注:インキュベーションの条件と時間は、カルシウムインジケーター、組織の種類、およびサンプル量によって異なります。プルロン酸を使用する場合は、組織を透過性にするため注意が必要です。このプロトコルは10%プルロン酸を必要とします。低濃度のプルロン酸は実験的に効果がないと判断されており、高濃度は組織に損傷を与える危険性があります。.

3. サンプルホルダーの作製

1. ホルダーを、以前に使用されていない接着剤できれいなガラス底カバーガラスに接着します。このプロトコルで使用される接着剤は、無菌性を確保するために使い捨て容器から供給され、毎回新しい未開封の容器が使用されます。
2. ホルダーを70%エタノールで洗います。ホルダーに接着剤を置き、ホルダーをガラス底カバースリップに接着します。接着剤は蛍光を発し、イメージングを複雑にする可能性があるため、ホルダーの内側に接着剤がないことを確認してください。
3. 接着剤が固まるまで待ちます。ホルダーがカバーガラスにしっかりと固定されていることを確認します。
   注:この原稿で提示された実験には、ガラス底カバーガラスを備えたP35セルプレートが使用されました。他のガラス底スライドおよび/またはプレートは、実験のニーズに基づいて代用することができる。

4.アイグローブの傷

1. 滅菌点眼器を使用して染色溶液からグローブを取り除き、関心領域への組織の損傷を防ぐように注意します。滅菌リン酸緩衝生理食塩水を使用して室温で5分間グローブを洗浄し、余分な汚れを取り除き、顕微鏡に輸送するためにグローブを培地に入れます。
2. 関心のある領域で滅菌25 G針を使用して地球儀を巻きます。
   1. 滅菌点眼器を使用して、目の後ろから地球を持ち上げて保持します。これにより、地球が安定し、転がるのを防ぎ、一貫した傷を作ることができます。この設定を使用すると、視神経はスポイトノズルの内側にあり、角膜は外側を向いています。
   2. 引っかき傷の場合は、露出した角膜を横切って滅菌25G針をそっと動かします。穿刺傷の場合は、針を中央角膜に直接そっと押し込みます。傷が角膜に穴を開けないようにしてください。
      注:実験に創傷反応または創傷環境が必要ない場合は、この手順をスキップしてください。以前の研究では、この方法を使用して作成されたマウス角膜への引っかき傷と穿刺傷の両方が直径と深さの両方で一貫していることが示されています¹⁰。独立した地球儀間の創傷寸法の確認は、関心領域分析を用いて行った。

5.ホルダーへのサンプル配置

1. 角膜または辺縁部をホルダーの内側のカバーガラスに置き、3Dプリントされたカバーを使用して安定させます(図1C-H)。
2. グローブが正しく配置されていること、および対象サイトがガラスカバーガラスと接触していることを確認します。グローブをホルダーに入れたら、組織の損傷を引き起こす可能性があるため、グローブを取り外そうとしないでください。
3. 接着剤を使用して3Dプリントされたカバーをホルダーに接着し、安定性を確保します。カバーバーが地球儀ではなくホルダーに付着していることを確認してください。
   注:プロトコルは倒立顕微鏡で使用するために書かれているため、画像化する領域は下に配置されています。このプロトコルは、内半径の小さいホルダーとカバーバーの取り外しを使用して、正立顕微鏡に適合させることができます。これにより、地球の安定化が少なくなります。

6. サンプルイメージング

1. 顕微鏡と環境チャンバーの電源を入れ、チャンバーが加湿されていることを確認します。実験期間中、恒温槽を35°Cおよび5%_CO2 に設定する。
   注:この手順では、脱水を防ぎ、地球を最適な温度に保つために、環境チャンバーを備えた顕微鏡が適していますが、必須ではありません。
2. カバーガラス、ホルダー、および安定化された地球儀を環境チャンバー内の顕微鏡ステージに配置し、ライブセルイメージング技術を使用して画像化します⁹。
3. 追加の成長培地をカバーガラスにピペットで固定して、脱水を防ぎ、組織の生存率を維持します。ホルダーの地球を覆うのに十分な培地が井戸にあることを確認してください。イメージングの期間に応じて、実験全体を通して必要に応じて新しい培地を追加します。
4. ライブセルイメージング技術とプロトコルを使用して実験を開始します。低出力レーザー設定を使用して組織を保存し、長期間の実験での組織の損傷を防ぎます。長い作動距離には適切な対物レンズを使用してください。この原稿の実験は、20倍の対物レンズを使用して実行されました。
   注:レーザーの出力とゲイン、実験時間、位置、およびイメージングの平面はすべて、実験パラメータに応じて変数です。持続時間1時間から4時間の範囲の無傷の地球儀でのイメージング実験は、過去の出版物¹⁰で成功裏に行われています。
5. 好みのファイル形式でデータを記録および保存します。顕微鏡で使用されるソフトウェアは、データ記録用の.cziファイルを生成します。
6. プロトコルの最後にある標準的な制度プロトコルに従って地球儀を廃棄してください。

結果

このプロトコルは、出版品質のデータおよび画像を一貫して生成するために使用されてきた¹⁰。得られた画像は、以前のアプローチと比較して大幅な改善を表しています(図2)。3Dプリントされたホルダーを使用すると、角膜の層全体で画像をキャプチャでき、さまざまなz平面でのカルシウム動員を観察できます(図3)。このアプローチは、若齢マウスと老齢マウスの創傷における頂端細胞層と基底細胞層の間の細胞間シグナル伝達を比較するために使用されています¹⁰。

安定性の向上により、以前よりも大幅に長いグローブのイメージングが可能になりました。これにより、創傷床への細胞移動の研究を以前の能力を超えて数時間延長することができました。この延長されたタイムラインにより、角膜損傷後の若齢マウスと老齢マウスの間の創傷治癒応答中に細胞挙動の実質的な違いが観察され得る¹⁰

ディスカッション

このプロトコルは、3Dプリントされたホルダーを使用して無傷の動物の目を安定させ、固定化する生細胞イメージング技術について説明しています。これは、 ex vivo 角膜組織の以前の生細胞イメージングプロトコルで認識されたいくつかの重大な欠点を回避するように設計されています。このプロトコルは、インタクトグローブのライブセルイメージングに多くの利点を提供します。実験的に誘発された引っかき傷に対する創傷治癒応答を妨げる可能性のある不要な組織損傷を大幅に低減します。これには、解剖および紫外線への曝露による神経および上皮の損傷が含まれる。さらに、このプロトコルは、実験を中断することなく増殖培地を定期的に適用できるように組織を固定化することにより、組織の水分補給と生存を促進します。ホルダー内の目の向きを変えることで、このプロトコルは地球上のさまざまな領域のイメージングを可能にします。このプロトコルと一緒に共焦点顕微鏡を使用すると、地球のさまざまな平面のイメージングが可能になり、組織構造間の相互作用を観察できます。このプロトコルは非常に汎用性が高く、マウスや他の種のさまざまなサイズの地球儀に適合させることができます。ホルダーとカバーは...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.75青色ポリ乳酸(PLA)プラスチック	Creality(深セン、中国)	N / A	ホルダー用材料
35 mm皿、No.1.5カバーガラス、14 mmガラス直径、Poly-D-LysineコーティングMatTek	Corporation(マサチューセッツ州アッシュランド)	P35GC-1.5-14-C	イメージング用井戸。
Autodesk Fusion 360ソフトウェア	Autodesk(カリフォルニア州サンラファエル)。	N/A	ホルダーの印刷に使用するソフトウェアです。
BD 25 G 7/8 滅菌針 単回使用 100 針/箱	サーモフィッシャーサイエンティフィック (マサチューセッツ州ウォルサム)	305124	球体への実験的に誘発された創傷の場合
CellMask DeepRed	Invitrogen (カリフォルニア州カールスバッド)	C10046	細胞膜対比染色。カルシウムインジケーター。1:10,000濃度、最終濃度1%(v / v)DMSOおよび0.1%(w / v)プルロン酸
コンプリートホームスーパーグルー	ウォルグリーン(イリノイ州ディアフィールド)	N / A	イメージングウェルに取り付けるため
Ender 3 Pro 3Dプリンター	Creality (Shenzen, China)	N/A	ホルダーの印刷用
FIJI/ImageJ	ImageJ (Bethesda, MD)	ライセンス番号: GPL2	関心領域分析を使用して独立したグローブ間の創傷の深さと直径の一貫性を確認するために使用
Fluo-4	Invitrogen (Carlsbad, CA)	F14201	カルシウムインジケーター. 1:100 濃度、最終濃度 1%(v/v) DMSO および 0.1% (w/v) プルロン酸
ケラチノサイト無血清培地	Gibco (マサチューセッツ州ウォルサム)	17005042	25 mg/mL ウシ下垂体抽出物、0.02 nM EGF、0.3 mM CaCl2、およびペニシリン-ストレプトマイシン (100 units/mL, 100 & micro;それぞれg / mL)中型の
リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)	Corning、Medlabtech(バージニア州マナッサス)	21-040-CV	イメージングする前に角膜の余分な汚れを洗い流すために使用されました
Zeiss Confocal 880顕微鏡とAiryScan	Zeiss(ソーンウッド、NY)	N / A	20倍倍倍対物レンズを使用しました

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