様々な光合成生物に関連するプラストグロビュール脂肪滴を単離するための迅速かつ効率的なプロトコルが提示されています。単離されたプラストグロビュールの調製を成功させることは、プロテオミクス解析やリピドミック解析などの詳細な分子調査に先立つ重要な第一歩です。
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この記事について
サマリー
要約
プラストグロビュール脂肪滴は、植物の葉緑体とシアノバクテリアの動的なサブコンパートメントです。光合成種に遍在しており、急速に変化する環境条件下でのチラコイド膜の適応とリモデリングにおいて中心的な役割を果たすと考えられています。高純度のプラストグロビュールを単離する能力は、プロテオミクス、リピドミック、およびその他の方法論による研究を大幅に促進しました。高純度と高収率のプラストグロビュールを使用すると、脂質やタンパク質の組成、酵素活性、タンパク質トポロジーなどの分子特性を調べることができます。この記事では、植物の葉組織の葉緑体からプラストグロビュールを分離するための迅速かつ効果的なプロトコルを提示し、トウモロコシの葉、復活植物の乾燥葉組織、 エラグロスチスニンデンシス、およびシアノバクテリウム、 シネコシスティス からプラストグロビュールおよび関連する脂肪滴構造を単離するための方法論的バリエーションを提示します PCC 6803。単離は、これらの脂質に富む粒子の低密度に依存しており、スクロース密度浮遊選鉱による精製を容易にします。この方法論は、多様な種からのプラストグロビュールの研究において有用であることが証明されます。
概要
プラストグロビュールの組成と機能の現在の理解は、詳細なプロテオミクスおよびリピドミクス研究を通じて明らかになりました1,2,3,4,5。このような研究は、スクロース勾配を使用した効率的な分離のために非常に低い密度に依存する迅速かつ効果的な単離方法によって大いに助けられてきました。プラストグロビュールの分離の初期方法は、ブナの木(Fagus sylvatica)、スコッチほうき(Sarothamnus scoparius)、タマネギ(アリウムセパ)、ほうれん草(Spinacia oleracea)、パンジー(Viola tricolor)、コショウ(トウガラシ)、エンドウ豆(Pisum sativum)などの種から達成されました6,7,8,9,10,11
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プロトコル
1.粗いプラストグロビュールの分離
- ストレスを受けていないトウモロコシ葉組織からの粗プラストグロビュール抽出
- 約3週齢で、ほぼV5の成長段階にあり、重さ約120gの健康なトウモロコシの苗6本を取得します。
- 茎の根元にあるすべての葉を切り取り、氷浴にすばやく浸して、冷蔵室に運びます。
- 緑色の安全ランプの下で作業し、氷浴からトウモロコシの葉を取り除き、はさみを使用してそれらをより小さな断片(約5 cm x 5 cm)に切り取ります。
- クリップされた葉組織の半分を市販のブレンダーで350 mLの粉砕バッファーで穏やかに、しかし徹底的に粉砕します(表1)。ブレンダー5x-6xを開始停止して、すべての葉がカットされていることを確認します。ブレンダーでレベル7より高いものを使用しないでください。
- ホモジネートを大きな漏斗上の25 μmナイロンクロスの1層を通して4本の250 mL遠心分離機ボトルにろ過します。次に、切り取られた葉組織の後半で手順1.1.4を繰り返します。
- ろ液を4本のボトルに均等に分け、4°Cで1,840 x g で6分間遠心分離します。 葉のろ液のアリコートを取り除き、遠心分離の前に取っておき、代表的な全葉サンプルとして保存します。
- 得られた上清を注ぎ、ブラシを穏やかに動かしな....
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結果
プロトコルのステップ1が完了すると、かなりの量のプラストグロビュール/脂質液滴物質がスクロースクッションの最上層(またはその近く)に浮かんでいるのを容易に見ることができるはずです(図1B-C)。この段階で他の画分も収集できます。例えば、チラコイドはペレット化され、その後の分析のために培地R 0.2で再懸濁することができる。その後の遠心分離後、図1A、Cに示すように、スクロース勾配の表面またはその近くで精製プラストグロビュールが得られます。特定の状況(特定の遺伝子型系統や環境条件など)では、プラストグロビュールが勾配の異なる層で分離する2つの異なる亜集団として分離することがわかっています:勾配表面の低密度画分と、上位2つの勾配層間の界面に沈降する2番目の高密度画分。分離画分の慎重な比較分析はこれまで行われていませんが、これらの亜集団は異なるサイズのプラストグロビュールを表している可能性があり、直径が小さい(したがって、表.......
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ディスカッション
材料に対する生理学的/生化学的変化を最小限に抑え、プラストグロビュールの豊富な成分である特定の光および熱に不安定なプレニル脂質色素を保護するには、4°Cで光から保護するために分離を行うことが重要です。上記のように、最初のステップは、緑色に発光する電球を使用して、安全ランプの下の冷蔵室で実行されます。実験室で行われる後続のステップは、薄暗い照明の下で行われ、氷または冷蔵遠心分離を使用します。同様の理由から、新鮮なプロテアーゼ阻害剤(およびタンパク質のリン酸化調節の研究に関心がある場合はホスファターゼ阻害剤)を含めることが重要です(表2 および 表3)。
他の方法(例えば、Dounceホモジナイザー、凍結融解サイクル)は、原則として、高等植物葉緑体のチラコイドからプラストグロビュールを放出するために採用することができるが、超音波処理は、最高の収量および純度を提供する上ではるかに優れていることが見出されている(未発表の結果)。超音波処理は、チラコイドラメラまたは小胞体から人工小胞を作成することがあります。ただし、これらの.......
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開示事項
宣言する利益相反はありません。
謝辞
ルンドキスト研究室グループの研究は、NSF(MCB-2034631)およびUSDA(MICL08607)からP.K.L.への助成金によってサポートされています。著者らは、シアノバクテリアプラストグロビュール分離法の開発を支援してくれたキャリー・ハイザー博士(MSU)に感謝の意を表します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| AEBSF | ミリポア シグマ | P7626 | |
| 抗疼痛.2HCl | バケム | H-1765.0050BA | |
| アプロチニン | ミリポア シグマ | A6106 | |
| アスコルビン酸 | BDH | BDH9242 | |
| ベスタチン | シグマ アルドリッチ | B8385 | |
| ベータ-グリセロリン酸 2Na5H2O | EMD ミリポア | 35675 | |
| ウシ血清アルブミン | Proliant Biological | 68700 | |
| キモスタチン | Σ Aldrich | C7268< | |
| em>Eragrostis nindensis | N | /A N/A | |
| E-64 | Milipore Σ | E3132 | |
| French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| ロイペプチン | Sigma Aldrich | L2884 | |
| 塩化マグネシウム | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron 振とうインキュベーター | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| 水酸化カリウム | フィッシャーケミカル | M16050 | |
| 還元型システイン | MPバイオケミカル | 101444 | |
| ッ化ナトリウム | Sigma Aldrich | S7920 | |
| オルトバナジン酸ナトリウム | Sigma Aldrich | 450243 | |
| ピロリン酸ナトリウム · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| ショ糖 | シグマ アルドリッチ | S9378 | |
| シルバニア 15 W 蛍光 Gro-Lux チューブ電球、18 インチ | ウォルマート | N/A | |
| 共生 < EM>stis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| オプティマ MAX-TL 超遠心分離機 | ベックマン・コールター | A95761 | |
| ワーリング ブレンダー (1.2 L) | VWR | 58977-227 | 商用ブレンダー |
| Zea mays | N/A | N/A |
参考文献
- Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. Lipid droplets throughout the evolutionary tree. Progress in Lipid Research. 78, 101029(2020).
- Lundquist, P. K., et al. The functional network of the Ara....
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