プラストグロビュール 植物葉組織およびシアノバクテリアからの脂肪滴分離

プラストグロビュールの組成と機能の現在の理解は、詳細なプロテオミクスおよびリピドミクス研究を通じて明らかになりました^1,2,3,4,5。このような研究は、スクロース勾配を使用した効率的な分離のために非常に低い密度に依存する迅速かつ効果的な単離方法によって大いに助けられてきました。プラストグロビュールの分離の初期方法は、ブナの木(Fagus sylvatica)、スコッチほうき(Sarothamnus scoparius)、タマネギ(アリウムセパ)、ほうれん草(Spinacia oleracea)、パンジー(Viola tricolor)、コショウ(トウガラシ)、エンドウ豆(Pisum sativum)などの種から達成されました6,7,8,9,10,11 、^12、13。葉緑体プラストグロビュールをより効率的かつより良い収量で単離するための更新された方法は、後にYtterbergらによって提示されました^3,14。当初はシロイヌナズナの葉葉緑体のプラストグロビュールの研究に採用されていましたが、トウモロコシ(Zea mays)、トマト(Solanum lycopersicum)、ラブグラス(Eragrostis nindensis)、紫色の偽ブロム(Brachypodium distachyon)、野生のタバコ(Nicotiana benthamiana)など、単子葉植物と双子葉植物の両方の健康な葉組織にこの更新された方法を採用することに成功しました。;未発表の結果)。さらに、この分離法は、Synechocystis sp. PCC 6803およびAnabaena sp. PCC 7120¹⁵を含むシアノバクテリアのプラスト小球、および復活植物E. nindensisの乾燥葉組織に適応することに成功しています。

健康な葉組織の葉緑体プラストグロビュールは、チラコイド膜¹⁶に物理的に接続されている。この物理的連続性にもかかわらず、2つの葉緑体サブコンパートメントは異なる脂質およびタンパク質組成を維持するが、2つのコンパートメント間の脂質およびタンパク質の調節された交換が提案されている2,4,17,18,19。実際、葉緑体と細胞質ゾルの間の中性脂質の輸送について、興味深い半融合モデルが最近提案されています¹⁹。プラストグロビュールおよびチラコイドの物理的連続性のために、健康な葉組織を有する単離方法は、ペレット化された粗チラコイド調製物の収集から始まり、その後、細胞質ゾル脂肪滴を単離するために使用される方法とは対照的に、チラコイドからプラストグロビュールを分離するために超音波処理される²⁰.次に、スクロースクッション上での超遠心分離により、低密度プラストグロビュールがスクロースを通って浮遊し、チラコイド、核、およびその他の高密度材料から効果的に分離されます。対照的に、シアノバクテリアのプラストグロビュールは、乾燥した葉組織のプラストグロビュールと同様に、明らかに自由に浮遊する形で生体内に存在する。したがって、それらの単離は、スクロース勾配に直接浮遊することを含む。この記事では、健康な葉組織からの分離方法を示し、さらに、乾燥した葉組織またはシアノバクテリア培養物からプラストグロビュールを分離するために使用できる2つのバリエーションを示し、プラストグロビュールを研究できる生理学的幅と進化のコンテキストを大幅に拡大します。

単離されたプラストグロビュールは、その後、分子特性を調査するための任意の数のダウンストリーム分析に使用できます。我々は、A. thaliana葉組織から単離されたプラストグロビュールを、異なる環境条件または遺伝子型の下での広範なプロテオミクスおよびリピドミクス解析に使用し、ストレスに適応したタンパク質および脂質組成の選択的修飾を実証しました2,4,21,22。さらに、単離されたプラストグロビュールに関連するトランスリン酸化活性を示すインビトロキナーゼアッセイが実施されており²²、タンパク質成分のオリゴマー状態が天然ゲル電気泳動を使用して調査されており²¹、プロテアーゼシェービングアッセイが^{実施されています23}。

この方法の主な利点は、手順の相対的な速度です。私たちの経験では、以下に概説するプロトコルは約4時間以内に完全に完了することができます。葉組織からプラストグロビュールを単離する代替方法が記載されており、これにより、他の葉緑体サブ区画の同時単離が可能になる²⁴。この代替方法は、他の葉緑体サブコンパートメントとの定量的比較が必要または望ましい場合に、いくつかの明確な利点を提供します。しかしながら、この代替方法もまたより面倒であり、そして同量の葉組織から単離されたプラスト小球の有意に低い収量を提供するであろう。プラストグロビュースの焦点を絞った研究が目的である場合、ここで概説する方法論が最適な選択です。それにもかかわらず、全葉および粗チラコイドアリコートはサンプル調製中に収集することができ、その後の比較のために参照サンプルを用意することを強くお勧めします。

1.粗いプラストグロビュールの分離

1. ストレスを受けていないトウモロコシ葉組織からの粗プラストグロビュール抽出
   1. 約3週齢で、ほぼV5の成長段階にあり、重さ約120gの健康なトウモロコシの苗6本を取得します。
   2. 茎の根元にあるすべての葉を切り取り、氷浴にすばやく浸して、冷蔵室に運びます。
   3. 緑色の安全ランプの下で作業し、氷浴からトウモロコシの葉を取り除き、はさみを使用してそれらをより小さな断片(約5 cm x 5 cm)に切り取ります。
   4. クリップされた葉組織の半分を市販のブレンダーで350 mLの粉砕バッファーで穏やかに、しかし徹底的に粉砕します(表1)。ブレンダー5x-6xを開始停止して、すべての葉がカットされていることを確認します。ブレンダーでレベル7より高いものを使用しないでください。
   5. ホモジネートを大きな漏斗上の25 μmナイロンクロスの1層を通して4本の250 mL遠心分離機ボトルにろ過します。次に、切り取られた葉組織の後半で手順1.1.4を繰り返します。
   6. ろ液を4本のボトルに均等に分け、4°Cで1,840 x g で6分間遠心分離します。 葉のろ液のアリコートを取り除き、遠心分離の前に取っておき、代表的な全葉サンプルとして保存します。
   7. 得られた上清を注ぎ、ブラシを穏やかに動かしながら旋回させて再懸濁することにより、0.2 Mスクロース(表1)を含む12 mLの培地R 0.2にペレットを静かに再懸濁します。各ペレットを再懸濁した後、懸濁液を次のボトルに運び、再懸濁を繰り返します。懸濁液を1本のボトルにプールします。
   8. プールされた懸濁液を6本の3 mL超遠心チューブに分配し、各チューブの最大容量2.5 mLに達します。
   9. 各チューブを4回超音波処理し、毎回10秒間、100%の振幅でチップ超音波処理器を使用します。泡立ちを防ぐために、超音波処理器ホーンを液面から沈め、離しておくように注意してください。
   10. 各ラウンド中にサスペンション内で超音波処理器ホーンをゆっくりと上下に動かします。4つのチューブを交互に使用し、各チューブを各超音波処理後にアイスバケットに戻し、サンプルを冷却します。
   11. 超音波処理された粗チラコイド懸濁液を150,000 x g で4°Cで30分間遠心分離する。 得られた粗プラストグロビュールのフローティングパッドを、注射器と22 G針を使用して、針の開口部でクッションの表面をすくい取り、各チューブから約500 μLを回収することにより、スクロースクッション(黄色の油性パッドとして容易に見える)から回収します。2.0 mLチューブに注入します。
   12. プラストグロビュールの超音波処理および放出の前後に粗チラコイドのアリコートを収集する。ステップ 2.1 に進みます。あるいは、粗プラストグロビュールを-80°Cで保存し、後で精製します。
2. 乾燥 E.ニンデンシス 葉組織からの粗プラストグロビュール抽出
   1. 完全に乾燥した8〜9週齢の E.ニンデンシス (約40 gの組織)のポット(ポットごとに3つの個々の植物で構成される)を取得します。
   2. はさみを使用して、土壌のすぐ上の植物の根元からすべての葉の組織を切り取り、すぐに氷浴で組織を浸します。ティッシュを冷蔵室に運びます。
   3. 緑色の安全ランプの下で作業し、 Eを切り取ります。 ニンデンシスは ハサミを使って小さな断片(約5 cm x 5 cm)に葉を出します。
   4. 市販のブレンダーで100 mLの粉砕バッファー(表1)で葉を穏やかに、しかし徹底的に粉砕します。ブレンダーを数回開始停止して、すべての葉がカットされていることを確認します。ブレンダーでレベル7より高いものを使用しないでください。
   5. ホモジネートを大きな漏斗上の25 μmナイロン布の1つの層を通して250 mLのコニカルフラスコにろ過します。葉のろ液のアリコートを取り除き、遠心分離の前に取っておき、代表的な全葉サンプルとして保存します。
   6. 適量のスクロースを加えて最終濃度を0.5 Mにし、溶液を250 mL遠沈管に分配します。
      注: Z.メイズ 調製物と比較して高濃度のスクロースは、チラコイド結合プラストグロビュールのその後の超音波処理/放出の前に細胞質脂質液滴の浮遊選鉱を確実にするために使用されます。
   7. チューブを45,000 x g で4°Cで30分間遠心分離します。 プラストグロビュールと細胞質脂肪滴の混合物は、ショ糖クッションの表面またはその近くに黄色の油性パッドとして容易に見られます(図1B)。針の開口部でクッションの表面をすくい取って22G針を備えたシリンジを使用して浮遊物を収集し、チューブに堆積させます。
   8. 自由に浮遊するプラストグロビュール/脂肪滴混合物を収集した後、残りの上清を廃棄します。
   9. 残留チラコイドに接続されたプラストグロビュールを単離するには、ブラシを穏やかに動かして旋回させて再懸濁することにより、ペレットを12 mLの培地R 0.2に再懸濁します。懸濁液を1本のボトルにプールします。ステップ 1.1.8 に進みます。
3. シアノバクテリアからの粗プラストグロビュール抽出
   1. シネコシスティスsp. PCC 6803の50 mL培養物を固定期(約7〜10日)に成長させ、分光光度計を使用して細胞密度をOD₇₅₀ 2.0に調整します。培養条件については、BG-11培地を使用し、インキュベーター内で150 μmol光子/m 2/s、²%_CO2、32°Cの光強度で、150 rpmで連続的に振とうしながら増殖させます。
   2. 多糖類を除去するには、50 mL培養液を6,000 x g で4°Cで45分間遠心分離し、続いて上清を除去して細胞を洗浄します。引き続き、50 mLのバッファーAで細胞を2回洗浄します(表1)。細胞ホモジネートのアリコートを除去し、遠心分離前に取っておき、代表的な全細胞サンプルとして保存します。
   3. 洗浄したペレットを25 mLのバッファーAに再懸濁し、1,100 psiのフレンチ圧力セルを使用して細胞を破壊し、溶解した色が白色光の下で緑から赤青緑に変わるまで、このプロセスを3回繰り返します(タンパク質の変性を避けるために、各サイクルの間にサンプルを氷上に置きます)。予冷セルを使用して、冷蔵室でこの手順を実行します。
   4. 得られたホモジネートを、各チューブに最大2.5 mLまで充填した8本の3 mL超遠心チューブに分配し、400 μLの培地Rを注意深く重ねて、ステップグラジエントを生成します。
      注:スクロース勾配調製の詳細な説明については、YangらおよびKelekarらを参照してください^25,26。
   5. 必要に応じて培地Rを追加してチューブのバランスを慎重に取り、4°Cで150,000 x g で30分間遠心分離します。 チラコイドおよび他のより重い細胞小器官(ポリヒドロキシアルカノエート体を含む)はペレット状になり、プラスト小球はスクロース勾配の上部またはその近くにある黄色の油性パッドとして容易に見られます(図1C)。
   6. 得られた粗プラストグロビュールのフローティングパッドをシリンジと22G針で収穫し、2mLチューブに堆積させます。必要に応じて、針先で超遠心管壁の側面からプラストグロビュールをこすり落とします。
   7. ステップ 2.2 に進みます。あるいは、粗プラストグロビュールを-80°Cで保存し、後で精製します。

2.純粋なプラストグロビュールの収穫

1. 植物組織処理
   1. 最初にステップ1.1またはステップ1.2から500 μLの粗プラストグロビュールを500 μLの培地R 0.7と混合して総容量1 mLにし、次に400 μLの培地R 0.2をオーバーレイし、次に400 μLの培地Rでオーバーレイすることにより、2.5 mL超遠心チューブでスクロースグラジエントを生成します。
      注:スクロース勾配調製の詳細な説明については、YangらおよびKelekarらを参照してください^25,26。
   2. 必要に応じて、余分な培地Rを最上層に追加して、チューブのバランスを慎重に取ります。その後、150,000 x g で 4 °C で 1.5 時間遠心分離します。
   3. 得られた純粋なプラストグロビュールのフローティングパッド(図1A)をシリンジと22G針で回収し、2 mLチューブに堆積させます。必要に応じて、遠心管の壁の上部からプラストグロビュールを針先でこすり落とします。
   4. 純粋なプラストグロビュールを分注し、液体窒素中で瞬間凍結します。-80°Cで直接保存するか、凍結乾燥して乾燥粉末にします。
2. シアノバクテリア処理
   1. 4本の2.5 mL超遠心チューブに、最初にステップ1.3の粗プラストグロビュール500 μLを750 μLの培地R 0.7と混合し、次に750 μLの培地R 0.2と重ね合わせたスクロース勾配を生成します。
      注:スクロース勾配調製の詳細な説明については、YangらおよびKelekarらを参照してください^25,26。
   2. スクロースグラジエントを150,000 x g で4°Cで90分間遠心分離します。 スクロース勾配の上相からシリンジと22 G針で純粋なプラストグロビュール(図1C)を収集し、1.5 mLチューブに移します。
   3. 純粋なプラストグロビュールを分注し、液体窒素でフラッシュフリーズします。-80°Cで直接保存するか、凍結乾燥して乾燥粉末にします。

プロトコルのステップ1が完了すると、かなりの量のプラストグロビュール/脂質液滴物質がスクロースクッションの最上層(またはその近く)に浮かんでいるのを容易に見ることができるはずです(図1B-C)。この段階で他の画分も収集できます。例えば、チラコイドはペレット化され、その後の分析のために培地R 0.2で再懸濁することができる。その後の遠心分離後、図1A、Cに示すように、スクロース勾配の表面またはその近くで精製プラストグロビュールが得られます。特定の状況(特定の遺伝子型系統や環境条件など)では、プラストグロビュールが勾配の異なる層で分離する2つの異なる亜集団として分離することがわかっています:勾配表面の低密度画分と、上位2つの勾配層間の界面に沈降する2番目の高密度画分。分離画分の慎重な比較分析はこれまで行われていませんが、これらの亜集団は異なるサイズのプラストグロビュールを表している可能性があり、直径が小さい(したがって、表面積対体積比およびタンパク質対脂質比が大きい)ものは、勾配でより低く沈降します。

失敗した試みでは、最初の遠心分離ラウンド後にスクロースクッションの表面に目に見えるプラストグロビュールがほとんどまたはまったく見られません。十分なプラストグロビュールを正常に分離できないのは、最適化が必要ないくつかの要因に依存する可能性があります。特に、超音波処理技術(健康な葉の組織を使用する場合)は、成功に大きな影響を与える可能性があります。さらに、植物/シアノバクテリア材料の必要な量は、特定の種とそのストレス条件に依存します。

プラストグロビュールの単離に成功した後、プラストグロビュールおよびチラコイド(一次汚染コンパートメント)のマーカータンパク質のイムノブロッティングを使用して、単離されたプラストグロビュールの純度を検証することが可能です。図1Dでは、プラストグロビュール2のマーカーとしてA.タリアナFBN1aに対して、およびチラコイド27のマーカーとしてA.タリアナ光化学系IIサブユニットD1に対して産生された抗体を用いて、代表的なイムノブロットが見られます。Synechocystis sp. PCC 6803のFBNホモログは、主にプラストグロビュールではなくチラコイドと関連しています。

また、意図した下流の研究に依存する可能性のある保管方法も慎重に検討する必要があります。特にプレニル脂質色素脂質の下流分析では、光不安定化合物の損傷を避けるために、サンプルの直接光への曝露を最小限に抑えることが重要です。精製されたプラストグロビュールは、リピドミックまたはプロテオミクスベースの実験などのダウンストリーム実験に使用できます。プラストグロビュールは、タンパク質対脂質比が非常に低いことを特徴とし、これは、それらの低密度およびスクロース上に浮遊する能力として現れる。したがって、プラストグロビュールサンプルの低タンパク質濃度は正常です。このため、SDS-PAGEによるタンパク質分離の前に、アセトンタンパク質沈殿またはクロロホルム/メタノール抽出を使用して脂質を除去することをお勧めします。

図1:プラストグロビュールとチラコイドの単離とイムノブロッティング 。 (A)スクロース勾配からの抽出前の Z.mays からの代表的な精製プラストグロビュールサンプル。(B)スクロースクッションからの抽出前の乾燥 E.ニンデンシス からの代表的な粗プラストグロビュールサンプル。(C) Synechocystis sp. PCC 6803からの代表的な粗(左)および純粋な(右)プラストグロビュールサンプルを、ロードされたスクロースクッションおよび勾配の超遠心前後の両方をそれぞれ示す。(D)抗フィブリリン1a抗体(α-FBN1a)を用いて、高等植物におけるプラストグロビュールのマーカータンパク質であるフィブリリンの蓄積をモニターした。フィブリリンオルソログは、シアノバクテリアの単離されたチラコイドに主に蓄積します(Synecho、 Syenchocystis sp. PCC 6803)。抗光化学系IIサブユニットD1(α-PsbA)を使用して、プラストグロビュール単離からのチラコイドの枯渇を検証しました。各レーンに、5μgのチラコイドおよび10μgのプラストグロビュールタンパク質が装填された。略語:PG =プラストグロビュール;あなた=チラコイド。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:植物の葉組織またはシアノバクテリアからのプラストグロビュール単離のためのバッファーレシピ。

表2:ホスファターゼ阻害剤カクテル。

表3:プロテアーゼ阻害剤カクテル。

宣言する利益相反はありません。