このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

フルスペクトルフローサイトメトリーによる初代マウスT細胞におけるT細胞受容体誘導性カルシウム流入の解析

5.1K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/64526

⸱

2022年12月16日

 ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado-Anschutz School of Medicine

この記事について

サマリー

T細胞シグナル伝達の尺度であるカルシウム流入は、T細胞受容体刺激に対する応答を分析するための効果的な方法です。Indo-1を細胞表面分子に向けられた抗体のパネルでマルチプレックス化するためのこのプロトコルは、フルスペクトルフローサイトメトリーの非常に柔軟な機能を利用しています。

要約

T細胞受容体刺激に応答するカルシウム流入は、T細胞シグナル伝達の一般的な尺度である。バンドパスフローサイトメトリーによるカルシウムシグナル伝達を評価するために、いくつかのカルシウム指示色素が開発されています。このプロトコルは、フルスペクトルフローサイトメトリーを使用して初代マウスT細胞のカルシウム応答を測定するように設計されています。全脾細胞は、細胞表面分子に対する蛍光色素結合抗体のパネルとともに、レシオメトリックカルシウム指示色素Indo-1で標識されています。フルスペクトルフローサイトメトリーの機能を活用することで、Indo-1と組み合わせて幅広い細胞表面染色剤を利用するためのプラットフォームが提供されます。次いで、T細胞受容体を刺激する抗CD3抗体の添加前後の37°Cで細胞をリアルタイムで分析する。スペクトルシグナルを混合解除した後、カルシウム結合とカルシウムフリーのインド-1の比率が計算され、脾細胞のゲート集団ごとに経時的に視覚化できます。この技術は、複数の細胞集団におけるカルシウム応答の同時解析を可能にすることができる。

概要

T細胞受容体(TCR)誘導性カルシウム流入は、T細胞活性化の有用な尺度であり、T細胞の集団がTCRシグナル伝達経路1の近位ステップで応答を障害しているかどうかを判断するために頻繁に使用されます。カルシウム流入の測定は、一般に、T細胞を1つまたは1対の蛍光カルシウム指示色素で予め標識し、次いでTCR架橋後にフローサイトメトリーを用いて蛍光シグナルをリアルタイムで調べることによって行われる2,3,4。レシオメトリックカルシウム色素であるインド-1は、カルシウム結合に依存する2つの異なる波長でピーク発光するUVレーザーによって励起され5、生リンパ球におけるカルシウム応答のフローサイトメトリー分析に一般的に使用される指標色素です。Indo-1の発光プロファイルは非常に広いため、Indo-1評価とバンドパスフローサイトメトリーによる複数の細胞表面マーカーの同時分析を組み合わせることは困難な場合があります。この制限により、カルシウム応答のフローサイトメトリー分析の利用は、T細胞の事前に精製された集団または限られた細胞表面分子のセットによって同定された集団に制限されます。

バンドパスフローサイトメトリーを使用して初代リンパ球の不均一な集団に対するカルシウム応答を測定することの限界に対処するために、フルスペクトルフローサイトメトリーを使用してIndo-1蛍光を測定するためのプロトコルが開発されました。この方法では、フルスペクトルフローサイトメトリーの柔軟性の高い機能を利用して、細胞表面分子に向けられた抗体のパネルでIndo-1をマルチプレックス化することができます。従来のフローサイトメトリーよりもフルスペクトルフローサイトメトリーを使用する利点は、蛍光シグナルを高度に重なり合う色素から区別できるため、各サンプルで同時に評価できる表面マーカーの数が増えることです。従来のフローサイトメトリーはバンドパスフィルターを使用し、検出器システム6あたり1つの蛍光色素に制限されています。フルスペクトルフローサイトメトリーは、5レーザースペクトルフローサイトメトリーシステム上の64個の検出器を使用して、蛍光色素の全スペクトルにわたってシグナルを収集します7,8。さらに、フルスペクトルフローサイトメトリーは、従来のフローサイトメーター8に存在する光電子増倍管検出器と比較して感度が向上したAPD(アバランシェフォトダイオード)検出器を利用します。したがって、このアプローチは、カルシウム色素標識の前に特定のT細胞集団を単離する必要がないため、末梢血単核細胞やマウス二次リンパ器官細胞懸濁液などの不均一な細胞集団に最適です。代わりに、データ収集後の細胞表面マーカー発現プロファイルとフローサイトメトリーゲーティングを使用して、関心のある各集団におけるカルシウム応答を評価できます。このレポートで示されているように、Indo-1は8つの蛍光色素結合抗体と容易に組み合わせることができ、合計10のユニークなスペクトルシグネチャが得られます。さらに、この方法は、先天的に異なるマウス系統の細胞の混合物に容易に適用することができ、遺伝子標的マウス株からのものと比較して、野生型T細胞におけるカルシウム応答の同時解析を可能にする。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

マウスは、IACUCプロトコルに従ってコロラド大学アンシュッツ医科キャンパスで維持された。全てのマウスをAAALAC基準に従って安楽死させた。

1. マウス脾臓からの免疫細胞の調製

注:ナイーブマウスをCO2 安楽死で安楽死させる。ジャクソン研究所から購入し、社内で飼育したC57BL/6マウスを6〜12週齢で実験に使用します。実験にはオスとメスの両方のマウスが利用されます。

  1. 外部の汚染物質がサンプルに入る可能性を減らすために、70%エタノールでマウスの皮膚を消毒します。
  2. 解剖ツール、外科用ハサミ、および鉗子を使用してマウスの脾臓を解剖します。脾臓を採取し、剥離した脾臓を氷上で~5 mLの完全RPMI培地(cRPMI)を入れた50 mLの円錐管に入れます。
    注:完全なRPMIは、10%FBS、2 mM L-グルタミン、および1%ペニシリン/ストレプトマイシンで構成されています。
    1. マウスの脾臓を採取するには、マウスの左側に沿って、ハサミで前足と後脚の中間に沿って毛皮と皮膚を5 cm切開します。体腔を~5cm開き、鉗子を使用して脾臓を取り除きます。脾臓はインゲン豆の色で、隣接する腎臓よりも長くて平らです。
  3. ステップ1.2の内容物を、新しい50 mLコニカルチューブに取り付けられた滅菌70 μmフィルターに注ぎます。脾臓パルプがフィルター表面に残らなくなるまで、5 mLシリンジプランジャーで脾臓をフィルターに押し込むことにより、脾臓を単一細胞懸濁液に機械的に分離します。
  4. スイングアウトローターカウンタートップ遠心分離機を使用して、500 x g で4°Cで5分間脾細胞をペレット化します。
  5. 上清を注意深くデカントします。ペレット化された脾細胞は、50mLのコニカルチューブの底に残ります。
  6. 赤血球を除去するには、ペレット化した脾細胞を1 mLのACK溶解バッファーに3分間再懸濁します。よく混ぜる。
  7. ACK溶解バッファーを15 mLのcRPMIでクエンチします。
  8. ステップ1.4の指示に従ってリンパ球をペレット化します。
  9. 細胞懸濁液を50 mLコニカルチューブ内の5 mL cRPMIに再懸濁します。サンプルを氷の上に置きます。
    1. 細胞をカウントするには、10 μLの細胞懸濁液を0.6 mLの微量遠心チューブに移し、トリパンブルー溶液で1:1の比率で希釈します。その後、血球計算盤または自動細胞計数システムに移します。
  10. 計数後、ステップ1.9と同様に細胞懸濁液中の細胞濃度に応じて、500 x g の卓上遠心分離機で細胞を4°Cで5分間ペレット化し、Indo-1 AMエステル色素を含むcRMPI培地の添加を調製した。
  11. 細胞の再懸濁のための容量を計算して、10-12 x 106 細胞/ mLを達成します。これは、必要な総細胞数の2倍の濃度です。
  12. ステップ1.11で計算されたcRPMIの体積のセルを再懸濁します。細胞を5%CO2 で37°Cで、蓋を通気した50 mLコニカルチューブまたは組織培養プレートに入れます。

2. インド-1レシオメトリック色素および蛍光抗体標識

  1. 製造元の指示に従って、50 μgのインド-1 AMを含むバイアルに50 μLのDMSOを追加します。原液の濃度は1μg/μLです。
    注:DMSOは、DMSOの酸化を防ぐためにキットに付属のマイクロバイアルで提供されます。
  2. ストックアリコート(1 μg / μL)を適切な実験容量(1.11で確立)のcRPMIに6 μg / mLの濃度、2倍の濃度で希釈します。Indo-1を水溶液に保管しないでください。
    注:カルシウムを添加した他のバッファーは、細胞のニーズに応じて使用できます。
  3. Indo-1を含む完全な培地を37°Cの水浴中に置いておきます。
    注:適切なシグナルを得るために必要なIndo-1 AMエステルの最小濃度を使用してください。これは、さまざまな細胞タイプに対して滴定する必要があります。典型的には、3〜5μMの濃度で十分です。初代T細胞の場合、Indo-1を>5 μg/mLの濃度で細胞に負荷すると、スペクトルフローサイトメーターで平均蛍光強度(MFI)がlog6より高くなります。これが発生した場合は、UVレーザー強度を下げ、Indo-1をより低い濃度に滴定してください。
  4. 事前に調製した細胞懸濁液(ステップ1.12)を、ステップ2.2で作成した2x Indo-1培地を含むcRPMIで1:1に希釈します。細胞が5〜6 x 106 / mLの濃度であることを確認してください。
    注意: Indo-1を使用して、染色されていないシングルステインコントロールまたは表面マーカーのシングルステインセルコントロールをロードして染色しないでください。Indo-1を単一染色抗体コントロールに追加すると、Indo-1が単一染色細胞に添加されるため、マルチカラーサンプルが作成されます。ステップ2.6で作成したサンプルプレートにindo-1(カルシウムフリー)EGTA添加コントロールを含めます。
  5. 1 mLの細胞/ウェル/実験条件を12ウェル組織培養プレートに加えます。
  6. 以前にIndo-1色素をロードした細胞を使用して、Indo-1(カルシウムフリー)サンプルの単一染色コントロールを作成し、EGTAを最終濃度2 mMまで添加します。EGTAは細胞懸濁液中のカルシウムをキレートし、よりクリーンな対照サンプルを提供します。
    1. フローサイトメーターで色素を装填した細胞懸濁液に50 μMのイオノマイシンを添加することにより、Indo-1ポジティブコントロール(Indo-1カルシウム結合)を作成します。イオノマイシンは、カルシウムイオンを結合し、細胞へのカルシウムイオンの移動を促進する膜透過性カルシウムイオノフォアです。
  7. 蛍光色素やIndo-1色素を含まない生物学的陰性対照用のウェルを作成します。
  8. フローサイトメトリーパネルデザインで抗体結合蛍光色素を使用して、目的の追加の細胞集団(ユーザー定義の抗体)の単一染色コントロール用のウェルを作成します。これらには、Indo-1レシオメトリック色素は含まれません。
  9. 表面染色用の蛍光色素結合抗体を追加する前に、製造元の指示に従ってFc受容体遮断抗体(~2 μg/1 x 106 細胞)を追加します。
  10. プレートを5%CO2で37°Cで45分間インキュベートします。
  11. 15分ごとにプレートを軽くたたき、12ウェルプレートに細胞を再懸濁します。
  12. 培地に懸濁した細胞の全容量を混合し、12ウェルプレートから除去します。次に、細胞懸濁液を1.7 mLの微量遠心チューブに加えます。
  13. 細胞を500 x g の微量遠心分離機で室温で5分間ペレット化します。上清をデカントし、1 mLの予め温めたcRPMIを加えて細胞を洗浄します。再度ペレット化し、上清をデカントする。
    注:細胞を洗浄すると、残っているFCブロッキング抗体がすべて除去されます。
  14. 細胞を1.7 mLマイクロ遠心チューブ内の1 mLのcRPMIに再懸濁し、各チューブを37°Cで5%CO2でさらに30分間インキュベートし、チューブの上部をわずかに開いたままにしてガス交換を可能にします。これにより、細胞内AMエステルの完全な脱エステル化が可能になる。
  15. 必要に応じて、細胞を12ウェル組織培養プレートに戻します。追加のユーザー定義の滴定蛍光色素結合抗体は、休止期に追加できます。
    注:メソッドパネルで使用されるマーカーには、ゴースト540、CD4、CD8、TCRβ、TCRγδ、CD25、およびCD1d / α-galcerテトラマーが含まれます。マーカーは、T細胞サブセットを分析するために選択されます。
    1. 目的の細胞タイプに応じて、すべてのユーザー定義の蛍光色素結合抗体のマスターミックスを、事前に滴定した容量で1.7 mLのマイクロ遠心チューブに作成します。
    2. 休止細胞に対する滴定抗体に応じて、細胞容量1 mLの計算されたマスターミックスを追加します。
      注:後のステップ2.18ではなくステップ2.15で染色する利点は、ステップ2.15で染色すると、実験の全体的なインキュベーション時間が短縮されることです。ただし、ステップ2.15で総量1 mLで染色すると、抗体の使用量が増加します。
  16. 休息後、細胞を500 x g で室温で5分間ペレット化します。
    注:12ウェル組織培養プレート内の細胞は、プレート遠心分離機アクセサリを使用してプレート内でペレット化できます。それ以外の場合は、1.7 mLの微量遠心チューブで細胞をペレット化します。
  17. ペレットを1 mLの4°C冷cRPMIに再懸濁して細胞を洗浄し、ステップ2.16と同様に細胞を再度ペレット化する。セルを氷の上に置きます。
    注:細胞を別々に表面染色する場合、ステップ2.18で脱エステル化後、必要な抗体量は少なくなります。このステップでの表面染色は、コールドフローバッファー(1%FBSを添加した1x DPBS)の休止段階の後に、ユーザー定義の抗体を使用して、氷上で30分間実行できます。ステップ2.17のようにcRPMIで染色後の細胞を洗浄します。
    1. 製造元の指示に従って、DPBSで1:7,500に希釈した生存率染色剤Ghost540をサンプルに追加します。加温ブロック上で55°Cで細胞を熱死滅させ、単一染色の生/死対照を行います。
      注:フローサイトメトリー解析で死細胞を除去するための生存機能色素染色は、FBSなしで実行されます。FBSは、製造元の指示に従ってアミン染料と相互作用することができます。
  18. キャップ付きの5 mLポリスチレンフローチューブを使用して、個々のサンプルを500 μLのcRPMI(フェノールレッドフリー)に再懸濁します。
    注:細胞は4°Cで最大1時間放置できます。
  19. 細胞を含む5 mLチューブごとに、個別に、フローサイトメーターでの分析の前にビーズバスを使用して37°Cに温め、サンプル間で時間を一定に保ちます。タイマーを使用します。

3.ビーズバスチューブ:カルシウムフラックス分析中の温度維持

  1. 水を加えずに、小さな水浴にバスビーズを追加します。37°Cまで温めます。
  2. 50 mLのコニカルチューブを25 mLのマークで半分に、かみそりの刃で慎重に切断します。チューブの上部を廃棄します。
  3. 半分にしたチューブを3/4のバスビーズで満たします。
  4. 手順3.2で作成したチューブを、手順3.1で作成したビーズバスに入れます。チューブとビーズを37°Cにします。
  5. サンプル分析の準備のために温度を維持するために、ビーズバスをフローサイトメーターの隣のコンセントに差し込みます。
  6. 50 mLの円錐形発泡スチロールラックカットを追加して1本のチューブを保持し、フローサイトメーターで走行中にチューブを所定の位置に配置します。これにより、曲線解析中にチューブを手動で保持する必要がなくなります。

4. フローサイトメトリー解析によるカルシウム流入の獲得

  1. フローアナライザーでフローサイトメーターソフトウェアにログインします。
  2. [ライブラリ]タブをクリックして、Indo-1(カルシウム結合)およびIndo-1(カルシウムフリー)蛍光タグを追加します。左側のソフトウェアメニューで蛍光タグを選択します。蛍光タググループでUVレーザーを選択し、+追加をクリックして蛍光タグ名(インド-1(カルシウム結合)/インド-1(カルシウムフリー))をライブラリに追加します。レーザー励起波長と発光波長を選択し、[保存]をクリックします。実験的なセットアップに進みます。
    注:インド-1は、波長355nmのUVレーザーによって励起されます。インド-1(カルシウム結合)の発光波長は372nmです。インド-1(カルシウムフリー)の発光波長は514nmです。
  3. [ 取得]タブをクリックします。新しい実験を開く/作成し、目的の蛍光タグを実験に追加します。
  4. 実験用の参照グループと新しいサンプルグループを作成します。必要に応じて、サンプルと参照グループの両方にラベルを付けます。
  5. [取得] タブで、記録するイベントを最大 10,000,000 に設定します。
  6. 停止容量を最大容量3,000μLに設定してください。
  7. 停止時間を最大時間(36,000秒)に設定します。
  8. マルチカラーパネルに含まれる定義された結合抗体の単一染色コントロールを取得します。
  9. Indo-1機能性色素の単一染色コントロールを取得します。
    1. カルシウム結合インド-1ポジティブコントロールに50μMのイオノマイシンを追加します。混合する渦。フローチューブをサンプル注入ポートに追加し、[ 記録]をクリックします。
    2. カルシウムフリーのIndo-1ネガティブコントロールをフローサイトメーターに追加し、[ 記録]をクリックします。EGTAはステップ2.6で追加されました。
    3. 汚れた単一のコントロールをアンミックスするには、[ アンミックス ]ボタンをクリックします。
      注:サンプルをアンミキシングする前に、すべてのコンジュゲート抗体および機能性色素からのすべての単一染色コントロールを記録する必要があります。[アンミックス]ボタンを機能させるには、すべてのリファレンスコントロールを最初に記録する必要があります。混合解除は、サンプル収集の前または後に行うことができます。
  10. 混合解除が完了したら、混合されていないワークシートを使用してシーケンシャルプロットを作成します。サンプルから破片を除去するためのSSC-A対FSC-A、ダブレットを除去するためのSSC-A対SSC-H。これに続いて、生存率のクリーンアップゲートと、関心のある集団のさらなるゲートが続きます。ゲートを作成するには、 プロットをクリックします。ワークシートにプロットを追加し、ゲート内をダブルクリックして下流のゲート母集団を作成します。関心のあるすべての母集団が考慮されるまで続けます。
  11. 単一染色したコントロールサンプル(Indo-1レシオメトリック色素および蛍光抗体標識のセクションのステップ2.6〜2.9から)を37°Cに温めて、順次分析します。フローサイトメトリーソフトウェアをセットアップします。
  12. サイトメーターでDI水を2〜3分間流して、フローサイトメーターの流動性を確保します。
  13. 混合されていないワークシートにシーケンシャルプロットを設定するには、 ポリゴン、長方形、または楕円のゲートボタンを使用してゲートを作成します。関心のある集団(すなわち、SSC-A対FSC-A[サイズ/リンパ球の識別]を使用するリンパ球)を含めるゲート。負の集団はゼロの周りにクラスター化されているように見えますが、陽性の母集団はMFIを増やすことで視覚化できます。関心のある集団は、生物学的な質問に基づいてユーザー定義されます。
  14. 作成したゲート内をダブルクリックし、Y軸とX軸のパラメータをSSC-A対SSC-H(一重項判別)に変更します。軸上の単語を左クリックして、軸パラメータの定義を完了します。
  15. SSC-A対生存率色素シグナル(生存率ゲートパラメータ)のプロットを作成します。アミン色素染色陰性の生細胞の ゲート 。生死染色陰性の生細胞は、Y軸とX軸の両方で0マークにクラスター化します。
  16. 内側のプロットをダブルクリックして、単一細胞の生リンパ球のみを含む新しいプロットを作成します。カルシウム流入を視覚化するために、X 軸の時間に対して Y 軸をインド 1 (結合カルシウム) (V1) および/またはインド 1 (遊離カルシウム) (V7) に変更します。
  17. 加温した生物学的サンプルをマシンSITに置き、培地上で2,500〜3,000イベント/秒でサンプルを実行して、限られた細胞数集団(iNKTなど)におけるカルシウム流入を視覚化できるようにします。
    注:細胞を1 x 106 / mLの濃度で再懸濁することにより、中程度の流速で収集された細胞イベントは2,500〜3,000イベント/秒に等しくなります。ドロップダウンメニューをクリックして取得制御下で流速を下げるか、細胞懸濁液の濃度が上昇している場合はサンプルを希釈します。サンプルを高流速で実行すると、パネル内の1つの蛍光色素から他の蛍光色素へのシグナルの拡散が促進されます。
  18. 次のチューブをビーズバスに追加して37°Cに温めます。
  19. 取得コントロールで、記録を押して初期データを30秒間記録し、サンプル中のカルシウムシグナル伝達の基礎レベルを取得します。
  20. 取得コントロールで、[停止]をクリックし、サンプル注入ポート(SIP)からチューブを取り外します。
  21. 30 μgの非抱合型抗CD3をサンプルチューブに直接添加して、カルシウム流入を開始します。チューブあたりの最終濃度は60μg/mLです。
    注:抗CD3を添加した後の洗浄ステップはありません。
  22. チューブをできるだけ早くマシンSIPに戻し、ソフトウェアの [記録 ]を押します。
  23. 7分間データを記録し、ソフトウェア内の取得コントロール下で経過時間を観察し、サンプル集団内のカルシウム流入の経時変化を観察した。
  24. 7分後、ソフトウェアの 停止 を押して、1 μg/mLのイオノマイシンを加えます。30秒間記録して、目的の細胞における最大カルシウムシグナルを得る。次のサンプルへのイオノミシンのキャリーオーバーを制限するには、サンプル間で装置で2回のSITフラッシュを完了します。
  25. 次のサンプルに進み、すべてのサンプルが収集されるまでワークフローを繰り返します。
  26. 実験を保存し、 エクスポート zip ファイルをクリックします。混合されていないファイル(.fsc)は、外部のフローサイトメトリー分析ソフトウェアにアップロードされます。

5. カルシウム曲線分析

  1. フローサイトメトリー用の解析ソフトウェア6 を用いて、Indo-1蛍光シグナルをタイムラプスカルシウム測定用の比率に変換する。[ツール]タブでパラメータを導出するには、線形スケールを使用して参照Indo-1(カルシウム結合)/Indo-1(遊離カルシウム)を挿入します。カルシウムの流入率に応じて最小値をゼロに設定し、最大値を約10に設定します。最大比は、Indo-1の細胞タイプおよびMFIによって異なる。
  2. 選択したパラメータをハイライト表示します。ツールで、動力学解析を追加し、[ 動力学 ]タブをクリックしてパラメータを選択します。Y 軸を派生に設定します。
  3. [動力学]タブ内でMFI(平均蛍光強度)を選択します。
  4. 必要に応じて、ガウス平滑化を追加します。ガウス平滑化を追加するには、フロー解析ソフトウェアのプルダウン統計メニューでオプションを選択します。分析のカルシウム流入曲線の視覚化を滑らかにするために、ガウス平滑化を追加することができます。
  5. サンプル内の生物学的比較のために、カルシウムフラックスの時間経過に沿って統計の複数の範囲を作成します。
  6. サンプルをレイアウトエディターにドラッグし、必要に応じて統計を追加します。統計分析は生物学的な問題によって異なります。公開の目的で、複数の反復が t検定またはANOVAを使用して分析されます。
  7. モーメントオブタイム解析では、カルシウムフラックスに沿った特定のモーメントにゲートを設定します。目的のサーフェスマーカーとゲートを関心のある母集団で調べます。次に、時間領域のその瞬間のゲート細胞について、インド-1(カルシウムフリー)とインド-1(カルシウム結合)の2次元ドットプロットを評価します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

マルチプレックス表面染色を有するIndo-1レシオメトリック色素を用いて初代マウスT細胞におけるカルシウム応答を評価する実験ワークフローを 図1に示す。マウス脾細胞を回収し、単一細胞懸濁液に加工した後、細胞をIndo-1 AMエステルで染色し、蛍光色素結合抗体で表面染色します。色素の装填と抗体染色が完了したら、リンパ球サンプルを生物学的温度(37°C)まで温めます。次に、分析前にサンプルを選別することなく、目的の個々の細胞タイプをゲーティングした後、Indo-1蛍光のフルスペクトルフローサイトメトリーを使用してサンプルを分析します。フルスペクトルフローサイトメーター内でアバランシェフォトダイオード(APD)検出器を使用するには、nm単位で測定されたバンドパスフィルター波長からのピーク発光波長をAPD上のそれぞれのチャネルに変換する必要があります。図2に示す表はガイドラインを示していますが、インド-1の 2 つの蛍光シグネチャ(カルシウム結合とカルシウムフリー)に最適な検出器は経験的に決定する必要があります。これは、イオ...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

このプロトコルは、フルスペクトルフローサイトメトリー7,8を使用して滴定されたIndo-1レシオメトリックインジケーター色素をロードした初代マウスT細胞におけるカルシウム応答を測定するために設計された最適化されたアッセイについて説明しています。フルスペクトルフローサイトメトリーを使用してカルシウムフラックスアッセイを実施する利点は、Indo-1蛍光の評価と組み合わせて表面細胞マーカー染色をマルチプレックスできることです。フルスペクトルフローサイトメトリーには、重なり合った色素を使用できるため、パネルで使用できるマーカーの数が増えるという利点があります。これは、フルスペクトルフローサイトメーターが、1つの蛍光色素専用の検出器を持つのではなく、分析された各サンプルの検出器のアレイにわたって放出されるすべてのレーザー光を収集するという事実によるものです。各蛍光の全スペクトルを使用することで、アッセイの感度を高めることができ、バンドパスフローサイトメーターで収集した場合にシグナルが重複するスペクトル固有の蛍光色素を同定する手段が...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者は宣言する競合する利益を持っていません。

謝辞

R01AI132419, CU |AMC ImmunoMicro Flow Cytometry共有リソース、RRID:SCR_021321、AuroraおよびSpectroFloソフトウェアでのフルスペクトルサイトメトリー分析の継続的な議論を提供してくれたCytekの同僚に感謝します。図は BioRender.com で作成されました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
12ウェルTC処理プレート細胞治療229111
50mL 円錐形Greiner Bio141-12-17-0350 mL ポリプロピレン遠心分離管 キャップ付き
5mL ポリステレンフローチューブコーニング352052
5mL シリンジBDシリンジ309646プランジャーのみ使用 sheith は廃棄されます
70uM フィルターGreiner bio1542070
aCD3 (17A2)Biolegend100202
AKC 溶解バッファーGibcoA1049201
Aurora Spectral Flowcytometerhttps://cytekbio.com/pages/aurora
Bath Beadscoleparmerアイテム # UX-06274-52
CD19 PETonbo50-0193-U100
CD1d Tetramer APCNIH
CD25 PECy7ebioscience15-0251
CD4 APC Cy7とんぼ25-0042-U100
CD8a FITCebioscience11-0081-85
Cell IncubatorFormal Scientific
Dissection Tools 鉗子McKesson#487593組織鉗子マッケソンアドソン4-3 / 4インチ長さオフィスグレードステンレス鋼非滅菌非ロッキングサムハンドル1 x 2歯
解剖ツールハサミMcKesson#970135手術はさみMcKesson Argent™ 4-1 / 2インチ外科グレードステンレス鋼指輪ハンドルストレートシャープチップ/シャープチップ
DPBS 1xGibco14190-136DPBS 
EGTAフィッシャーNC1280093
FBSハイクロンドSH30071.03AE29165301ロット
FlowJoソフトウェアhttps://www.flowjo.com/
Indo1-AMエステル染料ebioscience65-085-39カルシウムローディング染料 
イオノマイシンミリポア407951-1mg
ライブ/デッドゴースト540とんぼ13-0879-T100
マイクロ遠心チューブ1.7mLラボA-7001
ペニシリン/ストレプトマイシン/ L-グルタミンGibco10378-016
PRN694Med Chem ExpressHy-12688精製
抗マウスCD16 / CD32(FCシールド)(2.4G2)とんぼ70-0161-M001FC ブロック
RPMIGibco1875093 + フェノールレッド
RPMI フェノールフリーGibco11835030 -フェノールレッド
卓上遠心分離機ベックマン・コールターアレグラ612
TCR&β;PerCP Cy5.5ebioscience45-5961-82
TCRγ/δPe Cy5ebioscience15-5961-82
Vi-Cell Blu 試薬パック製品番号:C06019Tripan
Vi-Cell BluBeckman Coulter
WaterbathFisher Brand ドライバス
ライト

参考文献

  1. Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
  2. Huang, G. N. Cell calcium mobilization study (flow cytometry). Bio-Protocol. 2 (9), 171(2012).
  3. June, C. H., Moore, J. S. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , Chapter 5, Unit 5.5 (2004).
  4. Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).
  5. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  6. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
  7. Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit1.27 (2013).
  8. Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801(2021).
  9. Zhong, Y., et al. Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).
  10. Gallagher, M. P., et al. Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118(2021).
  11. Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287(2010).
  12. Nakamura, Y. EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels. Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26(2019).
  13. Cytek Aurora Users Guide. Cytek. , Available from: https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf (2022).
  14. SpctroFlo Software. Cytek. , Available from: https://cytekbio.com/pages/spectro-flo (2022).
  15. FlowJo Software. Becton-Dickinson. , Available from: https://www.flowjo.com/solutions/flowjo (2022).
  16. Godfrey, D. I., Zlotnik, A. Control points in early T-cell development. Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).
  17. Vossen, A. C., et al. Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects. European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

T細胞カルシウム流入カルシウムインジケーター色素Indo-1染色抗CD3刺激カルシウムフラックス解析細胞表面マーカー多色フローサイトメトリーT細胞サブセット
フルスペクトルフローサイトメトリーによる初代マウスT細胞におけるT細胞受容体誘導性カルシウム流入の解析
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。