軟体動物からの粗および清澄抽出物の推定抗クリプトコッカス特性の評価

Summary

ヒト真菌病原体クリプ トコッカス・ネオフォルマンスは 、宿主内での生存を促進するために様々な病原性因子(例えば、ペプチダーゼ)を産生する。環境ニッチは、新規天然ペプチダーゼ阻害剤の有望な供給源です。このプロトコルは、軟体動物からの抽出物の調製と真菌病原性因子産生に対するそれらの効果の評価を概説しています。

Abstract

クリプトコッカスネオフォルマンスは 、主に免疫不全の個人に感染する世界的な分布を持つカプセル化されたヒト真菌病原体です。臨床現場での抗真菌剤の広範な使用、農業での使用、および株のハイブリダイゼーションにより、耐性の進化が進んでいます。抗真菌剤に対する耐性のこの上昇率は、世界中の臨床医や科学者の間で懸念が高まっており、新しい抗真菌療法を開発する緊急性が高まっています。例えば、 C. neoformans は、組織分解、細胞調節、および栄養素獲得に関与する細胞内および細胞外の酵素(ペプチダーゼなど)を含むいくつかの病原性因子を産生します。阻害剤によるこのようなペプチダーゼ活性の破壊は、真菌の増殖と増殖を阻害し、これが病原体と戦うための重要な戦略である可能性があることを示唆しています。重要なことに、軟体動物などの無脊椎動物は、生物医学的用途と抗菌活性を備えたペプチダーゼ阻害剤を産生しますが、真菌病原体に対する使用法に関しては未調査です。このプロトコルでは、軟体動物からの全体的な抽出を実施して、粗抽出物および清澄抽出物中の潜在的なペプチダーゼ阻害剤を分離し、古典的なクリプトコッカス病原性因子に対するそれらの効果を評価しました。この方法は、抗真菌特性を持つ軟体動物の優先順位付けをサポートし、軟体動物に見られる天然の阻害剤を利用することにより、抗病原性剤の発見の機会を提供します。

Introduction

クリプトコッカス・ネオフォルマンスは、HIV/AIDS陽性者などの免疫不全宿主に重篤な疾患を引き起こすヒト真菌病原体^であり1、エイズ関連の死亡の約19%につながります²。真菌は、アゾール、ポリエン、フルシトシンを含むいくつかのクラスの抗真菌剤の影響を受けやすく、これらは異なるメカニズムを使用して殺菌および静真菌活性を発揮します^3,4。しかし、臨床および農業現場での抗真菌剤の広範な使用と株のハイブリダイゼーションの組み合わせにより、C. neoformans⁵を含む複数の真菌種における耐性の進化が増幅されました。

抗真菌耐性の課題を克服し、世界規模で真菌感染症の有病率を減らすために、有望なアプローチは、クリプトコッカス属の病原性因子(温度適応性、多糖カプセル、メラニン、細胞外酵素など)を潜在的な治療標的として使用することです^4,6。.これらの病原性因子は文献で十分に特徴付けられており、これらの因子を標的とすることで、細胞増殖を標的とするのではなく、病原性を損なうことによってより弱い選択圧を課すことによって抗真菌耐性の速度を低下させる可能性があるため、このアプローチにはいくつかの利点があります⁶。これに関連して、多くの研究が、クリプトコッカス属の病原性を低下または阻害するために細胞外酵素(例えば、プロテアーゼ、ペプチダーゼ)を標的とする可能性を評価し^{ている7,8,9}。

無脊椎動物や植物のような生物は、病原体から身を守るための適応免疫システムを持っていません。しかし、彼らは微生物や捕食者に対処するために、膨大な数の化合物を含む強力な自然免疫システムに依存しています¹⁰。これらの分子には、血リンパの凝固、サイトカインや抗菌ペプチドの合成、病原体のプロテアーゼを直接不活性化することによる宿主の保護など、無脊椎動物免疫の細胞プロセスなど、多くの生物学的システムで重要な役割を果たすペプチダーゼ阻害剤が含まれます¹¹。したがって、軟体動物などの無脊椎動物由来のペプチダーゼ阻害剤は、潜在的な生物医学的用途を有するが、多くは特徴付けられていない^{ままである10,12,13}。これに関連して、オンタリオ州には約34種の陸生軟体動物がおり、カナダには180種の淡水軟体動物がいます¹⁴。ただし、それらの詳細なプロファイリングと特性評価はまだ限られています¹⁵。これらの生物は、潜在的な抗真菌活性を有する新規化合物の同定の機会を提供する¹⁰。

このプロトコールでは、無脊椎動物(例えば、軟体動物)からの抽出物を単離および清澄化し(図1)、続いて推定ペプチダーゼ阻害活性を測定する方法が記載されている。次に、これらの抽出物の抗真菌特性は、表現型アッセイを使用して C.ネオフォルマンスの 病原性因子産生への影響を測定することによって評価されます(図2)。粗抽出物と清澄抽出物の抗真菌特性の違いは、軟体動物の微生物因子(例えば、宿主微生物叢によって産生される二次代謝産物または毒素)を示している可能性があり、実験観察に影響を与える可能性があることに注意することが重要です。.このような知見は、このプロトコルが粗抽出物と清澄抽出物の両方を独立して評価して作用機序を解明する必要性を裏付けています。さらに、抽出プロセスは偏りがなく、多数の真菌および細菌性病原体に対する抗菌特性の検出を可能にする可能性があります。したがって、このプロトコルは、 C.ネオフォルマンス に対する抗真菌特性を持つ軟体動物種の優先順位付けの開始点を提供し、推定阻害メカニズムを通じて酵素活性と病原性因子産生との関係を評価する機会を提供します。

Protocol

1.軟体動物からのタンパク質抽出

1. 指定および承認された自然地域(オンタリオ州グエルフのスピードリバーなど)から軟体動物を収集します。この研究では、在来種と侵入種の両方を選択して、幅広い潜在的な抗真菌効果を評価しました。
2. 乳棒と乳鉢を使用して軟体動物の殻(例: Cepaea nemoralis、 Planorbella pilsbryi 、 Cipangopaludina chinensis)をそっと破り、ピンセットで固形片を取り除きます。一般に、10匹の軟体動物は、プロトコル全体で使用するためにプールされます。
3. 臓器を集めて計量します。約15〜20 gのサンプルが最適です。はさみを使用して、臓器を約0.5〜1 cmの大きさの小片に切ります。
4. 解剖および切断した臓器サンプルを液体窒素でフラッシュフリーズします。次に、乳棒と乳鉢を使用して臓器サンプルを微粉末に粉砕します。
5. 臓器サンプル粉末(約15 g)を30 mLの冷蒸留水(4°C)に加えて、1:2の比率(w / v)にします。
6. 2 mLのサンプルを耐衝撃性2 mLチューブに注ぎます。各チューブに3 mmのステンレス鋼ビーズ(約500 μg)をスクープし、ブレンダー( 材料表を参照)を使用して1,200 rpmおよび4°Cで3分間ホモジナイズします。
7. 12,000 × g で4°Cで20分間遠心分離します。 すべての上清をピペットで新鮮な50 mLチューブに集め、ペレットを捨てます。
8. 0.22 μmメンブレンを使用して上清をフィルター滅菌します。サンプルを氷上に保管し、必要に応じて清澄化プロトコル(セクション2)に進みます。
   注:サンプルは液体窒素中で瞬間凍結し、-20°Cで保存して粗抽出物として使用できます。

2.軟体動物抽出物の清澄化

1. ステップ1.8の上清サンプルを60°Cの温熱浴に30分間入れます。次に、サンプルを氷の入ったバケツに20分間移してすばやく冷却します。
2. サンプルを15,000 × g で4°Cで45分間遠心分離します。 上清を新鮮な50mLチューブに集め、ペレットを廃棄します。0.22 μmのメンブレンフィルターを使用してサンプルをフィルター滅菌し、氷上に保管します。
3. 定量アッセイ(例えば、ビシンコニン酸アッセイ¹⁷)を用いて、ステップ1.8(すなわち、粗抽出物)およびステップ2.2(すなわち、清澄化抽出物)からの試料中のタンパク質濃度を決定する。最適なタンパク質濃度範囲は4〜8 mg / mLです。
4. サンプルを氷上で最大1時間保存するか、液体窒素中で瞬間凍結し、必要になるまで-20°Cで保存します。

3. 阻害活性アッセイ

1. 粗抽出物および清澄抽出物の阻害活性を、技術的な三重の酵素アッセイを使用して測定します。
   注:各酵素アッセイは、酵素(例:真菌の病原性に関与するサブチリシンA16,17,18;通常、発色ベースのアッセイでは約1 x 10⁻⁹ mol / L)、バッファー、および基質で構成されています。基質が酵素に遭遇すると反応が始まります。酵素活性は、生成物への基質変換速度に比例する。
2. 両方のパラメーター間に線形依存性が得られるまで、酵素活性(EA)に対する酵素濃度(EC)の効果を評価します。次のステップでは、測定された直線範囲内の酵素濃度を使用します。
   注:ペプチダーゼサチライシンAの酵素アッセイは、次の手順で詳しく説明します。
3. 粗精製(ステップ1.11)または清澄化(ステップ2.5)軟体動物タンパク質抽出物(例:4 mg/mLタンパク質を含む10 μL)を10 μLのサチライシンA(ステップ3.2から決定された濃度)と、pH 8.6で220 μLの100 mM Tris-HCl(対照のために、抽出物を添加せずに230 μLのTrisバッファーを追加)を96ウェル平底プレートで25°Cで10分間インキュベートします。
4. 最終反応容量250 μLに対して、サブチリシンAの基質であるN-スクシニル-アラ-アラ-プロ-Phe-p-ニトロアニリドを終濃度1 K_m (ミカエリス・メンテン定数;この基質のサチライシンAは0.2 mM)で10 μL加えます。
5. 405 nmの光学密度(OD)を15秒ごとに3分間読み取ることにより、製品の外観を経時的に監視することにより、酵素活性を測定します。
6. 軟体動物抽出物の存在下での酵素活性と抽出物の非存在下での酵素活性の比を計算することにより、残存酵素活性を決定します。
7. 阻害活性が観察された場合(すなわち、残存活性が1未満である場合)、標準方法¹⁹に従って、抽出物の濃度範囲(例えば、200 μg/mLから1 μg/mLまでの2倍希釈系列)を使用して阻害濃度_50(IC50)値を測定します。

4. 軟体動物抽出物が C. neoformans の生育に及ぼす影響

1. 10 μLのピペットチップを使用して、 C. neoformans var. grubii H99野生型(WT)の単一コロニーを5 mLの酵母エキス-ペプトン-デキストロース(YPD)培地(10 g/L酵母エキス、20 g/Lペプトン、および20 g/Lデキストロース、pH 6.5)に導入し、30°Cおよび200 rpmで16〜18時間インキュベートします。生物学的三重および技術的複製で実験を行う。
2. 培養液500 μLをキュベットに集め、600 nmでODを読み取ることで増殖を測定します。培養液を酵母窒素塩基(YNB)培地で最終OD₆₀₀ 0.02に希釈します。
3. C. neoformans細胞を異なる濃度の抽出物(例えば、440 μg/mLから15 μg/mLタンパク質までの3倍希釈系列)との共培養(すなわち、粗精製および清澄化)。これを行うには、10 μLの抽出物を190 μLの希釈C.ネオフォルマンス培養物(ステップ4.2)と96ウェルプレートで混合します。
4. プレートリーダーを使用してOD₆₀₀ を15分から1時間ごとに200rpmおよび37°Cで72時間読み取り、成長を測定します。

5. 軟体動物抽出物が C.ネオフォルマンス メラニン産生に及ぼす影響

1. L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン(L-DOPA)プレートを準備します。
   1. 14 g / L寒天のオートクレーブ230 mL、50〜60°Cに達するまで冷却します。
   2. 3.25 mLの1 Mグリシン、7.35 mLの1 M KH 2 PO 4、2.5 mLの1 M MgSO_4.7H 2 O、0.6 mLの40%グルコース、70 μLの10 mMチアミン、および_2.5mLの100 mM L-DOPA(フィルター滅菌)を液体寒天に加えます。
   3. 15 mLの混合物をペトリプレートに注ぎ、暗所で約1時間乾燥させ、2〜4°Cで最大1週間保管します。寒天が適切に乾くように、蓋が部分的に持ち上げられていることを確認してください。
2. 5 mLのYNB培地に、ステップ4.1の C.ネオフォルマンス 培養物50 μLを接種します。30°Cおよび200rpmで16〜18時間インキュベートします。
3. セルを1,000 × g で4°Cで5分間スピンダウンします。細胞をpH 7.4の滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄します。
4. 血球計算盤を使用して細胞をカウントします。細胞を1 mLのPBSに再懸濁して、最終濃度10⁶ 細胞/mLに到達します。
5. 粗および清澄化された軟体動物抽出物の希釈シリーズ(例えば、2倍)を調製する。同様に、96ウェルプレートの滅菌PBSを使用して、1 x 10⁶細胞/mLから1 x 10¹細胞/mLまでのC.ネオフォルマンス細胞の10倍希釈シリーズ(ステップ5.4)を調製します。
6. 抽出物200 μLをL-DOPA寒天培地を含むペトリプレートに綿棒で広げ、15分間乾燥させます。
7. 各ウェルから5 μLの培養液をL-DOPAプレートにスポットし、ドロップ間に1 cmを残します。暗所で15分間乾かします。
8. プレートを静的インキュベーター内で30°Cおよび37°Cで3〜5日間インキュベートし、カメラまたはプレートイメージャー(スキャナーなど)で24時間ごとに画像をキャプチャします。
   注:ここでは、軟体動物抽出物の成長抑制効果に対する温度の影響を調べるために、30°Cが環境温度を表し、37°Cが人間の生理学的温度を表す2つの温度条件が使用されます。

6. 軟体動物抽出物が C. neoformans 多糖カプセル産生に及ぼす影響

1. 下記のように低鉄媒体(LIM)を調製する。
   1. 5gのキレート樹脂( 材料表参照)を60mLの超純水に溶解し、ガラスカラム(直径2cm×長さ25cm)にパックします。カラムを100mLの水で洗浄し、回収した水を廃棄します。
   2. 2Lの滅菌超純水をキレートカラムに通して、低鉄水(LI-水)を調製します。LI水を4°Cで最大3か月間保管します。
   3. 5 gのグルコースを100 mLのLI水に溶解します。5 gのL-アスパラギンを別のビーカーの200 mLのLI水に溶かします。
   4. 500 mLのLI水に、HEPES4.78 g、K 2 HPO 4 0.4 g、MgSO_4.7H 2_O0.08g、NaHCO 3 1.85 g、CaCl 2.2H ₂ Oを0.25 gの順に添加します。
   5. ステップ 6.1.3 とステップ 6.1.4 のソリューションを組み合わせます。100 mMバソフェナントロリンジスルホン酸ナトリウム塩(BPS)を最終濃度100 μMまで1 mL加えます。
   6. 1 M LI-MOPS で pH を 7.2 に調整します。最終容量1 LまでLI水を加え、0.22 μmのメンブレンに通して培地をろ過滅菌します。100 μLの滅菌チアミン(4 mg / mL)を培地に加えます。
2. 5 mLのYNB培地に、ステップ4.1の C.ネオフォルマンス 培養液50 μLを接種します。30°Cおよび200rpmで16〜18時間インキュベートします。この培養液を使用して、5 mLのLIMを最終濃度10⁵ 細胞/mLに接種します。
3. 適切な量の軟体動物抽出物(例えば、2倍希釈または以前の病原性アッセイから決定された量)を加えて、所望の濃度に達する。キャップを緩めた状態で37°C、200rpmで72時間インキュベートします。インキュベーション後、1 mLの細胞を集め、滅菌PBS、pH 7.4、1,500 × g で4°Cで2分間洗浄します。
4. 細胞を1 mLのPBSに静かに再懸濁します。細胞をインディアインクと1:1の比率で混合します(例:4 μLのインディアインクと4 μLの細胞懸濁液)ガラス顕微鏡スライド上で。スライドの上にカバーガラスを置きます。
5. 63倍の油性対物レンズを備えた微分干渉コントラスト(DIC)顕微鏡を使用してサンプルを視覚化します( 材料表を参照)。コントラストを自動に設定し、顕微鏡ダイヤルを使用して手動で焦点を合わせます。すべての画像を選択し、TIFF形式でエクスポートします。フィルターを適用する必要はありません。
6. ImageJ²⁰の定規ツールを使用して、細胞体サイズに対する合計細胞サイズ(カプセルを含む)の比率を定量化します。

7. 軟体動物抽出物が C. neoformans バイオフィルム産生に及ぼす影響

1. 5 mLのYNB培地に、ステップ4.1の C.ネオフォルマンス 培養物50 μLを接種します。30°Cおよび200rpmで16〜18時間インキュベートします。
2. 5 mL 培養液から細胞を回収します。細胞を滅菌PBS、pH 7.4、1,500 × g で4°Cで2分間洗浄します。
3. 血球計算盤を使用して細胞をカウントします。3 mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で細胞を最終濃度10⁷ 細胞/ mLまで再懸濁します。
4. 300 μLの細胞懸濁液を、滅菌済みのポリスチレン平底24ウェルプレートの個々のウェルに移します。コントロールとしてのみ培地を含むウェルを使用してください。
5. 軟体動物抽出物の適切な量(例えば、2倍希釈または以前の病原性アッセイから決定された量)を加えて、10〜20 μg/mLのタンパク質の最終濃度に達します。抽出量が総量の10%以下であることを確認してください。
6. プレートをアルミホイルで包み(培地の蒸発を防ぐため)、30°Cおよび37°Cの静的インキュベーターを使用して48時間インキュベートします。
7. ボトルまたはディスペンサーを使用して、ウェルを滅菌水で2回洗浄し、室温で10〜15分間風乾させます。次に、100 μLの0.3%クリスタルバイオレット溶液を各ウェル(培地のみのコントロールウェルを含む)に加え、室温で10分間インキュベートします。
8. ウェルを滅菌水で3回徹底的に洗浄します(洗浄中にバイオフィルムが破壊されることはありません)。200 μLの100%エタノールを加え、RTで10分間インキュベートします。
9. 75 μLを新しい96ウェル平底プレートに移し、OD₅₅₀を読み取ります。バイオフィルム形成を(試料のOD550nm-ブランクの_OD550nm)として定量する。

Results

本明細書に記載されるワークフローは、C.ネオフォルマンスに対する潜在的な抗毒性特性を有する軟体動物からのタンパク質およびペプチドの単離を可能にする。同様に、さまざまな形態の抽出物(すなわち、粗抽出物および清澄化抽出物)を評価することで、潜在的な活性化合物の半精製が可能になり、下流の評価(質量分析ベースのプロテオミクスなど)がサポートされます。通常、タンパク質抽出ワークフローでは、タンパク質濃度が4〜8 mg/mLの均質化された溶液が生成されます。ここで、代表的な結果は、C.チネンシス抽出物の酵素活性および抗真菌特性の評価を実証する。粗抽出物と清澄抽出物は、サブチリシンA(C.ネオフォルマンスの病原性に関連する)のタンパク質分解活性を阻害することができ(図3)、_IC50値はそれぞれ5.3 μg/mLおよび4.53 μg/mLでした。C. chinensis抽出物の活性は、真菌増殖、カプセルおよびメラニン産生、ならびにバイオフィルムの形成を含む、C.ネオフォルマン...

Discussion

ここで説明する抽出プロトコルは、カナダのオンタリオ州から収集された軟体動物からの化合物の分離の概要を説明し、ヒト真菌病原体である C.neoformansに対して軟体動物抽出物を使用する新しい調査を示しています。このプロトコルは、無脊椎動物からのペプチダーゼ阻害剤活性を調査する研究の増加に追加されます¹³。抽出中、一部の抽出物サンプルは、おそらくフィルター膜を塞ぐ可溶性多糖類および/または色素の存在のために、フィルター滅菌が困難でした。この制限を克服するには、まず5 μmメンブレンでろ過して大きな化合物(細胞膜破壊、ゲノムDNAなど)を除外し、タンパク質をフィルターを通過させてから、0.22 μmメンブレンで再度ろ過することをお勧めします。これらのステップは、サンプルを汚染し、下流の実験を妨げる可能性のある微生物の存在を制限するため、プロトコルにとって重要です。

この調査中に、S8ファミリーのサチライシンのモデル酵素であるサチライシンAに対するペプチダーゼ阻害剤が検出されました。この酵素ファミリーのメンバーは生物間で...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm Filters	VWR	28145-477 (North America)
1.5 mL Tubes (Safe-Lock)	Eppendorf	0030120086
2 mL Tubes (Safe-Lock)	Eppendorf	0030120094
3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA)	Sigma-Aldrich	D9628-5G	CAS #: 59-92-7
96-well plates	Costar (Corning)	3370
Bulletブレンダー ストーム 24	NEXT ADVANCE	BBY24M
遠心分離機 5430R	エッペンドルフ	5428000010
キレックス 100 樹脂	BioRad	142-1253
CO2 インキュベーター (静的)	三洋電機	販売なし
Cryptococcus neoformans H99	ATCC	208821
DIC 顕微鏡	オリンパス
DIC 顕微鏡ソフトウェア	Zeiss
DMEM	Corning	10-013-CV
Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade)	BioShop	GLU501	CAS #: 50-99-7
Glycine	Fisher Chemical	G46-1	CAS #: 56-40-6
GraphPad Prism 9	Dotmatics
血球計算盤	VWR	15170-208
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
硫酸マグネシウム七水和物 (MgSO4.7 H2O)	Honeywell	M1880-500G	CAS #: 10034-99-8
ペプトン	BioShop	PEP403
ホソハ酸緩衝塩pH 7.4	BioShop	PBS408	SKU:PBS408.500
プレートリーダー(Synergy-H1)	BioTek(Agilent)	利用できません
リン酸カリウム一塩基性(KH2PO4)	Fisher Chemical	P285-500	CAS #:7778-77-0
Subtilisin A	Sigma-Aldrich	P4860	CAS #: 9014-01-01
サクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe-P-ニトロアニリド	Sigma-Aldrich	573462	CAS #: 70967-97-4
サーマルバス	VWR	76308-834
チアミン塩酸塩	フィッシャーバイオ試薬	BP892-100	CAS #: 67-03-8
酵母抽出	BioShop	YEX401	CAS #: 8013-01-2
酵母窒素塩基(アミノ酸を含む)	Sigma-Aldrich	Y1250-250G	YNB