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方法論記事

外傷性脳損傷後の成体ラットにおける優性服従行動の評価

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DOI:

10.3791/64548

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2022年12月16日

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1Division of Anesthesiology and Critical Care, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 2Department of Anesthesiology and Perioperative Medicine, Mayo Clinic, 3Department of Biochemistry and Physiology of the Faculty of Biology and Ecology, Oles Gonchar of the Dnipro National University, 4Department of Ophthalmology, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルは、流体パーカッション誘発性外傷性脳損傷のラットモデルを記載し、その後、支配的および従順な行動の発達を理解するための一連の行動試験を行う。この外傷性脳損傷のモデルを特定の行動テストと組み合わせて使用 することで、脳損傷後の社会的障害の研究が可能になります。

要約

食物、領土、配偶者などの資源をめぐる競争は、動物種内の関係に大きな影響を与え、しばしば支配的-従順な関係に基づく社会的階層を通じて仲介されます。支配的 - 従順な関係は、種の個体間の通常の行動パターンです。外傷性脳損傷は、社会的相互作用障害および動物ペアにおける支配的 - 従順な関係の再編成の頻繁な原因である。このプロトコルは、流体パーカッションモデルを使用した外傷性脳損傷の誘発後の成体雄Sprague-Dawleyラットの従順行動を、誘導後29日から33日の間に実施された一連の優性服従試験を通じてナイーブラートと比較した。優勢-従順行動テストは、脳損傷が食物を求めて競争する動物に服従行動をどのように誘発できるかを示しています。外傷性脳損傷の後、げっ歯類は、対照動物と比較して、フィーダーで過ごす時間が少なく、トラフに最初に到着する可能性が低いことから示されるように、より従順でした。このプロトコルによれば、従順な行動は、成体雄ラットにおける外傷性脳損傷後に発症する。

概要

種内競争は、同じ種のメンバーが同時に限られた資源をめぐって競争するときに発生します1。対照的に、種間競争は2つの異なる種のメンバー間で発生します2。種内競争は、干渉(適応)と搾取(競争)の2つのタイプに分けられ、食料や領土3など、競合する資源の種類に応じて発生します。

社会的階層の存在は、支配的 - 従順な関係(DSR)なしでは不可能です。支配は動物のペアの中で「勝つ」として現れ、従属は「負ける」として現れます4。ただし、DSR はペアだけでなく、3 つ以上のグループでも表示されます。1922年、Thorleif Schjelderup-Ebbeは家禽の優勢階層について説明しました。優勢動物と従属動物の主な区別の兆候は、フィーダーで過ごした時間と攻撃的な行動でした。優位性階層は、線形と非線形の2つの形式に分けられます5。線形優勢には、AとBの2つのグループが含まれます。推移的関係6 のこのパラダイムでは、グループ A がグループ B を支配するか、グループ B がグループ A を支配する。非線形ドミナンスは、A が B を支配し、B が C を支配、C がA 7 を支配する循環関係が少なくとも 1 つある場合に発生する。

優性-従順行動を評価するためのモデルは、げっ歯類、鳥類8、非ヒト霊長類9、10、11、およびヒト12を含むさまざまな種に対して存在します。優勢 - 従順法は文献によく表されており、躁病およびうつ病13、ならびに抗うつ薬活性14を評価するためのモデルとして適用されている。このモデルは、成体ラットにおける母体分離後の初期の生活ストレスを調査するために使用されています15。DSRパラダイムは、支配的行動モデル13,16の減少、従順行動モデル14の減少、および支配モデルのクロニジン逆転モデル17の3つのモデルに分けることができます。

本研究は、食料競争に基づく課題を通じてDSRの調査を実証する。この方法の利点は、その容易な再現性と、支配的 - 従順な行動を観察し正確に分析する能力である。さらに、支配的-従順な行動タスクは、同等の行動タスクとは異なり、領域ではなく食物に依存しているため、この行動タスクは低コストでシンプルになり、研究者はタスクを実行してデータを処理するために複雑なトレーニングを受ける必要はありません。

現在の研究の全体的な目標は、外傷性脳損傷(TBI)後のDSRの発症を実証することです。TBIは、社会的障害、うつ病、および不安に関連しています。TBIを誘導するモデルは、流体パーカッション装置18、19を用いて外傷性脳損傷を誘発することを含む単純で有効な標準モデルである。

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プロトコル

実験は、ヘルシンキと東京の宣言と欧州共同体の実験動物の世話と使用のためのガイドラインの勧告に従って行われたネゲブのベングリオン大学の動物管理委員会によって承認されました。本研究では、体重300〜350 gの成体の雄のSprague-Dawleyラットを使用しました。.動物を22°C±1°Cの室温および40%〜60%の湿度で明暗サイクルで飼育した。

1.動物の準備

  1. 無作為に30匹の成体オスラットを選択し、それらをTBIと偽の2つのグループに分けます。
  2. チャウチャウ( 材料表を参照)と水を 自由に提供します。
    注意: テストのすべての手順を同時に実行して、動作パフォーマンスに対する時刻の影響を制御します。一般的な活動による妨害を避けるために、午前中(午前6:00から午後12:00の間)に行動テストを実施するのが最善です。
  3. ステップ3および 表1に詳述されているように、両方のグループのラットにおいて損傷前の神経学的重症度スコアのベースライン評価を実施する。
  4. ラットを4%(誘導用)および1.5%(維持用)イソフルランで麻酔する。ブプレノルフィンを注射します(0.05-0.1 mg / kg;SC)先制鎮痛のための。
  5. 覚醒剤に反応して動きの欠如またはペダル反射をテストすることにより、ラットの固定を確認します。
    注:麻酔投与には、イソフルランの連続流が推奨されます。.

2.外科的処置

注意: すべての手順は無菌状態で実行する必要があります。滅菌手袋を使用してください。滅菌されていない表面に触れた場合は、手袋を交換してください。乾燥を防ぐために両目に点眼用潤滑剤を塗布します。傍矢状流体打楽器損傷は、以前に発表された報告18,20に従って実施されました。

  1. 0.5%ブピバカイン( 材料表を参照)で頭皮に浸潤させ、10 mmの切開を行い、組織を横方向に引っ込めます。
  2. 開頭術を行う18,20 ブレグマの後方4mm、側面4mm。
    注意: 手術部位は、ヨウ素ベースまたはクロルヘキシジンベースのスクラブとアルコールの両方で円を描くように数回消毒する必要があります。
  3. 流体パーカッション装置(材料表を参照)によってTBI18,19を3方向活栓を介して21〜23ミリ秒にわたって誘導します。
    注意: 振幅2.5気圧で中程度のTBIを実行します。
  4. 偽手術ラットのグループで開頭術を行います(図1)。偽手術グループにTBIを誘発しないでください。.
  5. 創傷を閉じる前に0.1%ブピバカイン浸潤を行う。イソフルランを撤回する前に、術後鎮痛として筋肉内ブプレノルフィン(0.01-0.05 mg / kg)を投与します。.
    注:ブプレノルフィンを12時間ごとに少なくとも48時間繰り返し投与します。.
  6. ラットを回復室に移し、その呼吸(例:.呼吸停止)、神経学的(例、麻痺)、および心血管状態(例:.、瞳孔の色の変化、軟部組織灌流の減少、徐脈)を24時間監視します。.

3.神経学的重症度スコアの評価

注:行動の変化と運動機能の最高スコアは24ポイントです。スコア0は無傷の神経学的状態を表し、スコア24は重度の神経機能障害21、22、23を表す(表1)。

  1. 手術前のTBIおよび偽ラット、手術後48時間(図2A)、および手術後28日目(図2B)に、前述の24の神経学的重症度スコア(NSS)を評価します。

4.支配的-従順な行動を研究する

  1. 試験の1週間前にラットをケージにランダムに分けます。
    注意: 各ケージには、1匹の偽手術ラットと1匹のTBIラットが含まれている必要があります。
  2. ラットがプロトコルに順応できるように、テストの前に2日間毎日15分のセッションを実行します。
    注:優勢-従順タスクは、損傷後29日目に開始されました(図1)。
  3. 細い15 cm x 15 cm x 60 cmのトンネル15,19,25で接続された2つの透明なアクリルガラスボックス(30 cm x 20 cm x 20 cm、ボックスAとボックスB、図3)で作られた装置(材料表を参照)を使用します。
  4. フィーダー(図3)に甘くしたミルクを入れ、トンネルの中央に置きます。10%の砂糖と3%の脂肪からなる牛乳を使用してください。
  5. 床から80 cmの高さのテーブルの上に装置を置きます。
  6. 最初の2日間の慣れのために、各ラットを装置に15分間入れます。2日慣れた後にタスクを開始します。
  7. 対照群から1匹、外傷性脳損傷(TBI)群から1匹のラットをランダムに選択し、フィーダーから等距離に設定して、5分間探索できるようにします。
  8. ラットが 自由に水にアクセスできるようにします。
    注: タスクは 5 日間続きました。食事制限は、タスク期間全体にわたって実行されました。試験期間後1時間、毎日餌を与えた。
  9. 他のラットでその後のテストを実行する前に、5%アルコールで機器を洗浄してください。
    注:装置を洗浄すると、以前のラットの臭いがなくなります。適切な空気循環のある部屋でテストを実行してください。

5.ビデオとデータ分析の記録

  1. カメラを配置し、推奨されるコンピューターソフトウェア( 材料表を参照)をインストールして、データをキャプチャ、保存、および処理します。
    注意: カメラは床から290cmの高さに設置する必要があります。
  2. ラットがアリーナにいる間にビデオを録画します。
    注意: カメラと装置は210cm離して配置しました。テストが実施されるアリーナの部分は、カメラフレームに表示されている必要があります。
  3. グループを盲検化した2人のアナリストによって手動でデータ分析23 を行う。

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結果

神経学的重症度スコア評価
神経学的欠損は、NSSを用いてTBI後の雄ラットにおいて評価された。ラットを2群に分けた:1群のTBI群と対照群1群。対照群を偽手術に供した。NSSは、ポイントシステム22,23による運動機能と行動の変化の評価を可能にしました。スコア24は重度の神経機能障害を示し、スコア0は無傷の神経学的状態を表した。手術前1時間時点の神経学的欠損に、TBI群と偽手術群の間で有意差はなかった。術後48時間での神経学的欠損は、偽手術ラットと比較してTBIラットにとって十分に大きかった(5-7、平均:6対0-0、平均:0;U = 0, p < 0.01, r = 0.89)(図2A)。 手術後28日目の時点で、TBI群と偽手術群の差はわずかであった(Mann-Whitney U検定19)(

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ディスカッション

臨床研究は、脳損傷が精神障害のリスクを高める可能性があることを示しています26,27。さらに、TBIは社会的行動の発達に影響を与えます28,29。このプロトコルでは、TBIモデルは支配的-従順な行動の提示に影響を与えました。支配的 - 従順な行動は、フィーダーに費やされた時間と誰が最初にフィーダーに来たかという点で現れました。

ここで実行される行動タスクに加えて、居住者と服従の関係を評価するための他のタスク、たとえば居住者と侵入者のパラダイム30,31または食糧状況32,33,34の複雑なダイビングが存在します。

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開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

行われた研究は、ドミトリー・フランクの博士論文の一部です。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
70%アルコール溶液中の2%クロルヘキシジンシグマ-ALDRICH500 cc手術室の皮膚の一般的な消毒のために
の異なる4つのボード(1.5 cm、2.5 cm、5 cm、8.5 cm)これは神経学的欠陥
4-0 ナイロン縫合糸4-00
ボトルテクニプラストACBT0262SU
ブピバカイン0.1 %
ダイヤモンド穴鋸ドリル 3 mm径ガラス穴鋸キットオプション
デジタル体重計SIGMA - ALDRICHRs 4,000
解剖ハサミSIGMA - ALDRICHZ265969
エタノール 99.9 %薬局機器の洗浄と臭気の除去に使用される 5%-10% 溶液
大学のワークショップ流体パーカッション装置特定のブランドは推奨されません。
ガーゼスポンジフィッシャー
グローブ(薄い実験用手袋)オプション。
温度計付きヒーターHeatingpad-1モデル:HEATINGPAD-1/2特定のブランドはお勧めしません。
Horizon-XLMennen Medical Ltd
イソフルラン、USP 100%Piramamal Critical Care, IncNDC 66794-017吸入用麻酔液
ロジクール ウェブカメラソフトウェアロジクール2.51ビデオカメラ用ソフトウェア
手術鉗子SIGMA - ALDRICH
手術用ハサミSIGMA - ALDRICH
USV記録およびデータ分析用のPCコンピューターIntelIntel Core i5-6500 CPU @ 3.2GHz、16 GB RAM、64ビットオペレーティングシステム
狭い通路2つの透明な30 cm× 20 cmの狭い15 cmの20 cmのプレキシガラスボックス; 15 cm× 60 cm
Purina ChowPurina5001ラットに与えられたげっ歯類の実験室用チャウ、 生物医学研究で使用されてきたライフサイクルの栄養物です
ラットケージ(ラットの家のケージまたは別のエンクロージャ)Techniplast2000P特定のブランドは推奨されません
メスブレード 11SIGMA - ALDRICHS2771
SPSSSPSS Inc., Chicago, IL, USAA 20パッケージ
脳定位固定装置大学のワークショップでカスタムメイド特定のブランドは推奨されません
タイミングデバイスインターバルタイマー:USVを記録するためのタイミングはオプションです。複数のラットをくすぐっている場合はインターバルタイマーを使用すると便利ですが、どのタイマーでもかまいません
ビデオカメラLogitechC920 HD PRO ウェブカメラデジタルビデオカメラ 支配的な従順なテストの下でのラットの行動を高解像度で記録します
厚さを評価することですでカスタムメイドされたで接続されたプレキシガラスボックス 通路 器具

参考文献

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