Method Article

イメージングフローサイトメトリーと人工知能を用いた小核アッセイの自動化

DOI:

10.3791/64549

⸱

January 27th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Amnis Flow Cytometry, Luminex Corporation

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

小核(MN)アッセイは、DNA損傷を定量化するための確立されたテストです。ただし、手動顕微鏡や特徴ベースの画像分析などの従来の手法を使用してアッセイをスコアリングすることは、面倒で困難です。この論文では、イメージングフローサイトメトリーデータを使用してMNアッセイをスコアリングするための人工知能モデルを開発する方法論について説明します。

Abstract

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小核(MN)アッセイは、化学物質の遺伝毒性を評価するために世界中の規制機関によって使用されています。アッセイは2つの方法で実施することができる:一度分裂した、細胞質分裂がブロックされた二核細胞または完全に分裂した単核細胞におけるMNをスコアリングすることによって。歴史的に、光学顕微鏡はアッセイをスコアリングするためのゴールドスタンダードの方法でしたが、それは面倒で主観的です。フローサイトメトリーは、近年、アッセイのスコアリングに使用されていますが、細胞画像の重要な側面を視覚的に確認できないため、制限されています。イメージングフローサイトメトリー(IFC)は、ハイスループット画像キャプチャと自動画像解析を組み合わせたもので、MNアッセイのすべての重要なイベントの画像を迅速に取得し、スコアリングするために成功裏に適用されています。最近、畳み込みニューラルネットワークに基づく人工知能(AI)手法を使用して、IFCが取得したMNアッセイデータをスコアリングできることが実証されました。このホワイトペーパーでは、AIソフトウェアを使用してディープラーニングモデルを作成し、すべての主要なイベントをスコアリングし、このモデルを適用して追加データを自動的にスコアリングするためのすべての手順について説明します。AIディープラーニングモデルの結果は、手動顕微鏡と比較して優れているため、IFCとAIを組み合わせることでMNアッセイの完全に自動化されたスコアリングが可能になります。

Introduction

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小核(MN)アッセイは、ヒト用の化粧品、医薬品、および化学物質の開発におけるDNA損傷を評価するための遺伝毒物学の基本です1,2,3,4。小核は、分裂後に核に取り込まれず、核とは別の小さな円形体に凝縮する染色体全体または染色体断片から形成されます。したがって、MNは、遺伝毒性試験1におけるDNA損傷を定量するためのエンドポイントとして使用できます。

MNを定量するための好ましい方法は、サイトカラシン-B(Cyt-B)を用いて分裂をブロックすることによって一回分裂した二核細胞(BNC)内である。このバージョンのアッセイでは、細胞毒性は、単核(MONO)および多核(POLY)細胞のスコアリングによっても評価されます。このアッセイは、ブロックされていないMONO細胞におけるMNをスコアリングすることによっても実行することができ、これはより速く、より簡単にスコアリングすることができ、増殖を評価するために曝露前および曝露後の細胞カウントを使用して細胞毒性を評価する5,6....

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Protocol

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1. イメージングフローサイトメトリーを用いたデータ取得

注:Rodrigues et al.16 を参照し、次の変更を加えて、IFCを使用する取得領域を最適な画像キャプチャのために変更する必要があるかもしれないことに注意してください。

  1. Non-Cyt-B法の場合は、培養直前および回収期間直後の各培養液について、製造元の説明書( 材料表参照)に従って市販のセルカウンターを用いて細胞カウントを行います。
  2. シングルカメライメージングフローサイトメーターでサンプルを実行する場合は、明視野(BF)をチャンネル4に配置します。M01 を M04 に、M07 を M01 に置き換えます。
    注意: 「M」はIFCのカメラチャンネルを指します。
  3. 集録時には40倍の倍率を使用してください。
  4. 集録時のBF面積対BFアスペクト比プロットで、次の領域座標を使用します。
    X座標:100と900。Y 座標: 0.7 および 1 (Cyt-B 法)
    X座標:100と600。Y 座標: 0.7 お....

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Results

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図1は、AIソフトウェアを使用してMNアッセイのモデルを作成するためのワークフローを示しています。ユーザーは、目的の.dafファイルをAIソフトウェアにロードし、AI支援クラスター(図2)と予測(図3)タグ付けアルゴリズムを使用して、オブジェクトをグラウンドトゥルースモデルクラスに割り当てます。すべてのグラウンドトゥルースモデルクラスに十分なオブジェクトが入力されたら、RFまたはCNNアルゴリズムを使用してモデルをトレーニングできます。トレーニング後、クラス分布ヒストグラム、精度統計、対話型の混同行列などのツールを使用してモデルのパフォーマンスを評価できます(図4)。AIソフトウェアの結果画面から、ユーザーはワークフローのトレーニング部分に戻ってグラウンドトゥルースデータを強化するか、十分な精度が達成された場合、ユーザーはモデルを使用して追加のデータを分類できます。

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Discussion

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ここで紹介する研究では、MNアッセイのスコアリングを自動化するためのディープラーニングアルゴリズムの使用について説明しています。最近のいくつかの出版物は、直感的でインタラクティブなツールが、深い計算知識を必要とせずに画像データを分析するための深層学習モデルの作成を可能にすることを示しています18,19。ユーザーインターフェイス駆動型ソフトウェアパッケージを使用してこの作業で説明されているプロトコルは、非常に大きなデータファイルでうまく機能し、ディープラーニングモデルを簡単に作成できるように設計されています。AIソフトウェアパッケージでRFおよびCNNモデルを作成およびトレーニングするために必要なすべてのステップについて説明し、アッセイのCyt-Bバージョンと非Cyt-Bバージョンの両方ですべての重要なイベントの高精度な識別と定量化を可能にします。最後に、これらのディープラーニングモデルを使用して追加データを分類し、化学的細胞毒性とMN頻度を評価する手順について説明します。

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Disclosures

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著者らは、ImageStreamイメージングフローサイトメーターと本研究で使用したAmnis AIソフトウェアのメーカーであるDiaSorin CompanyであるLuminex Corporationに雇用されています。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL遠心チューブファルコン352096
クレンザー - コールタークレンツ ベックマン・コールター8546931容器に200mLのクレンザーを充填します。  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/
1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
ColchicineMilliporeSigma64-86-8
コーニング ボトルトップ真空フィルター ミリポアシグマCLS4307690.22 & マイクロ;m フィルター、500 mL ボトル
サイトカラシン Bミリポアシグマ14930-96-25 mg ボトル
デバプラー - 70% イソプロパノールミリポアシグマ1.3704容器に 200 mL のデバプラーを充填します。  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
ジメチルスルホキシド (DMSO)ミリポアシグマ67-68-5
ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水 1XEMD ミリポアBSS-1006-BPBS Ca++MG++ 無料 
ウシ胎児血清HyCloneSH30071.03
ホルムアルデヒド 10%、メタノールフリー Ultra PurePolysciences, Inc.04018これが4%と1%のホルマリンに使用されているものです。注意:ホルマリン/ホルムアルデヒドは、吸入および飲み込むと有毒です。 目、呼吸器系、皮膚に刺激を与えます。 吸入や皮膚接触により感作性を引き起こす可能性があります。目に重大な損傷を与える恐れがあります。 潜在的ながんの危険性があります。 http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Guava Muse Cell AnalyzerLuminex0500-3115標準構成のGuava Muse Cell Analyzerを使用しました。
Hoechst 33342Thermo FisherH357010 mg/mL solution
MannitolMilliporeSigma69-65-8
MEM Non-Essential Amino Acids 100XHyCloneSH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark IILuminex, a DiaSorin company100220405 nm、488 nm、642 nm レーザーを搭載した 2 台のカメラ ImageStreamX Mark II を使用しました。
MIFC解析ソフトウェア - IDEASLuminex, a DiaSorin company100220"画像解析ソフトウェア"
MIFC (ImageStreamX MKII)のコンパニオンソフトウェアMIFC
software - INSPIRELuminex, a DiaSorin社100220"Image acquisition software"
これは、MIFC(ImageStreamX MKII)を実行するソフトウェアです
Amnis AIソフトウェアLuminex、DiaIsorinの会社100221「AIソフトウェア」
これは、データを分析するための人工知能モデルの作成を可能にするソフトウェアです
マイトマイシン Cミリポアシグマ50-07-7
NEAA 混合物 100xロンザ バイオウィテカー13-114E
ペニクリン/ストレプトマイシン/グルタミン溶液 100XGibco15070063
塩化カリウム (KCl)MilliporeSigmaP9541
リンス - 超純水または脱イオン水NANA 超純水または脱イオン水を使用してください。 容器に900mLのリンスを入れます。
RNaseMilliporeSigma9001-99-4
RPMI-1640 Medium 1xHyCloneSH30027.01
シース - PBSMilliporeSigmaBSS-1006-Bこれはダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 1x Ca++MG++無料 容器に900mLのシースを入れます。
滅菌水HyCloneSH30529.01
滅菌器 - 0.4%–0.7% 次亜塩素酸VWRJT9416-1これは、クロロックス漂白剤を水で溶出させることによって作ることができる 10% クロロックス漂白剤です。 容器に200mLの滅菌器を入れます。
T25フラスコファルコン353109
T75フラスコファルコン353136
TK6細胞ミリポアシグマ95111735

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
  2. OECD. Test No. 487: In Vitro Mammalian Cel....

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Micronucleus AssayImaging Flow CytometryArtificial IntelligenceConvolutional Neural NetworkGenetic ToxicityAutomated Image AnalysisDeep Learning ModelCell Morphology ClassificationGenotoxicity ScreeningMononucleated Cells

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